Abstract
Actualmente hay muchas herramientas químicas disponibles para introducir sondas químicas a las proteínas para estudiar su estructura y función. Un método útil es la conjugación de proteínas genéticamente mediante la introducción de un aminoácido no natural que contiene un grupo funcional bioorthogonal. Este informe describe un protocolo detallado para la conjugación de anticuerpo específico del sitio. El protocolo incluye detalles experimentales para la incorporación genética de un aminoácido que contiene azida-, y la reacción de conjugación por cicloadición de azida-alquino cepa promovido (SPAAC). Esta reacción cepa promovido procede por simple mezcla de las moléculas que reaccionan a pH y temperatura fisiológica, y no requiere reactivos adicionales, tales como iones de cobre (I) y ligandos quelantes de cobre. Por lo tanto, este método sería útil para la conjugación de proteínas en general y el desarrollo de conjugados de fármacos de anticuerpos (ADC).
Introduction
Desde que se informó de la incorporación genética de -methoxyphenylalanine p en Escherichia coli, 1 más de 100 aminoácidos no naturales (UAAs) se han incorporado con éxito en varias proteínas. 1-3 Entre estos UAAs, los aminoácidos que contienen grupos funcionales bioorthogonal han sido ampliamente estudiados y representan la proporción más grande. Los grupos funcionales bioorthogonal utilizados en los UAAs incluyen cetona, 4 azida, 5 alquino, 6 cyclooctyne, 7 tetrazina, 8 α, β-insaturados amida, 9 norboneno, 10 transcyclooctene, 11 y biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 A pesar de que cada grupo funcional tiene sus ventajas y desventajas, los aminoácidos que contienen azida se han utilizado más ampliamente para la conjugación de la proteína. p -Azidophenylalanine (AF), uno de los aminoácidos que contienen azido-, está fácilmente disponible, y su incorporación efficiency es excelente. Las proteínas mutantes que contienen este aminoácido se pueden hacer reaccionar con alquinos de cicloadición catalizada con cobre o con cyclooctynes por SPAAC. 12-20
Recientemente, los productos biofarmacéuticos han estado atrayendo una gran atención en la industria farmacéutica. El conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) es una clase de anticuerpos terapéuticos que son ventajosos debido a su capacidad para la terapia dirigida para el tratamiento de cánceres humanos 21 y otras enfermedades. Más de 50 ADC están actualmente en ensayos clínicos, y el número está aumentando rápidamente. En el desarrollo de ADCs, muchos factores necesitan ser considerados para maximizar la eficacia y minimizar los efectos secundarios. Entre estos factores, una reacción de conjugación eficaz y específica de sitio para formar un enlace covalente entre un anticuerpo y un fármaco es crítica. La eficiencia deseada y especificidad en la reacción de conjugación se puede lograr mediante conjugación con un grupo funcional en un bioorthogonalno natural de aminoácidos que se incorpora específicamente en un anticuerpo. 22-26 Aquí, se presenta un protocolo para incorporar específicamente en el sitio AF en un fragmento de anticuerpo y el conjugado del fragmento de anticuerpo mutante con una sonda de bioquímica.
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Protocol
1. Construcción del plásmido
- Construir un plásmido de expresión (pBAD-HerFab-L177TAG) que exprese el gen del anticuerpo diana (pBAD-HerFab-WT) con un 6-Su etiqueta, y sustituir el codón para leucina-177 con el codón ámbar (TAG) 27, utilizando técnica de mutagénesis dirigida al sitio convencional.
Véase la Tabla de Materiales. - Construir otro plásmido de expresión (pEVOL-AFRS) que contiene los genes para el evolucionado tRNA Tyr y aminoacil-tRNA sintetasa par (aaRs). Utilice el vector plásmido especialmente diseñado, pEVOL, para su incorporación eficiente de UAAs. Los protocolos detallados de información y plásmido de clonación se describen en el informe anterior. 28
- Obtener ADN plásmido de alta calidad mediante el uso de kits de preparación de plásmidos disponibles comercialmente. La relación 260/280 de ~ 1,8 es óptimo para el ADN purificado. Si es necesario, llevar a cabo la electroforesis en gel de agarosa al 1% para comprobar la pureza de la DNA.
- La electroporación
- Añadir cada ADN 1 l de pEVOL-AFRS 28 y pBAD-HerFab-L177TAG a 20 l cepa de Escherichia coli DH10β. Mezclar con cuidado, usando una pipeta. Los plásmidos se pueden transformar juntos o en reacciones independientes.
- Para cubetas de 0,1 cm, establecer la configuración de electroporación a 25 mF y 2,5 kV.
- Insertar la cubeta en el portaobjetos de la cámara impactante. Empuje la corredera en la cámara hasta que la cubeta haga contacto con los electrodos de la cámara.
- Pulso vez pulsando el botón de pulso hasta que la máquina emite un pitido electroporación.
- Añadir 1 ml de caldo súper óptima con represión catabólica (SOC) medio que contiene 2% (w / v) triptona, 0.5% (w / v) de extracto de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, 10 mM MgCl 2, y glucosa 20 mM a la cubeta de forma rápida y transferir la mezcla a un tubo de ensayo. Se incuban las células durante 1 hora a 37 ° C con agitación.
- Spread transformado células de E. coli en caldo de Lisogenia (LB) placas de agar que contenían los antibióticos apropiados (35 mg / ml de cloranfenicol y 100 mg / ml de ampicilina para la selección de pEVOL-AFRS y pBAD-HerFab-L177TAG, respectivamente). Las placas se incuban a 37 ° C durante 12 h.
- preparación de cultivo
- Se inocula una sola colonia transformada en medio que contiene 5 ml de LB antibióticos. Incubar durante 12 horas a 37 ° C con agitación.
3. Expresión y purificación de HerFab-L177AF
- Expresión de HerFab-L177AF
- Transferir el cultivo primario (5 ml) en 200 ml de LB medio que contiene ampicilina (100 mg / ml) y AF (1 mM), seguido de incubación a 37 ° C con agitación.
NOTA: mM AF 100 solución madre (10 ml) se preparó disolviendo 206 mg AF en 100 mM de ácido clorhídrico (10 ml, el volumen final). - Añadir 2 ml de 1,6 M arabinosa (16mM concentración final) cuando el cultivo alcanzó la fase logarítmica (DO550 = 0,8, DO = densidad óptica). Incubar durante 12 horas a 30 ° C con agitación.
- Cosecha células por centrifugación a 11.000 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y congelar el sedimento a -20 ° C.
- Transferir el cultivo primario (5 ml) en 200 ml de LB medio que contiene ampicilina (100 mg / ml) y AF (1 mM), seguido de incubación a 37 ° C con agitación.
- Lisis celular
- Resuspender los sedimentos celulares en 20 ml de tampón de lisis que contiene 30 mM periplásmico Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, 20% de sacarosa, y 0,2 mg / ml de lisozima, y se incuba la mezcla durante 1 h a 37 ° C.
- Centrifugar el lisado de células a 18.000 xga 4 ° C durante 15 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y desechar el sedimento.
- Cromatografía de afinidad Ni-NTA
- Añadir suspensión de resina Ni-NTA a cada tubo de centrífuga (400 l de resina para una cultura 200 ml), y se mezcla suavemente a 4 ° C durante 1 h.
- Se vierte la suspensión en una columna de polipropileno y lavar la resina tres veces con 5 ml de lavado buffer que contiene 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), imidazol 20 mM, y NaCl 300 mM.
- Eluir el anticuerpo diana con tampón de elución 300 l que contiene mM NaH 2 PO 4 50 (pH 8,0), imidazol 250 mM, y NaCl 300 mM.
- Determinar la concentración de la proteína mutante por ensayo de proteínas de Bradford 29 o mediante la medición de la absorbancia a 280 nm. Calcular el coeficiente de extinción (75.866 M -1 cm -1) para HerFab-L177AF a 280 nm mediante la calculadora coeficiente de extinción de proteínas utilizando el coeficiente de extinción (2.471 M -1 cm -1) para la FA.
NOTA: La secuencia de aminoácidos de HerFab se puede encontrar en el sitio web de NCBI (GI: 783 282 791 y GI: 783282792).
4. La conjugación de Purificada HerFab-L177AF con Acetileno Sondas Uso de cicloadición de azida-alquino Strain-promovido (SPAAC)
- Añadir 20 l de Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-Adibo) en H2O (20081; M concentración final) a una solución de 10 l de HerFab-L177AF (10 mM de concentración final) en tampón de fosfato que contiene 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) y NaCl 100 mM.
NOTA: Como alternativas, cyclooctyne difluorado (DIFO) y biciclo [6.1.0] derivados nonino (BCN) también están disponibles para la misma aplicación. - Deje que la reacción de cicloadición cepa ascendido a proceder durante 6 horas a 37 ° C. Si se utiliza una sonda sensible a la luz (por ejemplo, Cy5.5), cubra el recipiente de reacción con papel de aluminio.
- Se purifica el HerFab etiquetados de acuerdo con el paso 5.
5. Purificación de HerFab Etiquetada
- Añadir 500 l de muestra a una columna de filtro giratorio centrífugo.
- Se centrifuga la columna de centrifugación a 14.000 xga 4 ° C durante 15 minutos.
- Descarte el filtrado y la transferencia purificados muestra de la columna de centrifugación a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Como una alternativa al paso de 5.1 5.3, realice Purificación por diálisis contra el mismo tampón.
- Almacenar el HerFab marcada purificada a 4 ° C.
6. SDS-PAGE análisis de HerFab Etiquetada
- Añadir 5 l LDS tampón de muestra de proteína que contiene 106 mM de Tris · HCl, mM de base 141 Tris (pH 8.5), 2% LDS, 10% de glicerol, EDTA mM 0,51, 0,22 mM SERVA azul G250, y fenol 0,175 mM roja a 13 l de purificado marcado HerFab (7,8 M o 0,38 mg / ml) en presencia (+) o ausencia (-) de 2 l de ditiotreitol (DTT, 100 mM de concentración final). Incubar la mezcla a 95 ° C durante 10 min.
- Una el Bis-Tris casete de gel de SDS-PAGE al 4-12% a la celda de electroforesis y añadir tampón de desarrollo. Cargar las muestras de proteínas conjugadas y el marcador de peso molecular pre-manchada. Realizar electroforesis en gel durante 35 minutos a 200 V.
Nota: Mantenga la celda de electroforesis en la oscuridad durante todo el período de minimizar foto-blanqueo del fluoróforo. - Después de la electroforesis, la transferencia deel gel a un escáner gel fluorescente, y escanear de emisión de fluorescencia a la longitud de onda apropiada. Para Cy5.5, utilice el modo de Cy5 en el software del escáner.
- Tinción del gel con una tinción de proteínas comercial.
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Representative Results
En este estudio, un fragmento de anticuerpo era específicamente en el sitio conjugado con un fluoróforo mediante la incorporación de un aminoácido que contiene azida-en el fragmento y hacer reaccionar el fragmento de anticuerpo mutante con un cyclooctyne tensa (Figura 1). HerFab fue seleccionado como el fragmento de anticuerpo de destino en la que la FA fue incorporado como un aminoácido que contiene azida. Para elegir el residuo en HerFab para la sustitución con FA, se analizó la estructura cristalina de rayos X del HerFab. 30 requisitos importantes para el residuo incluyen una distancia suficiente desde el sitio de unión del anticuerpo para reducir al mínimo la disminución de su afinidad de unión y la accesibilidad de disolvente para la reacción de conjugación eficiente. Leucina en la posición 177 era un candidato decente porque el residuo es bien expuesto al exterior del anticuerpo y situado cerca de la interfaz de dos dominios de inmunoglobulina, que es distante del sitio de unión del anticuerpo.
contenido "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Inicialmente, se construyó el plásmido de expresión para HerFab con un C-terminal 6-Su etiqueta, y un codón ámbar se introdujo en la posición 177 de la FA incorporación por sitio mutagénesis -dirigida. el HerFab mutante que contiene AF se expresó en presencia de AF 1 mM por la co-expresión de la pareja de ARNt sintetasa Tyr y aminoacil-tRNA evolucionado. 27 Ni-NTA purificación por afinidad se realizó para las proteínas mutantes expresadas en presencia y ausencia de AF, y el siguiente análisis SDS-PAGE mostró que el fragmento de anticuerpo de longitud completa se obtuvo sólo en la presencia de AF (Figura 2). a continuación, se evaluó el fragmento de anticuerpo mutante que contiene AF para la reacción de conjugación con una Cy5.5 (Cy5.5-Adibo). el fragmento de anticuerpo y Cy5.5-Adibo se hicieron reaccionar derivado aza-dibenzocyclooctyne -vinculada en un tampón de fosfato de 6 h, y la mezcla de reacción se analizó mediante SDS-PAGE en presencia (+) y ausencia (-) De DTT (Figura 3a). 25 La reacción con un fragmento de anticuerpo de tipo salvaje también se llevó a cabo y se analizó como control. Las imágenes de fluorescencia mostraron claramente la conjugación del fragmento de anticuerpo mutante con Cy5.5-Adibo, mientras que no se observó conjugación en la reacción con el fragmento de tipo salvaje. Análisis Electron ionización de espectrometría de masas (ESI-MS) mostró conjugación cuantitativa con ningún fragmento no conjugado detectable (Figura 3b). En general, estos resultados mostraron que la HerFab mutante que contiene AF puede ser eficiente y conveniente conjugado con cyclooctynes tensas por SPAAC sin ningún reactivo adicional.
Figura 1: Ilustración esquemática de etiquetado de anticuerpos específica de sitio por SPAAC.blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Expresión de HerFab mutante que contiene AF en la posición 177 (L177) en presencia de la evolucionado par tRNA / aaRs. La expresión de HerFab-L177AF en medio LB que contiene el par evolucionado ARNt / AFRS y AF 1 mM. muestras purificadas se analizaron por SDS-PAGE en presencia (+) o ausencia (-) de la TDT, y el gel se tiñó con una mancha de proteína comercial. Figura adaptada de Ko, W. et al. 27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Conjugación reaccionarion de HerFab-L177AF con Cy5.5-Adibo. (A) análisis de SDS-PAGE de la reacción de conjugación de tipo salvaje y HerFab HerFab-L177AF con Cy5.5-Adibo. Las mezclas de reacción se analizaron en presencia (+) y ausencia (-) de la TDT, y bandas de proteínas se visualizaron mediante una tinción de proteínas comercial (izquierda) y de imágenes de fluorescencia (derecha). (B) el análisis de HerFab-L177AF (izquierda) y HerFab-L177AF marcado con Cy5.5-Adibo (derecha) ESI-MS: diferencia entre la masa esperada HerFab- L177AF y el anticuerpo conjugado = 1.190 Da, observó diferencia de masa = 1.190 Da . Figura adaptada de Ko, W. et al. 27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La incorporación genética de aminoácidos no naturales en proteínas tiene varias ventajas sobre otros métodos utilizados para la modificación de proteínas. 1-3 Una de las ventajas importantes es su aplicabilidad general a cualquier tipo de proteína. En principio, no hay limitación en la selección de una proteína diana y un sitio diana de la proteína. Sin embargo, la sustitución de un residuo importante estructural o funcionalmente con un UAA puede dar lugar a la alteración de la estructura y función de la proteína diana. En general, los residuos que están expuestos al disolvente y no interactúan con otros residuos son elegidos para la incorporación de UAAs. Por lo tanto, la información estructural de una estructura de cristal de alta resolución se utiliza con el fin de elegir los sitios óptimos para la incorporación UAA. 30 Debido a que la incorporación de UAAs es técnicamente fácil y requiere una mutagénesis simple, varios sitios se pueden seleccionar fácilmente para seleccionar un residuo óptimo para una función deseada de una proteína diana. </ P>
En este protocolo, AF se incorpora genéticamente en un fragmento de anticuerpo, y el fragmento mutante es específicamente en el sitio marcado con un fluoróforo, utilizando SPAAC. El rendimiento de conjugación de este método es cuantitativo sin ninguna reacción no deseada, que es una mejora importante sobre el informe anterior. 25 Esto se logró mediante análisis estructural cuidado para la selección de un sitio óptimo y un aumento en el tiempo de reacción. Por lo tanto, la elección del sitio para UAA incorporación es crítica para la conjugación rápido y cuantitativo. Además, el uso de sistemas de UAA eficaz incorporación (por ejemplo, pEvol-AFRS) también es fundamental para la producción de proteína y eficiencia de incorporación. 28
Otros UAAs incorporados en proteínas por el método de incorporación genética para la conjugación de proteínas también se pueden utilizar para la conjugación de anticuerpos. 4-11 En términos de velocidad de reacción, la reacción de cicloadición catalizada por cobre,así como inversa de electrones demanda reacción de Diels-Alder usando tetrazinas 8 y alquenos o alquinos tensas, 7 será mejor que la SPAAC utilizado en este estudio. Sin embargo, la reacción de cicloadición catalizada por cobre requiere cobre iónico (I) y los ligandos, 31 y los aminoácidos para la reacción de Diels-Alder son a menudo sintéticamente un reto, y no lo suficientemente estable como para la conjugación cuantitativo. Cetonas-hidroxiamina condensación 4 también se puede utilizar para el mismo fin. Sin embargo, requiere condiciones moderadamente ácidas, y su velocidad de reacción es más lenta que la de la SPAAC. Teniendo en cuenta los factores como la accesibilidad comercial y sintética de aminoácidos no naturales, la velocidad de reacción, bio-ortogonalidad, la biocompatibilidad de condiciones de reacción, y eficacia de incorporación de aminoácidos no naturales, el método de usar SPAAC y genéticamente Incorporated AF sería útil para el desarrollo modificado proteínas terapéuticas tales como ADCs, así como para el generaletiquetado de proteínas.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500 g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| 2. Culture Preparation | |||
| 2.1 Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25 g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25 g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500 g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100 mL |
| 3. Expression and Purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1 g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100 g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500 mL |
| 3.2 Cell Lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500 g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1 kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500 g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1 g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25 mL |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1 mL capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1 kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1 kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1 kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1 mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500 μL capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Sigma | 10708984001 | 10 g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x | Thermofisher | NP0007 | 10 mL |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500 mL |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12-well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25 g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences | ||
References
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