Summary
我们提出了以振幅调制（轻敲模式）在液体原子力显微镜实现亚纳米分辨率的图像的方法。该方法被证明在商业原子力显微镜。我们解释的理由背后我们的参数选择，并提出解决的优化策略。
Introduction
因为它的发明中，三十年前，原子力显微镜（AFM）1已经确立了自己选择的技术用于在纳米调查样品，特别是在平均超过宏观表面区域是不可能的，并且需要本地信息。在典型的AFM测定，柔性悬臂的偏转来量化一个小数目的分子和安装在悬臂的端部的的UltraSharp尖之间的相互作用力。取决于相互作用所考虑的类型和时间尺度，种类繁多的信息可以被获得，包括软生物膜2,3的粘弹特性，单一的化学的强度或分子键4,5，a的原子论细节表面6 - 8，9磁，电容10，进行11，12,13的热和化学14个样品的性能
在实践中，然而，在高于环境的其他条件下运行的原子力显微镜可以是具有挑战性，许多已发表的结果是在空气中仍然获得。一个附加的困难来自事实，即它通常是必要的，以便避免大的摩擦力以保持两个针尖和样品操作在动态模式（振动尖端）的原子力显微镜。虽然越来越多的挑战性，动态操作原则上可以提供有关分析的样品更多的信息，没有空间分辨率的损失。在过去的十年中，动态原子力显微镜在液体中的领域出现的重要发展，从视频速率的AFM 21的到来- 23，以多频测量
在AFM，可实现对一个特定测量的最高空间分辨率取决于AFM本身的质量和T的性质他互动探讨20,47,48。目前，最高端的，市售的原子力显微镜目前的噪音水平是接近的热限制12所以分辨率的决定因素通常是针尖-样品的相互作用。这实际上是这种相互作用决定决议的空间梯度：基于短距离，迅速衰减的测量相互作用产生比长时程作用在作怪更高的分辨率结果。在液体中，溶剂化力可以提高成像分辨率，因为它们趋向于消失在液体中只有几个分子直径（通常<1纳米）移动从样品49的表面离开时。这些力从液体分子和样品表面之间的相互作用产生。与用于表面具有强亲和力的液体将趋于更有序的并且比在与样品29,42,50接口散装液体移动较少。结果是，这将需要更多的能量振动针尖取代界面液体分子比散装液体42，使测量的纳米级-the溶剂化景观局部变化高度敏感的界面液体性质。
以利用溶剂化力，几个实际问题需要考虑。首先，尖端的振幅必须比得上溶剂化力的范围，典型地<1纳米。第二，所使用的液体必须形成在样品的表面上的良好定义的溶剂化景观。宏观上，这相当于要求所考虑的样品“润湿”的液体。例如，在水是更容易实现上比在疏水石墨42,51亲水云母分子水平分辨率。最后，该悬臂支撑尖端的弹簧常数必须适当52,53选择。当这些工作CONditions，原子力显微镜不仅提供接口的分子水平的图像，但它也导出了可以用于获得关于样品的表面54的化学信息的本地采样液体亲合性的信息。
对于AFM操作中最常见的动态模式中的液体是幅度调制（AM，也'轻敲模式'）AFM和频率调制（FM）的AFM。在第一种情况55中 ，而它的振动振幅是由反馈环路不断地重新调整针尖-样品的距离保持恒定的前端光栅扫描样品。样品的表面形态图像从由反馈环施加的校正而获得。在FM-AFM 28,41,56，它是悬臂/尖端而尖端扫描样品被保持恒定的振荡频率。这两种技术提供液体36,57可比的地形分辨率。针尖 - 样品的相互作用的定量更趋于straightforward和在FM-AFM准确，但AM-AFM是更容易实现，更坚固，并允许与较软的悬臂，一些用于研究容易变形或精巧样品有用工作。显著AM-AFM是AFM用户之间更广泛，部分原因是由于历史原因，而且由于这样的事实，这是技术上更容易控制。
虽然幅度保持由AM-AFM成像期间的反馈环路常数，尖端振荡和驱动振荡之间的相位滞后被允许自由改变。相位滞后可以提供关于针尖-样品的相互作用的有用信息，而与在与样品58的界面处的尖端的振荡期间消耗的能量。因此相成像可以同时获取到地形成像，并且常常在突出一个样品表面的异质性互补。相成像已经被用于各种地图互动的，包括二附着能量42，粘弹性58和接口44的水化景观的矩形映射。
实际上，在液体获得高分辨率图像，由于大量的参数来控制，并且不存在，在每一个情况下工作的简单的，系统的协议的保持不平凡的。图像质量通常取决于悬臂的几何形状和弹性，尖端化学，振幅，和样品刚性，等等55。原子力显微镜测量也根据定义，微扰到系统中。其结果是，改变成像变量和环境条件没有适当考虑可导致再现性和/或虚假陈述观测和假结果的困难。
这里，我们提出我们的用于实现溶液软硬样品的高分辨率图像协议，使用在AMPL操作商业仪器itude调制。我们的目标是提供一个实用的程序为优化可能随不同样品来影响分辨率的主要参数，在每种情况下解释用于提供从成像过程的基本的物理原理的选择的基本原理。我们详细介绍了一步一步的做法，从基板清洗和准备，要选择悬臂，调整成像参数，并解决常见的问题。后面解释我们的选择和程序的科学原理进行高分辨率应该有助于适应的方法时，做出理性的选择，并作为一个起点成像的新系统。
在整个正文中，我们使用调幅提及的AFM的振幅调制操作模式。我们要么悬臂偏转（接触模式）或振幅（AM模式）作为设定值时参考的反馈参数保持恒定。在AM模式，悬臂外部驱动或者通过声学振荡或通过脉冲激光聚焦在悬臂的底部。 驱动振幅为外部振荡信号的强度。实现悬臂梁的一个给定的振幅所需的驱动振幅的绝对值取决于许多参数，例如驱动的方法（声学，光热或磁），悬臂固定和参数（刚度，几何形状）和激光对准。因此，驱动振幅的精确值是不相关的，但它是在每个实验中调节，以便提供悬臂的一个适当的（和可定量）振荡幅度。当从动悬臂远离样品和没有其振动的阻尼通过针尖-样品的相互作用时，它的振幅被称作自由振荡幅度 。作为振动针尖接近样品的表面上，其幅度开始降低。如果反馈被启用，z-压电const的会antly重新调整它的扩展，使龙骨所选择的设定幅度，保持不变。设定值通常总是比免费的幅度较小。它是共同以上自由振幅指设定值的比例 ，设定值振幅的比率（摄像振幅）。设定值比率越小，更苛刻的摄像条件。
Protocol
1.工具等表面的清洁
注：当瞄准高分辨率，任何形式的污染都有不利的后果。因此，有必要确保用于操纵样品，衬底或针尖被彻底清洁的所有工具。以下说明适用于任何表面或仪器（ 例如，镊子），其可以接触到样品中，悬臂，或AFM细胞，包括样品台本身接触。
- 浴超声处理在超纯水中的文书（18.2MΩ，<5ppm的有机物），其次是异丙醇（纯度99.7％），其次是再次超纯水，各10分钟。如果可能的话，使用通风橱下异丙醇，以减少吸入烟雾。
- 在氮气流下干燥。
- 如果充分浸泡是不可能的（ 例如，对于悬臂架/电子）在ultrapu浸泡，身体用单层，低皮棉组织（轻型组织雨刷）擦拭表面的清洁再用水，异丙醇和超纯水，按顺序。使表面干燥空气中（通常在15至30分钟）。
2.基板制备
注：基底表示在固体表面直接支撑的样品中，通常在与两个原子力显微镜扫描仪和样品物理接触。大多数的AFM具有磁性底座和可使用的钢盘，但相同的协议也适用于基材如玻璃载玻片。在这里，我们假设其上云母盘贴钢盘。此过程的目标是尽可能多，可以影响成像污染的可能的外部来源来限制。手套必须始终佩戴。
- 由超纯水再次浴超声处理在超纯水中的钢试样盘（18.2兆欧），其次是异丙醇，最后，每10分钟。
- 干燥的氮气流下的光盘。
- 制备环氧树脂胶少量与充分混合的试剂和地方〜1081;微升钢盘上。
- 通过在基板上施加压力粘贴基板（白云母，SiO 2的结晶，玻璃等 ）的钢盘。允许环氧树脂固化数小时在升高的温度（见生产商的规格）。
- 确保没有环氧直接暴露于空气中，围绕基片的边缘。如果使用的环氧树脂的量过多，并可能成为污染源，这将发生。
- 对于云母基板，牢固地按约2.5厘米宽的胶带到基板上，从而使整个面被覆盖，并顺利地剥开。使用轻度胶带，并通过平行拉动以表面剥离云母。被去除的材料是在磁带上可见。重复这个过程2-3次，直到云母是镜面光滑的眼球。
- 为玻璃/ SiO 2的，如果需要进一步的化学表面改性，重复步骤2.1-2.2所述浴超声处理例行程序。另外，用UV曝光单元（18瓦的UV-C杀菌灯）30-60分钟，这取决于电源）热解，可能在表面上留下任何有机物。这个过程也使该表面更加亲水，而不显著增加粗糙度。
3.悬臂和提示的制备
- 沉浸在异丙醇浴悬臂芯片，随后的超纯水，各60分钟。
- 如果悬臂/针尖需要彻底清洗（ 例如 ，在凝胶盒长时间储存后），加上第1步之前在丙酮中30分钟的浸泡（> 99.5％纯度）（另见部分解决污染）。提示凝胶盒存储，在我们的经验，可能出现非常迅速的污染59的主要来源之一。
- 揭露尖端，以有利于稳定的水化网站60形成于紫外光短暂（<5分钟）。避免过度暴露较长时间，因为它可能会损坏针尖或增量rease其曲率半径。
- 插入悬臂插入AFM的悬臂支架和吸管〜50微升的成像溶液（该溶液将取决于样品的性质进行调查，但在这种情况下使用的超纯水氯化铷的10mM溶液）到悬臂和提示要预湿它;此接近的样本时将限制气泡的外观。
AFM细胞4.建立
- 装入样品圆盘和基底上样本台，并添加成像液体的液滴（液体一般为2-3毫米厚的在其最高点）。
- 悬臂支架连接到原子力显微镜。
- 使悬臂和样品紧密接近，以便形成在悬臂/针尖与样品流体之间的毛细管桥梁。
5.初始化测量悬臂和校准
- 对准测量激光（通常为红色）接近尖-END悬臂。根据不同的原子力显微镜模型，可以通过软件控制，或由激光位置的手动调节这样做。获得在液体中的悬臂的热谱（ 见图1A）。这个过程中记录使用激光悬臂的热波动，以便找到该悬臂的主要共振（基本本征模式）的频率。在最现代的原子力显微镜，这是通过在软件控制的自动程序完成，但细节可能会发生变化，从原子力显微镜AFM。
图1：调整和校准悬臂。答 ：悬臂的垂直偏转（黑色）与基波本征（红色）的简谐振荡器（SHO）合适的热噪声频谱。这里的共振是18.7千赫水。对应于前三个挠曲本征模式的前三个共振频率是highlighted与蓝色箭头。 乙 ：悬臂的逆光杠杆灵敏度的校准。压靠在刚性（不可变形）表面悬臂的线性偏转被用于测量以伏特测量偏转和在纳米的对应值之间的转换因子（InvOLS）。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 记录的偏转与用硬衬底（ 例如 ，云母或玻璃）上的悬臂距离曲线和通过施加在所述线性偏转区域的曲线（如在图1B）的斜率是统一61校准偏转- 63。
注意：此进程发现所测量的偏转之间的转换因子对所述光检测器（以伏特）和悬臂的实际偏转（在纳米） - 硝酸钾WN的逆光杠杆灵敏度（InvOLS）。校准可能损坏的前端，所以最好是所有的测量完成后，进行它。使用之前的实验中导出的相同类型的另一个悬臂的InvOLS值校准之前得到的真实振幅的估计（通常> 90％的准确）。 - 适合在热谱共振峰用一个简单谐振子模型64 - 66产生的悬臂的弹簧常数。此过程在大多数的AFM软件自动和通常不需要有问题的模型的专业知识。
- 调整悬臂。找到悬臂的幅度响应时外部驱动（ 例如，声学或由光热激发）的范围内接近其标称谐振频率的频率的。设定的驱动频率到接近最大在此光谱中，略向左侧。如果悬臂是acoustically带动下，许多虚假的极大可能出现在调整。
- 选择一个共振峰尽可能接近到（和的包络线内），通过使用原子力显微镜，但具体的控制软件可能依赖于软件类型和版本，其控制的AFM在热谱所确定的共振。
6.方法和样本的初步检查
- 使自由振荡幅度是约5nm设置的驱动幅度。这通常对应于大多数原子力显微镜0.2-0.8 V（万一InvOLS未校准）。调整振幅设定为游离振幅的〜80％。
- 设置反馈增益相对较高（绝对值依赖于原子力显微镜），但确保没有不稳定或振荡发生。
- 设置初始的扫描速度和扫描尺寸小值（ 例如 ，分别为〜1 Hz和10纳米）。这有助于维持的情况下，一些反馈参数调整不佳尖端避免长距离扫描。扫描尺寸可以随后增加至更大的值（ 例如，100纳米），如果扫描条件出现合适的。
- 确定表面的方法之前（在某些情况下，这必须进行光学完成）的近似高度。
- 启动尖端的方法使用AFM控制软件的表面。这个过程的细节将取决于AFM和软件的使用的模型。
- 如果使用软悬臂时，有与方式的问题，进行接触模式的方法。在这种情况下，确保了增益比在AM模式下，和设定值设定为相对低的值（0.1-0.2 V定心激光在光电检测器之后）保存的尖端。
- 评估的前端是否已到达表面而不通过稍微改变设定值（增加接触模式或减小AM模式）开始图像。如果前端是在表面，在T的影响他的Z-压电扩展可以忽略不计。的Z压电的活运动通常在大多数的AFM的控制软件以图形方式显示。如果设定值变化触发压电的可视运动，这表明一个假搞。在后一种情况下，重新开始从当前尖端位置的方法，使用稍高（接触）或低级（AM）设定点。
- 一旦该尖端部到达表面，（通过简单地按下“停止”通常）缩回的Z压电和重调的悬臂（重复步骤5.4）;谐振频率将可能已转移到一个较低的值，由于针尖 - 样品的相互作用。
- 改变设定点〜80％，最新的调整幅度免费的（在这个针尖样的距离）。
- 接合悬臂和AM模式进行表面的10×10纳米的2扫描，以验证该摄像参数是合适的。
- 检查跟踪（扫描从左到右），回溯（左扫描右）型材叠加。如果没有进一步降低设定值，并尝试提高增益。
- 降低收益，如果图像变得嘈杂。
- 具有大重复操作- 1×1微米2至5×5微米2 -提供的样本的扫描，这是可能的。软或生物样品，这可能会导致在尖端的污染。
7.高分辨率成像
- 减少扫描大小的值适用于可视化功能（ 例如 ，100×100纳米2蛋白质晶体或20×20纳米2云母或方解石）。
- 降低悬臂足够用于反馈环路自动缩回的Z压电并因此从表面的尖端的驱动振幅。而该悬臂是远离表面，调整驱动振幅，使得悬臂振幅〜1-2纳米（峰 - 峰值）。
- 使用AFM控制软件，进步党sively减少设定值几十毫伏的在一个时间，直到在Z压电朝向表面再次延伸，并且原始图像被恢复。保持75％，而新的自由振幅的95％之间的设定值振幅。
- 重新调整使用AFM控制软件的收益;高增益可以在较低幅度的重复使用而引进显著噪音。
- 重复这些步骤7.2-7.4，以便确定的自由振幅，设定点的最佳组合，并获得高的分辨率。的最佳条件取决于样品（溶剂化景观和液体的润湿性），而且还悬臂（弹簧常数，刚度）。
- 探索振幅的不同组合，以优化成像条件。可能有必要再次增加自由振幅42。在这样的情况下，调整第一设定值到较高值，然后增大驱动器（除用于降低幅度即相反的过程）。
- 保持setpoi在0.5纳米范围内nt的振幅 - 使用设定值比1.5纳米（峰峰值）保持在0.7以上（通常为0.75-0.95）。对于亲溶剂接口，采用悬臂0.5弹簧常数 - 2牛顿/米。这是足够的小费以除去大部分界面液体没有击中的表面上。根据经验，在EQ建议。 4参考29。
Representative Results
在上一节中描述的协议已与多家商业原子力显微镜得到成功应用，实现molecular-或原子级图像。与调整个别以下步骤0.5纳米和1.5纳米之间的工作幅度得到了所有图像的步骤7.1-7.4。结果可以得到在宽的范围内的软（ 图2）和僵硬（ 图3）的样品。在每一种情况下，所关注的特征被突出显示。之一的技术中的一大优点是，小振荡振幅和高设定点最小化由在样品上的前端所施加的力，从而使脂质（ 图2A），蛋白质（ 图2B和D）的脆弱自组装，和两亲分子（ 图2C），而不会在溶液损伤进行成像。较硬的晶体材料，如矿物（ 图3A，B，D）和吸附的表面（ 图3C）的单金属离子可以使用的方法，因为在任何情况下，它是有效地与所描述的协议成像的界面液体进行成像。溶剂化力上显示图2和3的样品比较的：所有样品是亲水性（更一般地，在图2C，3B，3D的情况下，“亲溶剂”），相对于所述成像溶液。一致，具有可比性刚性悬臂（0.2 - 0.8牛顿/米）在所有情况下被使用。两个样品和针尖应亲溶剂，以确保液体分子形成可成像的定义良好的溶剂化结构。这并不总是一个充分条件，但在大多数情况下，和相对较小的液体分子，液体重新结构本身在模仿样品对称性的一种方式。高分辨率的主要驱动力是在吸附溶剂分子的亲和力的局部变化对于表面（埃规模的，在图2A，3A，3C的情况下）。的技术，其中的溶剂的结构而变化，以在表面很大程度上因此最适合的材料。
图2：由AM-AFM在水溶液中成像的软接口。答 ：在凝胶相棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）脂质双分子层在150毫米氯化钾成像英寸该六边形包装脂头基团在两种地形和相区分，与当地的对比表明水化特定地点的变化一起。 A：在150毫米氯化钾，10毫米的Tris，pH值7.4成像嗜盐salinarum的紫膜。一些细菌视紫红质蛋白质三聚体突出显示。相位表现出从地形不同对比度由于对蛋白质本地水化位点。个别蛋白质三聚体可以由出（虚线）。 C：吸附在染料敏化太阳能电池的二氧化钛纳米颗粒的表面两亲染料（Z907）的分子。该图像是在乙基异丙基砜获得。海绵状外观由吸附染料分子创建。 D：水通道蛋白晶体在相同的缓冲液作为B.一个水通道蛋白四聚体成像的天然牛晶状体膜被突出显示。对应于除螺旋线圈子结构是在地形可见而相位示出了显着的不同对比度由于蛋白质附近的不寻常的水的行为。图像是改编自36裁判（B），参考38（C）和REF 67（D）。比例尺为5nm（A），10纳米（B）在（C）的3纳米和15纳米（D）的所述色标分别指示200点和15°（A）中，600的高度和相位变化下午和4°（B），2.5纳米和2.5°（C）和1.6纳米和9.5°（D）。负载/ 54924 / 54924fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3：在流体溶液硬样品的代表性的AM-AFM图像。答 ：方解石晶体[ 
[表面在平衡超纯水溶液成像。 A：钛酸锶成像在二甲基亚砜（DMSO）中得到。高分辨率中水是不可能的。 C：在3毫米氯化铷成像白云母-单吸附铷+离子在相位和高度扫描云母的格点可见。 D：碳化硅在DMSO成像。预计晶体安排显示在图像B和D图像是改编自68 REF（A），参考42（B和D），和REF 44（C）。比例尺为3纳米（A，B，D）和5纳米（C）。色阶分别代表250点和14°（A），600分和5.5°（B），800分和15°（C）和500点和3.5°（D）的高度和相位变化。 请点击此处查看该图的放大版本。
Discussion
假设成像液体和悬臂刚度被适当地选择，以实现成功的高分辨率的最关键的步骤是成像振幅的调整，并研究了系统的整体清洁。
振幅媲美的界面液体区域（通常小于2纳米）的厚度探针在界面溶剂42的性能主要变化。如果振荡幅度过大，振动尖端将遍历远距离，非线性力场52排除悬臂运动的稳定性，并不可避免地打到样品不管成像条件29，从而导致分辨率的恶化。除了在分辨率的损失，高次谐波开始出现在尖端运动并且系统变得更复杂的模型55。可替代地，如果成像幅度过小O接口的唯一一句一部分被探测（界面液体的典型具体层）和稳定的成像只能与僵硬悬臂来实现（> 10牛顿/米在水中53），用于令人满意的信噪比，与风险破坏软样品在大高度变化。需要刚性悬臂是克服热噪声，可以成为更显著所测量当与小振幅工作的信号，所述针尖与样品之间的长距离相互作用仍然存在，但在很大程度上是恒定并且不影响高分辨率对比度在所获得的图像。
成像环境的清洁是非常重要的，当涉及到高分辨率的原子力显微镜。在系统中不期望的化合物可以与成像和力光谱既干扰。有迹象表明，往往会影响实验污染物的两个主要类别：成像时（ⅰ）污染物直接可见的（
图4：摄像白云母时观察到抑制高分辨率成像污染的例子。答 ：云母成像在5mM氯化铷-无污染物颗粒是可见的。 A：污染服用几十纳米的数量级的聚集体的形式跨越而成像在名义上超纯水。 C：由contami形成自组装结构恶性颗粒性质大概两亲性。成像在名义上超纯水中再次进行。 D：对应于A，B和C中的虚线示出了从云母的原子级平坦的表面的偏差垂直偏移部分。在A，B和C比例尺对应于300纳米。 请点击此处查看该图的放大版本。
案例（二）更常见，其主要特征是令人沮丧的事实，亚纳米级的功能根本无法得到解决，无论成像条件。这种类型的情况的签名是通常在力光谱测量这往往表现出一定的不一致性可见。这些可能包括很难再现曲线和幅度对距离的曲线从一个典型的S形42的显著偏离。如果污染物，离子的或以其他方式，是DISPERS编均匀整个流体，他们可能不会在地形成像显示，但可以打乱样本69，这是用于保持常规针尖-样品的相互作用29和获得高分辨率70至关重要的水合结构。也可能存在于样品中的污染物的直接影响，特别是在软，生物实验。例如，它是公知的醇的存在下（从清洁步骤）可积液凝胶相脂质双层71 - 73，渲染亚纳米级分辨率是不可能的。如果高分辨率是不可能的，应先采取在清洗过程中，特别是着眼于该进入与成像溶液接触的任何设备。甚至如环氧树脂表面上的稳定化合物可以在流体溶剂化物在一定程度上，如果没有完全固化。
用AM-AFM高分辨率成像要求很高，需要耐心和达到最佳的成像条件之前经常多次试验。小实验的问题很容易变得足够重要，以防止高分辨率和故障排除技能是必不可少的。此后，我们列出了一些我们与提出的解决方案中遇到的最常见的问题。
悬臂式调整
大多数商业用原子力显微镜声激励来驱动悬臂。在这种情况下，调谐悬臂，如在步骤5.4中所述，接近其谐振频率常常提供了在空气中操作足够的性能。在液体环境中，液体趋于以诱导AFM的不同的机械零件，如悬臂芯片和支架之间的一些耦合。这可能会影响悬臂的表观共振，常表现出许多尖锐的峰和谷通常被描述为一个“峰的森林”悬臂频谱示出。其结果，常常难以找到CORRECT变频器频率。这些峰也存在于气体环境，但由于悬臂的质量因数的高值，在共振的幅度是相当大的74,75。在液体选择适当的峰以驱动悬臂可以是不容易的，并且可以要求试验和错误。在实践中，随着“峰森林”周围的共振频率的幅度变化幅度最大的频率峰值通常尽管是不一定准确共振，往往提供的驱动频率足以获得高分辨率成像的最佳选择。
图像失真
影像漂移往往是追求高分辨率时的问题，使图像看起来失真（通常拉伸）。其来源是一般的热，可能是因为在扫描仪/ AFM还没有达到它的平衡的工作温度，或由于样品液体的一部分被迅速蒸发（ 例如 ，成像在醇 ）。在所有情况下，漂移变为在热平衡可忽略不计。因此，有用的固定样品，如果可能的温度。否则，这是值得离开AFM在进行实验前扫描数小时空白样品（大尺寸的扫描在慢扫描速率）。如果蒸发是不是一个问题，此过程最好在步骤6之后进行，注意第一撤回尖端从表面的短距离（ 例如 ，20微米）。偶尔，漂移甚至会经过广泛的热化依然存在。这通常表明悬臂或它的芯片部分拖动样品同时成像，这东西可以在软凝聚力样品发生，如薄膜或针尖/悬臂/芯片不宜放置。在芯片上该主机多个悬臂/尖端，它常常是有帮助打破不在使用，而不是让它们在表面拖过悬臂。
离子强度
ntent“>由于成像由界面液体为主，有时是非常有用添加对充电表面的高分辨率成像一些盐水。该盐的作用是双重的：首先，它修改的水合风景表面在吸附，这通常提高了对比度成像。其次，它有助于针尖和样品之间屏强静电相互作用（ 例如，在云母）。一般地，较大的离子，例如钾，铷和铯允许更好的图像，由于其特定的水化性能76，而事实上，它们经常吸附主要是在一个独特的水合状态77。坏悬臂/针尖
如果怀疑该悬臂是污染的来源（见上述症状），应先在光学显微镜下检查。如果存储在凝胶中，悬臂可以拿起凝胶聚合物或硅油59，可以显示的痕迹在极端情况下，如暗斑，在悬臂的背部（如在图5A）。悬臂的光热振荡可诱导类似的斑点，但它们是由于由驱动激光退化/过热悬臂涂层。污染往往会随机出现在悬臂。较长（12小时）清洁用异丙醇，然后，用超纯水可以从悬臂除去任何不希望的粒子。
图5：新的悬臂，并且已被广泛使用于硬质表面和左中的凝胶盒在较长时间内一个相同的比较。答 ：顶部;已被清理（见程序）全新的悬臂梁光学图像。底部;光学图像展示可见的污染物从胶箱的外观（蓝色箭头）。 A：悬臂各自的热谱图的比较。老悬臂的第一共振峰拓宽清楚（绿色箭头）和一些高阶模式增强（蓝色箭头）。谱已垂直偏移并呈现在为清楚起见数 - 对数标度。 请点击此处查看该图的放大版本。
如果没有实现所需的亚纳米分辨率，尽管在较低的分辨率上可接受的图像，它是可能的针尖已存储环境中变得化学修饰。这可以通过在悬臂芯片的曝光处理以紫外线氧化剂为120秒，这有助于在嘴60的亲水性表面基团的创建。注意应然而采取必要可以取决于尖端几何形状和紫外线功率变化的准确时间，并经曝光，可能会导致在尖端和减小的分辨率的钝化。
热噪声</ P>
高分辨率成像要求现行的变化和距离（通常分PN部队和亚埃的距离78）非常敏感。对于较软的悬臂，所述悬臂的，由于其固有的布朗运动（热振动）的热机械运动可能是一个问题。在第一近似值，具有刚度k的悬臂，它是不可能测量设有小于
中，热噪声，其中k B是玻耳兹曼常数，T是温度的幅度。实际上，使用悬臂具有较高的共振频率扩展在较大的频率范围内的噪音，并降低在测量带宽79的整体噪声水平。
较高的本征成像
有时可能是有益的在其第二本征模式来操作悬臂增加所致的有效刚度（见污染的讨论）。实际上，这是通过驱动在其第二本征模的悬臂仅仅做（在较高频率的第二共振峰， 见图1A）。当调整悬臂，只需选择第二本征而不是主共振并继续执行步骤5.4。注意，当悬臂在第二本征模式驱动的InvOLS将是不同的;典型地在步骤5.2的矩形悬臂测量InvOLS的〜1/3
该技术的主要限制是它要求在样品的表面上的稳定的溶剂化景观。样品应足够健壮以允许扰动界面液体而不诱导样品本身的显著变形。这可以是非常柔软的，不稳定的样品，例如大生物分子具有挑战性。另外，小幅度AFM这里描述无法获取有关在p机械信息样品roperties，作为悬臂刀片花费在界面流体的大部分其时间。对于这一点，可能是有益的是使用其它方法如定量纳米机械制图80或利用悬臂运动的高次谐波。 83，可同时提供地形和样品25,81的刚度- -流体成像时（以低质量的因素）29,81较高的口琴一般都增强了84，但他们一般是不利的高分辨率。固有所有扫描探针显微技术的其它局限性仍然有效这里，特别是这一事实的结果不可避免地包含有关测量芯片的信息。使用小幅度也是不理想的大高度变化的样品;反馈回路将不可避免地做出反应更慢时高度的变化比成像幅度较大，因此，冒着样品和尖端的损害。使用Ø˚F柔和悬臂减轻这个问题在一定程度上。
这里提出的方法的主要优点是，它提供了最高的图像分辨率可能的原子力显微镜中的液体，但可以在任何商业的AFM来实现，只要该机器的噪音水平是足够低的事实。在商用仪器相媲美的分辨率通常是在接触模式在FM-AFM僵硬悬臂实现，或者偶尔为之。在AM-模式，并以相对较软的悬臂工作允许的样品更广泛的选择，是很容易，FM-AFM实现在大多数系统上。该方法依赖于利用现有的任何固体和液体之间的界面的溶剂化力以增强分辨率和获得本地化学信息。它可以在原则上在环境条件下使用，仅仅靠由于空气的湿度最表面上建立的水层（通常为几纳米厚）。基本的原则高分辨率策略保持不变，但最前端的是在空气中，仅与尖端顶点和样品85之间的毛细管桥梁。高分辨率已在这些条件下86,87被证明在硬的样品。成像条件是但比浸没液体的不同，由于悬臂的振荡的高Q因子。实际上，我们发现难以实现稳定操作软的或不规则的样本，大概是由于毛细管桥的时间变化和增加Q因数对于给定的悬臂刚度。
本文描述的协议提供了用于在液体中与大多数现代商业的AM-原子力显微镜获得的样品的分子水平的分辨率的图像的方法。我们提供我们所选择的成像参数背后的科学原理，强调溶解力的作用。我们还讨论共同的问题，特别是污染。具体针尖 - 样品的相互作用CAÑ具体大大取决于成像溶液，悬臂几何形状和材料，和样品化学的内容。扫描过程中存在的主导力量的性质的实际理解因此，必须适应这个协议到新系统，并确保可靠的结果。当优化，实验方法是强大的现场获得的样品地方分子水平的见解在溶液中。
Acknowledgments
从工程和物理科学研究理事会资助（赠款1452230和EP / M023915 / 1），生物技术与生物科学研究理事会（授予BB / M024830 / 1）和欧洲理事会（FP7 CIG 631186）表示诚挚的谢意。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimode IIIA AFM | Brucker | NA | One of the machine used |
| Cypher ES AFM | Asylum Resarch | NA | One of the machine used |
| AFM cantilever/tip | Nanoworld | Arrow UHF-AUD | best for high frequency |
| AFM cantilever/tip | Olympus | RC800-PSA | versatile and cheap |
| ultrapure water | Milipore | NA | lab filtering systems can induce contamination |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aaldrich | 200-664-3 | standard chemical, no further purification |
| Monovalent salts | Sigma-Aaldrich | standard chemical, no further purification | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | lipid bilayers formed using stadard protocols | |
| Crystals | MTI | polished crystals | |
| Scotch tape | 3M | Scotch Magic Tape | Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly |
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