Summary
우리는 액체 내에서 진폭 변조 (탭핑 모드) 원 자간 력 현미경으로 나노 미터 이하 해상도의 이미지를 달성하기위한 방법을 제시한다. 이 방법은 상용 원 자간 력 현미경에 설명된다. 우리는 매개 변수의 우리의 선택 뒤에 이론적 근거를 설명하고 해상도 최적화를위한 전략을 제안한다.
Introduction
그것의 발명 이후, 삼 년 전, 원자 힘 현미경 (AFM) (1) 특히 거시적 인 표면 영역에 걸쳐 평균 곳, 나노 스케일에서 샘플을 조사하기위한 선택의 기술 자체를 설립했다하는 것은 불가능하며 지역 정보가 필요합니다. 전형적인 AFM 측정에있어서,가요 성 캔틸레버의 편향 분자의 소수 캔틸레버의 끝 부분에 장착 된 울트라 팁 간의 상호 작용력을 정량화하는데 사용된다. 고려 상호 작용의 유형 및 타임 스케일에 따라, 다양한 정보가 소프트 2,3- 생체막의 점탄성 특성을 포함하여 유도 될 수 있고, 하나의 화학적 결합 강도 또는 분자 4,5, (A)의 원자의 상세 표면 6-8, 자석 (9), 용량 (10), 시료 11, 12, 13 열 (14) 및 화학적 성질을 실시
그러나, 실제로는 온도보다 다른 조건의 AFM을 동작시키는 도전 많은 번역 결과 대기 중에서 수득 할 수있다. 추가적인 어려움이 큰 마찰력을 피하고 팁과 샘플 모두를 유지하기 위해 동적 모드 (진동 TIP)의 AFM을 제공하는 것이 필요하다는 사실에서 나온다. 더 도전하지만, 동적 동작은 원칙적으로 분석 샘플에 대한 자세한 정보를 제공하고, 공간 해상도의 손실없이 할 수 있습니다. 다중 주파수 측정에, 23 - 지난 10 년간, 액체의 동적 AFM의 분야는 비디오 속도 AFM (21)의 출현에서 중요한 발전을 보았다
AFM에서, 특정 측정 달성 높은 공간 해상도는 AFM 자체의 품질과 t의 특성 모두에 의존그는 상호 작용은 20,47,48를 프로빙. 현재, 대부분의 상한은, 열 (12)의 한계에 가까운 시판 AFM 파일 본 소음 때문에 해상도에 대한 결정 인자는 일반적으로 팁 - 샘플 상호 작용이다. 효과적으로 해상도 결정이 상호 작용의 공간 구배 : 급속 상호 소멸성 단거리에 기초하여 측정치가 장거리 상호 작용 게임에있을 때보다 높은 해상도의 결과를 생성한다. 액체 그들이 액체의 단지 약간의 분자 직경을 통해 소멸하는 경향이 있기 때문에, 용 매화 힘은 이미징 해상도를 향상시킬 수있다 (일반적으로 <1 ㎚) 떨어진 샘플 (49)의 표면으로부터 이동하는 경우. 이러한 힘은 액체 분자와 시료 표면 간의 상호 작용에서 발생. 표면에 대한 강한 친 화성 액체는 더욱 주문 샘플 29,42,50과의 계면에서 벌크 액체보다 이동하는 경향이된다. 결과적으로,그것은 나노 년 - 매화 풍경 계면 액체 특성의 지역 변화에 매우 민감한 측정을 렌더링, 대량의 액체 (42)보다 계면 액체 분자를 변위 진동 AFM 팁에 대한 더 많은 에너지를 소요됩니다.
매화 세력을 이용하기 위해, 여러 가지 실제적인 측면은 고려 될 필요가있다. 먼저, 선단의 진동 진폭이 매화 힘 범위와 비교 될 필요가 일반적으로 1 nm의 <. 둘째, 액체 샘플의 표면에 잘 정의 매화 풍경을 형성해야 사용. 거시적으로,이 고려 된 샘플에 대한 '습윤'액체를 요구하는 것과 같습니다. 예를 들어, 물에 소수성 흑연 42,51보다 친수성 운모에 분자 수준의 해상도를 달성하기 쉽다. 마지막으로, 팁을지지하는 캔틸레버의 스프링 정수 (52, 53)을 적절하게 선택되어야한다. 이러한 사기에서 작업 할 때ditions는 AFM는 인터페이스의 분자 수준의 화상을 제공하지는 않지만, 또한 시료 표면 (54)에 대한 화학적 정보를 얻기 위해 사용될 수있는 로컬 샘플 액체 선호도에 대한 정보를 유도한다.
액체의 AFM위한 동작의 일반적인 동적 모드는 진폭 변조 (AM, 또한 "탭핑 모드 ') 및 AFM 주파수 변조 (FM) AFM이다. 그 진폭이 연속적으로 팁 - 샘플 거리를 다시 조정하는 피드백 루프에 의해 일정하게 유지되는 동안에 제 1 케이스 (55)에서, 팁 샘플을 래스터 - 스캔한다. 샘플의 지형 이미지는 피드백 루프에 의해인가 된 보정으로부터 얻어진다. FM-AFM 28,41,56에서는 선단이 시료를 스캔하는 동안 일정하게 유지되는 캔틸레버 / 팁의 진동 주파수이다. 두 기술은 액체 36,57의 비교 지형 해상도를 제공합니다. 팁 샘플 상호 작용의 정량화 더 strai 경향이있다ghtforward 및 FM-AFM에서 정확하지만, AM-AFM은 구현하기가 쉽고보다 강력한이며, 부드러운 캔틸레버, 쉽게 변형 또는 민감한 샘플을 공부하는 데 유용 뭔가 작업을 허용한다. 중요한 것은, AM-AFM은 부분적으로 역사적인 이유뿐만 아니라 그것으로 인해 제어 할 기술적으로 쉽다는 사실, AFM의 사용자들 사이에서 더 널리 퍼져있다.
진폭 AM-AFM 영상 중 상기 피드백 루프에 의해 일정하게 유지되지만, 팁 진동과, 구동 진동의 위상 지연을 자유롭게 변경할 수있다. 위상 지연은 샘플 (58)과의 계면에서의 팁의 진동 동안 소모되는 에너지와 관련되고, 팁 - 샘플 상호 작용에 관한 유용한 정보를 제공 할 수있다. 따라서 위상 이미징 지형 촬상 동시에 취득 할 수 있고, 종종 시료 표면의 얼룩이 강조에 상보 적이다. 위상 영상은 디를 포함한 상호 작용의 다양한 매핑을 위해 이용되고있다접착 에너지 (42), 점탄성 특성 (58)와 인터페이스 (44)의 수화 풍경 RECT 매핑.
실질적으로 액체에 고해상도 이미지를 획득하는 단계 의한 제어 매개 변수의 다수의 모든 상황에서 작동하는 간단한 프로토콜 체계의 부재에 비 단순 남아있다. 이미지 품질은 일반적 등 (55) 중 외팔보 형상 탄성 팁 화학 발진 진폭 및 샘플의 강성에 의존한다. AFM 측정은 정의에 의해, 시스템 섭동도이다. 결과적으로, 적절한 고려없이 촬상 변수와 환경 조건을 변경하면 재현성 및 / 또는 그릇되게 관측 스퓨리어스 결과에 어려움을 초래할 수있다.
여기서는 AMPL 동작 상업적 장비를 이용하여 용액의 경질 및 연질 샘플의 고해상도 이미지를 달성하기위한 우리의 프로토콜을 제시itude 변조를. 목표는 각각의 경우의 촬상 처리의 기초가되는 물리적 원리 우리의 선택의 근거를 설명하는 여러 개의 샘플 해상도에 영향을 미칠 가능성이 주요 파라미터를 최적화하기위한 실용적인 방법을 제공하는 것이다. 우리는 세부 사항 캔틸레버의 선택, 조정 이미징 매개 변수의 공통 문제를 해결하는 기판 세정과 준비에서 단계별 접근 방식. 고해상도에 대한 우리의 선택과 절차 뒤에 과학적 근거를 설명하는 방법론을 채택 할 때 합리적인 선택을 도와, 및 이미징 새로운 시스템을위한 출발점 역할을한다.
이 텍스트 전반에 걸쳐 우리는 오전는 AFM의 진폭 변조 동작 모드를 참조하십시오. 우리는 셋 포인트 값으로 하나 캔틸레버 편향 (접촉 모드) 또는 진동의 진폭 (AM 모드) 동안 피드백 매개 변수를 일정하게 유지 참조하십시오. AM 모드에서, 캔틸레버는 외부 구동어느 음향 발진 또는 펄스 레이저에 의해 캔틸레버의베이스에 집중했다. 구동 진폭은 외부 진동 신호의 강도를 나타낸다. 캔틸레버의 소정의 발진 진폭을 얻기 위해 필요한 구동 진폭의 절대 값은 상기 구동 방법 (음향, 자기 광열 또는) 캔틸레버의 고정 및 파라미터 (강도, 형상)과 레이저 조정 같이 많은 파라미터들에 의존한다. 구동 진폭의 정확한 값은 따라서 중요한 것은 아니지만 캔틸레버의 적절한 (정량화) 진동 진폭을 제공하도록 그 각각의 실험에서 조정된다. 구동 캔틸레버 멀리 샘플로부터 그 진동의 더 댐핑 팁 - 샘플 상호 작용을 통해 발생하면, 그 진동의 진폭은 자유 진동의 진폭이라고합니다. 진동 선단이 시료 표면에 가까워지면서, 진폭이 감소하기 시작한다. 피드백이 활성화 된 경우 Z-압전가에서 const 것즉, 일정, 설정 온도 진폭을 용골 할 수 있도록 antly 확장자를 다시 조정합니다. 세트 포인트 값은 일반적으로 프리 진폭보다 항상 적다. 무료 진폭을 통해 설정 값 비율 설정 값 진폭의 비율 (이미지 크기)를 참조하는 것이 일반적입니다. 설정치 비가 작을수록보다 엄격한 촬상 조건은 다음과 같다.
Protocol
도구 및 기타 표면의 1. 청소
참고 : 높은 해상도를 목표로 할 때, 오염의 형태는 해로운 결과를 초래할 수 있습니다. 샘플, 기판 또는 AFM 팁 철저하게 청소 조작하는 데 사용하는 모든 도구를 확인하는 것이 필요하다. 다음은 시료 스테이지 자체를 포함하는 샘플, 캔틸레버 또는 AFM 셀과 접촉 할 수있는 표면 또는 악기 (예를 들어, 핀셋)에 적용된다.
- 10 분 동안 다시 초순수 다음 이소프로판올 (99.7 % 순도) 다음 초순수의 기기 (18.2 MΩ, <5 ppm의 유기물), 각 목욕-초음파 처리. 가능하면 연기의 흡입을 줄이기 위해 흄 후드 이소프로판올을 사용합니다.
- 질소 기류 하에서 건조.
- 완전 침수가 가능하지 않은 경우 (예를 들어, 캔틸레버 홀더 / 전자 제품) ultrapu에 배어, 단일 플라이, 낮은 린트 조직 (경량 조직 와이퍼)로 닦아 물리적으로 깨끗한 표면순차적으로, 물, 이소프로판올 및 초순수 재. 표면 (일반적으로 15 분 ~ 30 이내) 공기에 건조 할 수 있습니다.
2. 기판 준비
주 : 상기 기판은 일반적으로 직접 AFM 스캐너와 샘플 모두 물리적으로 접촉, 시료를지지하는 고체 표면을 나타낸다. 대부분 AFM 파일은 자성 산을 스틸 디스크를 사용할 수 있지만, 동일한 프로토콜은 또한 유리 슬라이드와 같은 기판에 적합하다. 여기서 우리는 운모 디스크가 부착 된 스틸 디스크를 가정합니다. 이 절차의 목적은 이미징에 영향을 미칠 수있는 오염의 가능한 외부 소스만큼 제한한다. 장갑은 항상 착용해야합니다.
- 10 분 동안 다시 초순수에 의해 결국 각각 이소프로판올 다음 초순수에서 강철 샘플 디스크 (18.2 MΩ)을 욕 - 초음파 처리하고.
- 질소 기류 하에서 건조 디스크.
- 완전히 혼합 시약 및 장소 에폭시 접착제의 작은 금액을 준비 ~ 10(81) 상기 강 디스크 L.
- 상기 기판에 압력을가함으로써 강철 디스크로 기판 (백운모, SiO2를 결정, 유리 등)를 붙이. 에폭시는 (제조업체의 사양 참조) 상승 된 온도에서 몇 시간 동안 치료하도록 허용합니다.
- 더 에폭시 직접 기판의 가장자리 주위 공기에 노출되지 않도록해야합니다. 에폭시의 과량 사용과 오염원이 될 수있는 경우에 발생할 것이다.
- 운모 기판의 전체면이 커버 될 수 있도록 견고하게 기판 상 ~ 2.5 cm 폭 접착 테이프를 누른 매끄럽게 벗겨. 약간 접착 테이프를 사용하여 표면에 평행하게 당겨 운모 껍질. 제거 된 재료는 테이프에 볼 수 있습니다. 운모는 거울 부드러운 눈에 때까지이 과정을 2 ~ 3 번 반복합니다.
- 상기 화학적 표면 개질이 필요하면 유리를 들어 / SiO2로는 단계 2.1-2.2의 조 - 초음파 처리 루틴을 반복한다. 또한, U를 사용V 노출 장치의 전원에 따라 30 ~ 60 분 (18 W UV-C 살균 램프)) 표면에 남아있을 수있는 유기물을 열분해합니다. 이 절차는 상당히 거칠기를 증가시키지 않고,보다 친수성 표면 렌더링한다.
캔틸레버와 팁 3. 준비
- 초순수이어서 이소프로판올 욕 캔틸레버 칩, 60 분간 각각 담근다.
- 캔틸레버 / 팁 (겔 상자에서 장기간 보관 후 예) 폭 넓은 청소가 필요한 경우, 1 단계 전에 아세톤에 30 분 침지 (> 99.5 % 순도)를 추가 (섹션도 해결 오염 참조). 젤 상자에 팁의 기억은 우리의 경험, 매우 빠르게 59 발생할 수있는 오염의 기본 소스 중 하나입니다.
- 안정한 하이드 사이트 (60)의 형성을 선호하기 위해 광 짧게 (<5 분) 내 자외선 팁을 노출. 이 팁 또는 INC가 손상 될 수 있으므로 더 이상 과다 노출 시간을 피하십시오곡률 반경을 rease.
- 촬상 용액 50 μL ~ 원자 현미경의 캔틸레버 홀더 피펫으로 캔틸레버를 삽입 (시료에 따라 달라질 용액의 성질이 연구되고 있지만,이 경우에, 초순수의 루비듐 클로라이드 10mM의 용액을 사용하여) 캔틸레버 상 및 그것은 습식 사전 팁; 시료에 접근 할 때 기포의 외관을 제한 할 것이다.
AFM 셀의 4. 업
- 샘플 스테이지 상에 샘플 디스크와 기판을 장착 및 이미징 액체 방울 (그것의 가장 높은 지점에서 액체 일반적으로 2-3mm 두께)를 추가합니다.
- 원자 현미경에 캔틸레버 홀더를 연결합니다.
- 캔틸레버 / 팁과 시료 사이에 유체 모세관 브리지를 형성하도록 근접에 캔틸레버 및 샘플을 준비한다.
5. 초기화 측정 및 캔틸레버의 교정
- 팁-E에 가까운 측정 레이저 (보통 빨간색)을 맞 춥니 다캔틸레버의 찾지. AFM의 모델에 따라 소프트웨어를 통해 제어 또는 레이저의 위치를 수동으로 조정하여 어느 그렇게. 액체의 캔틸레버의 열 스펙트럼을 획득 (도 1a 참조). 이 과정은 캔티레버의 주 공명 (기본 고유 모드)의 주파수를 찾기 위해, 레이저를 이용하여 캔틸레버의 온도 변동을 기록한다. 가장 현대 AFM,이 소프트웨어 제어의 자동화 된 절차를 통해 수행되지만 사항 AFM AFM에서 다를 수있다.
그림 1 : 튜닝과 캔틸레버를 교정. A : 기본 고유 모드 (적색)의 단순 조화 진동자 (SHO) 착용감과 캔틸레버의 수직 편향 (검은 색)의 열 잡음 스펙트럼. 여기 공진 물에 18.7 kHz에서입니다. 처음 세 굴곡 고유 모드에 대응하는 처음 세 공진 주파수는 외부 조명하다파란색 화살표와 함께 ghted. B : 캔틸레버의 역 광학 레버 감도의 교정. 강성 (비 변형) 표면에 가압 캔틸레버의 선형 변위는 볼트로 측정 된 편차와 나노 미터에서 대응하는 값 사이의 변환율 (InvOLS)을 측정하는데 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 딱딱한 기판 (예를 들면, 마이카 또는 유리)에 캔틸레버와의 거리 커브 대 편향을 녹음하고 (도 1b에서와 같이) 선형 편향 영역에서의 곡선의 기울기가 화합 61 것을 부과함으로써 편향을 보정 - 63.
주 :이 프로세스는 (볼트) 광 검출기에서 측정 된 편차의 변환율을 찾아 (나노 미터) 캔틸레버의 실제 편향 - 알것역 광학 레버 감도 (InvOLS)로 WN. 교정은 팁이 손상 될 수 있으므로 모든 측정을 완료 한 후에는이를 수행하는 것이 낫다. 교정 전에 진정한 진폭의 추정치 (일반적으로> 90 % 정확)를 얻기 위해 이전의 실험 기간 동안 동일한 유형의 다른 캔틸레버를 위해 도출 된 InvOLS 값을 사용합니다. - 캔틸레버의 스프링 정수를 산출하는 66 - 단순한 조화 진동자 모델 (64)과 열 스펙트럼 공명 피크를 장착한다. 이 절차는 대부분의 AFM 소프트웨어에서 자동화 일반적으로 해당 모델의 전문 지식을 필요로하지 않습니다.
- 조정 캔틸레버. 외부로부터 구동 될 때, 캔틸레버의 진폭 응답을 찾기 (예를 들어, 청각 또는 광열 여기 의해) 공칭 공진 주파수 부근의 주파수 범위에 걸쳐. 약간 왼쪽으로,이 스펙트럼에서 최대 근처에 운전 주파수를 설정합니다. 캔틸레버 acou이면stically 구동, 많은 가짜 최대 때 조정이 나타날 수 있습니다.
- AS에 가능한 가까이 (그리고 봉투 이내) AFM을 제어하는 소프트웨어의 타입과 버전에 의존 할 수있는 AFM하지만 구체의 제어 소프트웨어를 사용하여 열 스펙트럼에서 식별 공진 공명 피크를 선택한다.
6. 접근 및 샘플의 초기 확인
- 자유 진동의 진폭은 약 5 ㎚이다되도록 구동 진폭을 설정한다. 이것은 일반적으로 대부분의 AFM 파일에 0.2-0.8 V에 해당한다 (경우에 InvOLS가 보정되지 않음). 진폭 설정 값 무료 진폭 ~ 80 %를 조정합니다.
- 상대적으로 높은 (절대 값이 AFM에 따라 다름) 피드백 게인을 설정하지만 불안정 또는 벨소리가 발생되지 않도록.
- (~ 1 Hz에서 10 nm의 각각에, 예를 들면) 작은 값으로 초기 스캔 속도와 스캔 크기를 설정합니다. 이것은 몇 가지 피드백 매개 변수가 제대로 조정 경우 팁을 유지하는 데 도움이큰 거리에서 스캔을 피함으로써. 스캔 크기 후속 주사 조건에 적합한 경우에 나타나는 큰 값 (예를 들어, 100 ㎚)까지 증가시킬 수있다.
- 접근하기 전에 (이 광학적으로 이루어져야 일부 경우에) 표면의 대략 높이를 결정한다.
- 강자성 제어 소프트웨어를 사용하여 표면에 선단부의 접근을 시작합니다. 이 프로세스의 세세한 사용 AFM와 소프트웨어의 모델에 따라 달라질 것이다.
- 부드러운 캔틸레버를 사용할 때 방법에 문제가있는 경우, 접촉 모드에서 접근을 실시. 이 경우, 이득은 AM 모드보다 낮은 것을 확인하고 팁을 보존 (검출기상의 레이저 센터링 후 0.1-0.2 V)는 비교적 낮은 값으로 설정 값을 설정한다.
- 선단이 약간 지령치 (접촉 모드 또는 감소 AM 모드에서의 상승)을 변화시켜 화상을 시작하지 않고 표면에 도달했는지 여부를 평가한다. 팁이 표면에 있으면, t에 대한 영향그는 Z 축 피에조의 확장은 무시할 수 있어야합니다. Z 축 압전의 라이브 운동은 일반적으로 대부분의 AFM의 제어 소프트웨어에 그래픽으로 표시됩니다. 설정 값 변경이 압전의 가시적 인 움직임을 트리거하는 경우,이 거짓이 참여 나타냅니다. 후자의 경우, 약간 높은 (연락처) 이하 (AM) 설정 값을 이용하여 현재의 선단 위치로부터 접근을 다시 시작한다.
- 끝이 표면에 도달하면, (단순히 '정지'를 눌러 보통)를 Z-피에조을 철회하고 캔틸레버 리튠 (단계를 반복 5.4.); 공진 주파수는 것으로 인한 팁 - 샘플 상호 작용을 더 낮은 값으로 이동 한 것이다.
- 세트 포인트 (이 팁 - 시료 거리에서) 새로 조정 된 무료 진폭 ~ 80 %로 변경합니다.
- 캔틸레버를 작동 및 이미징 매개 변수가 적합한 지 확인하기 위해 AM 모드에서 표면의 10 × 10 nm의 2 검사를 실시하고 있습니다.
- (왼쪽에서 오른쪽으로 주사) 추적이와 (왼쪽 주사를 오른쪽으로) 되돌아 있는지 확인프로파일은 중첩. 아니 더하다면 설정 값을 줄이고 이익을 늘려보십시오.
- 이미지에 노이즈가되면 이득을 낮 춥니 다.
- 1 × 1 μm의 2 × 5 μm의 2 ~ 5 - - 큰 작업을 반복 샘플의 스캔이 가능 제공. 부드러운 또는 생물학적 샘플에서이 팁의 오염을 발생할 수 있습니다.
7. 고해상도 이미징
- 기능을 시각화에 적합한 값으로 스캔 크기를 줄입니다 (예를 들어, 100 × 100 nm의 단백질 결정을위한 2 운모 또는 방해석 20 × 20 nm의 2).
- 자동 Z-압전 따라서 표면으로부터 선단 후퇴하는 피드백 루프에 충분한 캔틸레버의 구동 진폭을 감소시킨다. 캔틸레버 멀리 표면 동안 캔틸레버의 진폭이되도록 ~ 1-2 내지 (피크 대 피크)를 구동 진폭을 조정한다.
- 강자성 제어 소프트웨어를 사용 PROGRESZ 축 피에조 표면쪽으로 다시 연장되고 원본 이미지가 복구 될 때까지 sively 한번에 지령치를 MV 수십을 감소시킨다. 75 % 새로운 무료 진폭의 95 % 사이의 설정 값 진폭을 유지합니다.
- 강자성 제어 소프트웨어를 이용하여 이득을 재조정; 높은 이익이 상당한 소음을 도입하지 않고 낮은 진폭 사용할 수 있습니다.
- 자유 진폭 설정치의 최상의 조합을 결정하고 고해상도 게인하도록 7.2-7.4 단계를 반복한다. 최적의 조건은 샘플 (매화 풍경과 액체의 습윤 특성)뿐만 아니라 캔틸레버 (상수 봄, 강성)에 따라 달라집니다.
- 이미징 조건을 최적화하기 위해 진폭의 서로 다른 조합을 탐험 해보세요. 이는 다시 유리 진폭 42을 증가시킬 필요가있을 수있다. 이러한 경우에, 첫 번째를 더 높은 값으로 설정 값을 조정하고 드라이브 (진폭을 감소하는 데에 비해, 즉 역 과정)를 증가시킨다.
- setpoi 유지0.5 nm 범위에서 NT를 진폭 - 1.5 나노 미터 (피크 피크) 설정 값의 비율이 (일반적 0.75-0.95) 0.7 이상으로 유지. 2 N / m - solvophilic 인터페이스의 경우, 0.5의 스프링 상수 캔틸레버를 사용합니다. 이 표면을 타격하지 않고 계면 액체의 대부분을 제거하는 팁 충분하다. 엄지 손가락의 규칙은 EQ에 제안한다. 기준 29 4.
Representative Results
이전 섹션에서 설명 된 프로토콜이 성공적으로 분자 - 또는 원자 레벨의 이미지를 달성하기 위해 여러 상업적 AFM 파일이 적용되고있다. 모든 이미지가 각각의 절차에 따라 조정 0.5 nm 내지 150 nm의 사이에 작동하는 진폭으로 수득 하였다는 7.1-7.4 단계. 결과는 부드러운 (그림 2) 단단한 (그림 3) 샘플의 넓은 범위를 통해 얻을 수있다. 각각의 경우에, 관심의 기능이 강조 표시됩니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 작은 진동 진폭과 높은 설정 점 지질 (도 2A), 단백질 (도 2b 및 D)의 깨지기 자기 조립을 허용하는 샘플의 선단에 의해 가해지는 힘을 최소화하고 있다는 양친 매성 분자 (그림 2C)는 솔루션의 손상없이 몇 군데있다. 이러한 미네랄 (도 3A, B, D) 등 세게 결정 성 물질표면 (도 3c)에 흡착 된 단일 금속 이온은 모든 경우에 효과적으로 기재된 프로토콜 결상 계면 액체이므로 접근법을 사용하여 이미징 될 수있다. 매화 힘은도 2 및도 3에 도시 된 샘플들에 필적 모든 샘플 (보다 일반적으로도 2C, 3B, 3D의 경우 "solvophilic") 영상화 용액에 대하여 친수성이다. 일관 비교 강성 캔틸레버 (0.2-0.8 N / m)의 모든 경우에 사용되었다. 샘플과 끝은 모두 액정 분자가 묘화 될 수있는 잘 정의 매화 구조를 형성하도록 solvophilic해야한다. 이것은 항상 충분 조건은 아니지만 대부분의 경우에 상대적으로 작은 액정 분자 샘플 대칭을 모방하는 방식으로 액체 재 구조 그 자체. 고해상도의 메인 드라이버가 흡착 된 용매 분자의 친화 로컬 변형(도 2A, 3A, 3C의 경우 옹스트롬 스케일) 표면에 대한. 용매 구조체 표면에 걸쳐 크게 변화 여기서 기술 그러므로 최상의 재료로 적합하다.
그림 2 : 수용액에서 AM-AFM에 의해 촬영 소프트 인터페이스. A : 겔상에서 디 팔미 토일 포스파티딜콜린 (DPPC) 지질 이중층은 150 밀리미터의 KCl에 이미지화. 육각형 포장 지질 headgroups는 수화에 사이트 별 변화를 나타내는 지역 대비와 함께, 지형 및 위상 모두에서 구별 할 수 있습니다. B : 150 밀리미터의 KCl, 10 mM 트리스, pH 7.4의에서 몇 군데 Halobacterium의 salinarum의 보라색 막. 여러 박테리오로돕신 단백질 삼량 체는 강조 표시됩니다. 위상 인해 단백질 로컬 수화 사이트 지형과는 다른 콘트라스트를 나타낸다. 개별 단백질 삼량 아웃 할 수있다 (점선). C : 염료 감응 태양 전지의 이산화 티탄 나노 입자의 표면에 흡착 된 양친 성 염료 (Z907) 분자. 이미지는 에틸 이소 프로필 술에 인수되었다. 스폰지 같은 모양은 흡착 된 염료 분자에 의해 생성된다. D : B. 아쿠아 포린 사량과 같은 버퍼에 몇 군데 천연 소 렌즈 막에서 아쿠아 포린 크리스탈이 강조 표시됩니다. 상으로 인해 단백질 근처에 이상한 물 행동에 현저하게 다른 대비를 나타내고있다 간 나선형 루프에 해당하는 하위 구조 지형에서 볼 수 있습니다. 이미지는 심판 36 (B), 심판 38 (C) 및 심판 67 (D)에서 적응하고 있습니다. 스케일 바는 색상 스케일은 각각 200 오후 15도 (A), (600)의 높이 및 위상 변동을 나타내는 5 nm의 (A)는 10 nm (B), (C) 3 나노 미터, 15 나노 미터 (D) 인 오후 4 ° (B) 2.5 내지 2.5 ° (C) 1.6 내지 9.5 ° (D).로드 / 54924 / 54924fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 유체 솔루션 하드 시료의 대표 AM-AFM 이미지. A : 방해석 결정 [ 
평형화 초순수 용액에 이미징] 표면. B : 스트론튬 티타 네이트, 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에서 얻어진 촬상. 고해상도 물에 수 없었습니다. C : 3 mM의 RbCl에 몇 군데 모스크바의 운모 - 단일 흡착 Rb는 + 이온이 모두 상과 높이 검사에서 운모의 격자 사이트에서 볼 수 있습니다. D : DMSO에 몇 군데에서 탄화 규소. 예상 된 결정 배열이 이미지 B에 도시되어 D. 이미지는 REF 68 (A)에서 (REF) (42) (B 및 D)를 적응및 (REF) (44) (C). 스케일 바는 3 내지 (A, B, D) 및 (5) 내지 (C)이다. 색상 규모는 각각 250 오후 14 ° (A), (600) 오후 5.5 ° (B), (800) 오후 15 ° (C), 500 오후 3.5 ° (D)의 높이 및 위상 변화를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
촬상 액체 및 캔틸레버의 강성을 적절히 선택되었다고 가정하면, 성공적인 고해상도를 실현하기위한 가장 중요한 단계는 촬상 진폭 조정, 및 조사 시스템의 전체 청결하다.
액체 계면 영역 (일반적으로 2 이하 ㎚)의 두께에 필적하는 진폭 계면 용매 (42)의 특성에 주로 변화 프로브. 진동의 진폭이 너무 크면, 진동 팁 캔틸레버 동작의 안정성을 배제하고, 불가피 해상도 저하의 결과에 관계없이, 촬상 조건 (29)의 시료에 충돌 장거리 비선형 역장 (52)를 통과한다. 이외에도 해상도의 손실, 고조파는 팁의 움직임에 나타나기 시작하여 시스템 (55)을 모델링하기 위해 더 복잡하게된다. 대안 적으로, 상기 촬상 진폭이 작은 경우도 O인터페이스 할수 있답니다 부분 (계면 액체의 통상적 특정 층) 프로빙 안정된 촬상는 딱딱한 캔틸레버 달성 될 수 위험 만족스러운 신호 대 잡음비 대 (> 물 53 10 N / m), 큰 높이 변화를 통해 손상 부드러운 샘플. 딱딱한 캔틸레버의 필요성은 작은 진폭 작업 할 때 측정되는 신호는, 팁과 시료 사이의 장기적인 상호 작용은 여전히 존재하지만 대체로 일정하고 영향을주지 않는 것이 더욱 중요해질 수 열 잡음을 극복 할 수있다 얻어진 이미지의 고해상도 대비.
이 고해상도 AFM에 있어서는, 촬상 환경의 청결도가 가장 중요하다. 시스템의 원치 않는 화합물은 이미징 분광기 힘 모두를 방해 할 수있다. 실험에 영향을 미치는 경향이 오염의 두 가지 종류가있다 : (ⅰ) 오염 물질을 직접 볼 수 이미징 때 (
그림 4 : 고해상도 영상을 억제 백운모 이미징 때 관찰 된 오염의 예. A : 운모는 5 mM의 RbCl에 몇 군데 - 더 오염 입자가 표시되지 않습니다. B : 오염 명목상 초순수를 이미징 동안에 걸쳐 수십 ㎚ 정도의 응집체의 형태를 취하는. C : 오염에 의해 형성된 자기 조립 구조자연 아마도 양친 매성 NANT 입자. 영상은 다시 명목상 초순수를 실시하였습니다. D : 운모의 원자 적으로 평평한 표면으로부터의 편차를 나타내는 A, B 및 C의 점선에 대응하여 수직으로 오프셋 섹션. A, B 및 C의 스케일 바는 300 나노 미터에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
케이스 (ⅱ) 더 일반적인 서브 나노 미터의 기능은 단순히 상관없이 촬상 조건 해결 될 수 없다는 사실 초조 주로 특징으로한다. 이러한 유형의 상황의 서명은 어떤 불일치를 표시하는 경향 힘 분광 측정에서 통상 볼 수있다. 이들은 상당히 전형적인 S 자형 모양 (42)로부터 이탈 거리 곡선 대 가난하게 재현 곡선과 진폭을 포함 할 수있다. 이온 성 또는 기타 오염물 경우 dispers은에드 균일 유체에 걸쳐, 그들은 지형 영상에 표시되지 않을 수 있지만 일반 팁 - 샘플 상호 작용 (29)을 유지하고 높은 해상도 (70)를 얻기위한 중요 샘플 (69)의 수화 구조를 방해 할 수 있습니다. 또한 특히 소프트, 생물학적 실험에서 시료의 오염 물질의 직접적인 효과가있을 수 있습니다. 서브 나노 미터 수준의 해상도 불가능 렌더링, (73) - 예를 들면, 웰 (세정 과정)에서의 알코올의 존재 하에서 겔 상 지질 이중층을 71 fluidify 수 있다고 알려져있다. 고해상도가 가능하지 않은 경우, 케어 먼저 촬상 용액과 접촉하는 장치에 특히 초점을 세정 처리에주의해야한다. 완전히 경화되지 않는 경우 등의 에폭시 수지 등에도 표면적 안정한 화합물은 어느 정도 유체화물있다.
AM-AFM 높은 해상도의 영상이 요구하고 인내심을 필요로하며,최적의 촬상 조건에 도달하기 전에 흔히 여러 실험. 작은 실험 문제가 쉽게만큼 중요한 될 수있는 고해상도 및 문제 해결 능력이 필수적 방지 할 수 있습니다. 향후 우리는 우리가 우리의 제안 된 솔루션으로 발생하는 가장 일반적인 문제 중 일부를 나열합니다.
캔틸레버 조정
대부분의 상용 AFM 파일은 캔틸레버를 구동하는 음향 자극을 사용합니다. 단계 5.4에 기재된 바와 같이 그 공진 주파수는 종종 공기에서 작동하기에 충분한 성능을 제공 근방이 경우, 캔틸레버 조정. 액체 환경에서, 액체는 캔틸레버 칩 홀더로서 AFM의 다른 기계 부품 사이에 결합을 유도하는 경향이있다. 이것은 종종 통상 "피크 숲"로 설명 많은 날카로운 봉우리와 골짜기를 나타내는 캔틸레버 주파수 스펙트럼에 도시 된 캔틸레버 공진 명백한 영향을 미칠 수있다. 그 결과, corre를 찾기가 어렵코네티컷의 구동 주파수. 이들 피크는 가스 환경에서 존재하지만 인한 캔틸레버의 품질 계수의 높은 값, 공진의 진폭은 74, 75 상당히 크다. 액체 내에서의 캔틸레버를 구동하기위한 적절한 피크를 선택하는 것은 쉬운 일 수 있으며, 시행 착오를 필요로 할 수있다. 실제로, 공진 주파수 주위의 "피크의 숲"의 진폭의 가파른 변화 빈도 피크는 일반적으로 공진에 종종 고해상도 이미지를 획득하기에 적합한 구동 주파수를 제공 반드시 정확하게 임에도 불구 최선이다.
이미지 왜곡
촬상 드리프트들은 고해상도를 찾는 문제이고 왜곡 된 이미지 (일반적으로 연신) 보이게한다. 원산지는 스캐너 / AFM이 평형 동작 온도에 도달하지 않았기 때문에, 또는 샘플 액의 일부가 급격하게 증발하기 때문에 (예를 들면, 촬상 알코올에 하나, 일반적으로 열적이며 ). 모든 경우에, 드리프트 열 평형 미미해진다. 샘플 가능한 경우의 온도를 수정하는 것이 유용하다. 그렇지 않으면,이 실험을 수행하기 전에 몇 시간 (느린 스캔 속도로 대형 스캔) 빈 샘플을 검사하기 위해 AFM 떠나는 가치가있다. 증발이 문제가되지 않는 경우이 절차는 가장 먼저 팁을 표면에서 짧은 거리 (예를 들면, 20 μm의) 철수를 돌보는 절차의 6 단계 이후에 이루어집니다. 때때로, 드리프트도 광범위한 thermalization 후 유지됩니다. 이것은 일반적으로 캔틸레버 또는 그 칩이 부분적으로 샘플을 끌어 있음을 나타냅니다 동안 영상, 이러한 박막 또는 팁 / 캔틸레버 / 칩이 적절하게 배치되지 않은 경우 부드러운 응집 샘플에 일어날 수있는 일. 호스트 이상의 캔틸레버 / 팁, 그것을 사용하지 않는보다는 표면 위에 끌어하게 캔틸레버를 중단하는 것이 유용 칩.
이온 강도
촬상이 계면 액체에 의해 지배되기 때문에 ntent가 ">이. 물에 대전 된 표면의 고해상도 영상에 대한 몇 가지 염을 추가하는 것이 도움이되는 소금의 역할은 두 가지이다. 먼저, 상기의 수화 프리 수정 종종 대비를 향상 흡착에 몇 군데 표면은. 둘째,. 일반적으로, 큰 이온 칼륨, 루비듐과 세슘 인해 특정 수화 특성에 더 좋은 이미지를 수 (운모에, 예를 들면) 팁과 샘플 사이의 화면 강한 정전 기적 상호 작용을하는 데 도움이 76, 그들은 종종 독특한 수화 상태 (77)에서 주로 흡착한다는 사실.나쁜 캔틸레버 / 팁
이 (전술 한 증상을 참조) 캔틸레버 오염원 것으로 의심되는 경우에는 먼저 광학 현미경으로 검사한다. 젤 박스에 저장된 경우, 캔틸레버 겔 폴리머 또는 나타날 수있는 실리콘 오일 (59)의 흔적을 선택할 수 있습니다심한 경우, 어두운 반점, 캔틸레버의 후면 (도 5a에서와 같이). 캔틸레버의 광열 발진 유사한 스폿을 유도 할 수 있지만, 구동 레이저 캔틸레버 코팅의 열화 / 과열에 기인한다. 오염에이 캔틸레버에 무작위로 나타나는 경향이있다. 초순수와 다음 이소프로판올, 함께 이상 (12 시간) 청소, 캔틸레버에서 모든 원치 않는 입자를 제거 할 수 있습니다.
도 5 : 새로운 캔틸레버와 장기간 겔 상자 단단한 표면에 광범위하게 사용하고 남겨진 동일한 하나의 비교. A : 최고; (절차 참조) 정리 된 아주 새로운 캔틸레버의 광학 이미지. 바닥; 젤 상자에서 눈에 보이는 오염의 모양 (파란색 화살표)를 보여주는 광학 이미지. B : 캔틸레버 '각각의 열 스펙트럼의 비교.기존의 캔틸레버의 제 1 공진 피크의 폭이 넓어은 분명하다 (녹색 화살표) 및 일부 고차 모드 (파란색 화살표) 향상됩니다. 스펙트럼은 수직으로 오프셋과 선명도에 대한 로그 - 로그 스케일에 제시되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
필요한 서브 - 나노 미터 분해능이 달성되지 않는 경우, 낮은 해상도의 영상으로 허용에도, 상기 AFM 팁 화학적 스토리지 환경 중에 수정되었다 것이 가능하다. 이것은 팁 (60) 상에의 친수성 표면 기의 생성을 돕는다 120 초 위해 자외선 산화제로 캔틸레버 칩의 노출에 의해 처리 될 수있다. 케어 선단 형상과 UV 전원에 따라 달라질 수 필요한 정확한 시간으로하지만 촬영해야하며, 위에 노광 팁 감소 해상도 둔화 될 수있다.
열 잡음 </ P>
고해상도 영상은 힘의 변화와 거리 (일반적으로 서브 PN의 힘과 서브 옹스트롬 (78)를 거리를)에 큰 감도를 필요로한다. 소프 캔틸레버 인해 고유의 브라운 운동 (열 진동)에 캔틸레버의 열 - 기계적 움직임은 문제가 될 수있다. 제 근사 강성 k의 캔틸레버,보다 작은 피처를 측정하는 것은 불가능 
k 개의 B는 볼츠만 상수이고, T는 온도이고, 열 잡음의 진폭. 실제로, 높은 공진 주파수를 가진 캔틸레버를 사용하여 더 큰 주파수 범위에 걸쳐 노이즈를 확산하고, 측정 대역폭 (79)의 전체적인 소음 수준을 감소시킨다.
높은 고유 모드 영상
때때로 번째 고유 모드에서 캔틸레버를 작동 유용증가 효과가 강성으로 인해 (오염의 설명을 참조). 실제로, 이것이 두 번째 고유 모드에서 외팔보 구동함으로써 간단히 수행된다 (더 높은 주파수에서 2 공진 피크를,도 1a 참조). 캔틸레버를 튜닝 할 때, 단순히 대신 주요 공명의 두 번째 고유 모드를 선택하고 5.4 단계로 진행합니다. 캔틸레버는 제 2의 고유 모드로 구동 될 때 InvOLS이 다를 수 있습니다; 일반적으로 직사각형 캔틸레버위한 단계 5.2에서 측정 InvOLS 중 ~ 1 / 3의.
이 기술의 주요 한계는 샘플의 표면에서 안정적인 매화 풍경을 필요로한다는 것이다. 샘플은 샘플 자체의 상당한 변형을 유발하지 않고 계면 액체를 교란 수 있도록 충분히 견고해야한다. 이것은 매우 부드럽고 불안정한 샘플 대형 생체 분자에 도전 할 수있다. 또한, 소 - 진폭 AFM는 P에 대한 기계적인 정보를 얻을 수있는 여기에 기술 된 바와 같이시료 roperties 캔틸레버 팁이 유체 계면에서 대부분의 시간을 보내고있다. 이를 위해, 이러한 정량 나노 기계적 매핑 (80) 등의 다른 방법을 사용하거나, 캔틸레버의 움직임 고조파 활용하는 것이 유익 할 수있다. (83)과 동시에 지형과 샘플 25,81의 강성을 제공 할 수 있습니다 - - (낮은 품질 요인) 유체 29,81 이미징 때 높은 하모니카는 일반적으로 강화되어 84 그러나 그들은 일반적으로 높은 해상도에 해로운 있습니다. 모든 주사 탐침 현미경 기술에 고유 한 다른 제한은 특히, 여기서 여전히 결과 필연적 측정 팁에 대한 정보를 포함한다는 사실에 유효하다. 작은 진폭의 사용은 큰 높이를 변형 샘플에 적합하지 않다; 높이의 변화가 영상 크기보다 큰 경우 상기 피드백 루프는 필연적 따라서 샘플 및 팁 손상을 걸고, 더 느리게 반응한다. 사용 오F 부드러운 캔틸레버는 어느 정도이 문제를 완화합니다.
여기에 제시된 방법의 주된 장점은 시스템의 노이즈 레벨이 충분히 낮은 것을 제공 액체 AFM으로 가능한 가장 높은 이미지 해상도를 제공하지만 상업적 AFM 상에 구현 될 수 있다는 사실이다. 상용 장비에 필적하는 해상도는 일반적으로 딱딱한 캔틸레버와 FM-AFM에 때때로 접촉 모드에서 달성, 또는됩니다. AM-모드로 상대적으로 부드러운 캔틸레버로 작업 샘플의 폭 넓은 선택이 가능하고, 대부분의 시스템에서 FM-AFM보다 구현하기가 쉽다. 접근 방법은 해상도를 향상시키고 화학적 지역 정보를 얻을 수있는 고체와 액체 사이의 계면에 존재하는 매화 힘을 이용에 의존한다. 이것은 원칙적으로 만 공기의 습도에 의한 대부분의 표면 상에 구축 물 층 (일반적으로 수 나노 미터 두께)에 의존하고, 주위 조건에서 사용될 수있다. 근본적인 원리고해상도 전략은 그대로 유지하지만, 팁의 대부분은 팁 선단과 시료 (85) 사이에만 모세관 브릿지 공기이다. 고해상도은 이러한 조건 86,87에서 뻣뻣한 샘플에서 증명되었다. 촬상 조건으로 인한 캔틸레버의 진동의 높은 Q 인자에 침지 액체보다 그러나 다르다. 실제로, 우리는 어려운 아마도 인해 모세 혈관 다리의 시간적 변화, 부드러운 또는 불규칙한 샘플에서 안정적인 동작을 달성 발견하고 주어진 캔틸레버의 강성에 대한 Q-요인 증가했다.
여기에 기술 된 프로토콜은 가장 현대적인 상업 AM-AFM 파일와 액체 샘플의 분자 수준의 해상도의 이미지를 달성하기위한 방법론을 제공한다. 우리는 이미징 매개 변수의 우리의 선택 뒤에있는 과학적 근거를 제공하고 매화 세력의 역할을 강조한다. 우리는 또한 일반적인 문제, 특히 오염에 대해 설명합니다. 특정 팁 샘플 상호 작용 캘리포니아N 극적 이미징 솔루션 캔틸레버 형상 및 재질, 그리고 화학 시료의 함량에 따라 달라질. 스캔 중에 존재하는 지배 세력의 성격의 실제적인 이해는 새로운 시스템이 프로토콜을 적용하고 신뢰할 수있는 결과를 보장하는 것이 필수적이다. 최적의 경우, 실험 방법은 용액 - 시튜 샘플의 로컬 분자 수준의 통계를 얻을 강력하다.
Acknowledgments
공학 및 물리 과학 연구위원회에서 자금 (보조금 1,452,230 및 EP / M023915 / 1), 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회와 유럽위원회 (FP7 CIG 631186) 감사 인정 (BB가 / M024830 / 1 부여).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimode IIIA AFM | Brucker | NA | One of the machine used |
| Cypher ES AFM | Asylum Resarch | NA | One of the machine used |
| AFM cantilever/tip | Nanoworld | Arrow UHF-AUD | best for high frequency |
| AFM cantilever/tip | Olympus | RC800-PSA | versatile and cheap |
| ultrapure water | Milipore | NA | lab filtering systems can induce contamination |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aaldrich | 200-664-3 | standard chemical, no further purification |
| Monovalent salts | Sigma-Aaldrich | standard chemical, no further purification | |
| Lipids | Avanti Polar Lipids | lipid bilayers formed using stadard protocols | |
| Crystals | MTI | polished crystals | |
| Scotch tape | 3M | Scotch Magic Tape | Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly |
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