Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme

Published: December 20, 2016 doi: 10.3791/54924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physics Department, Durham University
* These authors contributed equally

Summary

Biz sıvı genlik modülasyonu (dokunarak modu) atomik kuvvet mikroskobu ile alt nanometre çözünürlüklü görüntüler elde etmek için bir yöntem mevcut. yöntem ticari atomik kuvvet mikroskobu üzerinde gösterilmiştir. Biz parametrelerin seçimlerimizde arkasındaki mantığı açıklamak ve çözünürlük optimizasyonu için stratejiler önermek.

Introduction

Onun icadından bu yana, üç yıl önce, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) 1 özellikle makroskopik yüzey alanları üzerinden ortalama nerede, nano örnekleri araştırmak için seçim bir teknik olarak kendisini kurmuştur mümkün değildir ve yerel bilgi gereklidir. Tipik AFM ölçümünde, esnek dirsekli bükülme moleküllerinin küçük bir sayı ve konsolun ucuna monte edilen bir UltraSharp ucu arasındaki etkileşim kuvveti ölçmek için kullanılır. Olarak etkileşim tipine ve zaman ölçeği bağlı olarak, bilgi geniş bir yumuşak biyolojik membranların 2,3 viskoelastik özellikleri de dahil olmak üzere, elde edilebilir, tek bir kimyasal mukavemeti ya da moleküler bir bağ 4,5 bir Atomistik bilgilerini yüzey 6-8, manyetik 9, kapasitif 10, örneklerin 11, termal 12,13 ve kimyasal özellikleri 14 iletken 16 geniş bir yelpazede ve böyle vakum 17, gaz 11,18 veya sıvı 19,20 gibi birden ortamlarda çalışmak için yeteneğidir .

Ancak uygulamada, çevre dışındaki koşullarda AFM faaliyet zorlu ve yayınlanmış birçok sonuçlar hala havada elde edilir olabilir. Eklenen bir zorluk da büyük sürtünme kuvvetlerini kaçınarak ucu ve örnek hem de korumak için dinamik modunda (titreşimli ucu) olarak AFM çalıştırmak için genellikle gerekli olmasından geliyor. daha zorlu olmasına rağmen, dinamik çalışma prensibi analiz numune hakkında daha fazla bilgi sağlamak ve uzamsal çözünürlük kaybı olmadan yapabilirsiniz. Multifrekans ölçümlerine, 23 - Son on yılda, sıvı dinamik AFM alan video oranı AFM 21 gelişiyle itibaren, önemli gelişmeler gördü 26 de hidrasyon yapıların 24,25 ve alt nanometre görüntüleme - 31. 36, polimer araştırma 37, elektrokimya 38 - - 40 ve katı-sıvı arayüzleri karakterizasyonu 41-44 sıvıya batırılmış ise AFM işlemi şimdi rutin biyoloji ve biyofizik 32 kullanılır. Titreşimli konsol etrafında sıvı varlığı önemli ölçüde dinamiklerini 45 yanı sıra ucu ve numune 29,42 arasındaki etkileşimi değiştirir. Uygun kullanıldığında, sıvı ortam koşullarında 46 elde en iyi çözünürlükte kıyasla büyüklüğü hemen hemen bir sipariş tipik bir iyileşme ile, görüntüleme çözünürlüğü 26,29 geliştirmek için kullanılabilir.

AFM olarak, belirli bir ölçüm için elde yüksek uzamsal çözünürlük AFM kendisinin kalitesi ve t niteliğini bağlıdıro etkileşim 20,47,48 probed. Şu anda, en üst seviye, termal sınırı 12 olduğu yakın ticari olarak mevcut AFMs mevcut gürültü seviyeleri böylece çözümü için belirleyici genellikle uç-örnek etkileşimdir. Bu etkili çözünürlüğünü belirler bu etkileşimin uzamsal gradyan geçerli: hızla etkileşimi çürüyen, kısa menzilli dayalı ölçümler uzun menzilli etkileşimleri oynayan olduğunda daha yüksek çözünürlüklü sonuçlar üretir. Sıvının onlar sıvı sadece birkaç moleküler çapı üzerinde kaybolmak eğilimindedir çünkü, çözünme kuvvetleri görüntüleme çözünürlüğü artırmak (genellikle <1 nm) uzak numunenin 49 yüzeyinden geçerken. Bu kuvvetler sıvı molekülleri ve numunenin yüzeyi arasındaki etkileşimden kaynaklanmaktadır. Yüzey için güçlü bir afiniteye sahip bir sıvı daha düzenli ve örnek 29,42,50 ile ara dökme sıvı daha az hareket eden olma eğiliminde olacaktır. Sonuç olarak,bu nano -the çözme manzara da ara yüzey sıvı özelliklerinde yerel değişikliklere son derece hassas ölçüm render dökme sıvı 42 daha arayüzey sıvı molekülleri yerinden titreşimli AFM ucu için daha fazla enerji alacaktır.

çözme kuvvetlerine yararlanmak için, birden fazla uygulama yönleri dikkate alınması gerekir. İlk olarak, uç salınma genliği çözme kuvvetlerinin aralıkla karşılaştırılabilir olması gerekmektedir, tipik haliyle 1 nm <. İkinci olarak, sıvı numune yüzeyinde iyi tanımlanmış bir çözme manzara oluşturan Kullanılan. Makroskobik olarak, bu kabul örnek için bir 'ıslatma' sıvı gerektiren eşdeğerdir. Örneğin, su içinde hidrofobik grafit 42,51 göre daha hidrofilik mika moleküler seviyede çözünürlük elde etmek için daha kolaydır. Son olarak, ucu destekleyen konsolun yay sabiti uygun 52,53 seçilmelidir. Bu con çalışırkenaltyapıyı, AFM sadece arayüzü moleküler seviyede görüntüleri sağlamaz, aynı zamanda numunenin yüzeyi 54 hakkında kimyasal bilgi elde etmek için kullanılabilecek yerel numune-sıvı afinite hakkında bilgi elde eder.

sıvı içinde AFM için operasyonun en yaygın dinamik modlar genlik-modülasyonu (AM, aynı zamanda 'modu dokunarak') AFM ve frekans modülasyonu (FM) AFM vardır. Titreşim genliği sürekli uç-örnek mesafeyi yeniden ayarlayan bir geri besleme döngüsü ile sabit tutulurken İlk durumda 55, uç örneği raster tarar. Numunenin topografisini geri besleme döngüsü tarafından uygulanan düzeltme elde edilir. FM-AFM 28,41,56, bu uç örneği tararken sabit tutulur konsol / ucu salınım frekansı. Her iki teknik sıvı 36,57 karşılaştırılabilir topografik çözünürlüğü sağlar. uç-numune etkileşimi miktarının belirlenmesi daha STRAI olma eğilimindedirghtforward ve FM-AFM doğru, ancak AM-AFM, uygulamak için daha kolay, daha sağlam ve daha yumuşak konsol, kolayca deforme veya hassas örneklerin incelenmesi için yararlı bir şey ile çalışılmasına olanak verir. Anlamlı, AM-AFM kısmen tarihsel nedenlerle değil, aynı zamanda nedeniyle kontrol etmek teknik olarak daha kolay olmasından, AFM kullanıcıları arasında daha yaygındır.

genlik AM-AFM görüntüleme sırasında geri besleme döngüsü tarafından sabit tutulur olmasına rağmen, ucu salınım ve sürüş salınım arasındaki faz-lag serbestçe değiştirmek için izin verilir. Faz-lag numunesi 58 ile arayüzünde ucunun salınım sırasında harcanan enerji ile ilgili olan, ucu-numune etkileşimleri hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle faz-görüntüleme topografik görüntüleme eş zamanlı olarak elde edilebilir ve genellikle bir örnek yüzeyinin heterojenitesini vurgulayarak tamamlayıcısıdır. Faz görüntüleme di dahil etkileşimlerin çeşitli haritalama için kullanılmıştıryapışma enerjisi 42, viskoelastik özellikleri 58 ve bir arabirim 44 hidrasyon peyzaj rect haritalama.

Pratik, sıvı içinde yüksek çözünürlüklü görüntüler elde nedeniyle kontrol etmek için parametrelerin çok sayıda ve her durumda çalışan basit bir sistematik protokolün olmaması olmayan önemsiz kalır. Görüntü kalitesi genellikle diğerleri 55 arasında konsol geometri ve elastikiyet, uç kimya, titreşim genliği ve örnek sertliği bağlıdır. AFM ölçümleri tanımı gereği, sisteme pertürbatif, bulunmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, düzgün bir düşünce olmaksızın görüntüleme değişkenler ve çevresel şartların değiştirilmesi tekrarlanabilirlik ve / veya misrepresentative gözlemler ve yanıltıcı sonuçlar güçlüklere neden olabilir.

Burada, büyütülen işletilen ticari araçlar kullanarak, çözelti içinde sert ve yumuşak numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için bizim protokol mevcutitude-modülasyonu. Hedefimiz her durumda görüntüleme işlemi altında yatan fiziksel ilkeler bizim seçimler gerekçesini açıklayan farklı örnek üzerinde çözünürlük etkilemesi muhtemel ana parametreleri optimize etmek için pratik bir prosedür sunmaktır. Biz ayrıntı konsol seçimi, ayar görüntüleme parametreleri ve ortak sorunlarını giderme için yüzey temizliği ve hazırlığı bir adım-adım yaklaşımı,. yüksek çözünürlüklü bizim seçimler ve prosedürleri arkasında bilimsel gerekçesini açıklayan metodolojisini uyarlarken rasyonel seçimler yapmaya yardımcı ve görüntüleme roman sistemleri için bir başlangıç ​​noktası olarak hizmet etmelidir.

Bu metin boyunca biz AM AFM genlik modülasyonu çalışma moduna başvurmak için kullanın. Biz nominal değer olarak her iki konsol sapma (kontak modu) ya da salınım genliği (AM modu) sırasında geribildirim parametresi sabit tutulan bakın. AM modunda, konsol dışarıdan sürülürya bir akustik salınım veya darbeli lazerle konsolun dibinde duruldu. Sürücü genliği dış salınım sinyalinin yoğunluğudur. konsolun verilen bir salınım genliği elde etmek için gerekli sürücü büyüklüğünün mutlak değer gibi sürüş yöntemi (akustik, manyetik fototermal veya), konsol sabitleme ve parametreler (sertlik, geometri) ve lazer hizalama gibi birçok parametreye bağlıdır. Sürücü amplitüdü kesin değeri, bu nedenle ilgili değil, konsolun uygun bir (ve ölçülebilir) salınım amplitüdünün sağlayacak şekilde her bir deneyde ayarlanır. Tahrik konsol uzak numuneden ve onun titreşim sönümleme hiçbir ipucu-numune etkileşimleri yoluyla ortaya çıktığında, bunun salınım genliği serbest salınım genliği denir. titreşimli uç örnek yüzeyine yaklaştığında, onun genlik azalmaya başlar. geribildirim etkinse, z-piezo const olacakBu sabit, seçilen ayar noktası genliği salma kadar antly onun uzantısı yeniden ayarlayın. ayar noktası değeri, normal olarak serbest genlik her zaman daha küçüktür. Ücretsiz genlik üzerinde set oranı, set genlik oranı (görüntüleme genlik) başvurmak için yaygındır. set oranı daha küçük, sert görüntüleme koşullardır.

Protocol

Araçlar ve Diğer Yüzeyler 1. Temizleme

NOT: Yüksek çözünürlüklü hedefleyen zaman bulaşma şekli zararlı sonuçlar doğurabilir. Örnek, alt tabaka veya AFM ipuçları iyice temizlenir işlemek için kullanılan tüm araçları sağlamak için gereklidir. Aşağıdaki örnek aşamasında kendisi de dahil olmak üzere numune, konsol veya AFM hücresi ile temas edebilecek herhangi bir yüzey veya enstrüman (örneğin, cımbız) için de geçerlidir.

  1. 10 dakika süre ile tekrar saf su, ardından izopropanol (% 99.7 saflık), aşırı saf su içinde araçları (M 18.2, <5 ppm organik), her bir Banyo-sonikasyon. Mümkün olduğunda, duman solumaktan azaltmak için davlumbaz altında izopropanol kullanın.
  2. bir azot akışı altında kurutulur.
  3. Tam daldırma mümkün değilse (örn konsol tutucu / elektronik için) ultrapu batırılmış, tek katlı, az tüylü dokuları (hafif vergili dokular silecekler) ile silerek fiziksel temiz bir yüzeyesırayla, su, izopropanol ve ultra saf su yeniden. Yüzey (genellikle 15 ila 30 dakika içinde) havanın kurumasını bekleyin.

2. Yüzey Hazırlığı

NOT: Alt tabaka doğrudan tipik AFM tarayıcı ve numune hem fiziksel temas, örnekleri destekleyen katı yüzey belirler. En AFMs manyetik montaj ve çelik diskler kullanılabilir, ancak aynı protokol, aynı zamanda, cam slaytlar alt tabakalar için elverişlidir. Burada bir mika diski takılmış olduğu bir çelik diski varsayıyorum. Bu prosedürün amacı, görüntüleme etkileyebilir kontaminasyon bir dış kaynağa kadar sınırlamaktır. Eldiven her zaman giyilmelidir.

  1. 10 dakika boyunca, daha ultra saf su ile son olarak her iki izopropanol ve ardından saf su çelik örneği diski (18.2), Banyo-sonikasyon ve.
  2. bir azot akışı altında diskler kurutun.
  3. iyice karıştırılır reaktifler ve yer ile epoksi yapıştırıcı küçük bir miktar hazırlayın ~ 1081; çelik disk üzerinde l.
  4. Alt-tabaka üzerinde basınç uygulayarak çelik disk substratı (muskovit mika, SiO2 kristal, cam, vs.) yapıştırın. epoksi (üreticinin özelliklere bakın) yüksek bir sıcaklıkta birkaç saat kurumaya bırakınız.
  5. hiçbir epoksi doğrudan alt-tabaka kenarlarında, havaya maruz olduğundan emin olun. epoksi aşırı miktarda kullanılmakta ve bulaşma kaynağı haline gelebilir, bu olur.
    1. Bir mika substrat için, tüm yüz kaplıdır böylece sıkıca, alt tabaka üzerine ~ 2.5 cm genişliğinde yapışkan bandı basın ve sorunsuz soyun. hafif yapışkan bandı kullanın ve yüzeye paralel çekerek mika soyun. kaldırıldı malzeme bant görülebilir. mika ayna pürüzsüz göz olana kadar, bu işlemi 2-3 kez tekrarlayın.
    2. Daha fazla kimyasal yüzey modifikasyonu gerekli ise cam için / SiO2, adım 2.1-2.2 arasında banyo-sonication rutin tekrarlayın. Alternatif olarak, U kullanınV pozlama ünitesi gücüne bağlı olarak 30-60 dakika süreyle (18 W UV-C mikrop öldürücü lambalar),) yüzeyde kalabilir herhangi organik pirolize için. Bu prosedür, aynı zamanda önemli ölçüde pürüzlülüğü artırmadan yüzeyin daha fazla hidrofilik kılar.

Cantilever ve İpucu 3. hazırlanması

  1. saf su, ardından izopropanol banyosu içinde konsol çip, 60 dakika boyunca, her bırakın.
  2. Konsol / ucu (jel kutusunda uzun süre saklandıktan sonra, örneğin) geniş temizliğe ihtiyacı varsa, 1. adımda önce aseton içinde 30 dakika nemlendirici (>% 99.5 saflık) ekleyin (bölümüne de adresleme kontaminasyonu bakınız). Jel kutuları ipuçları depolama tecrübemizle, çok hızlı bir şekilde 59 oluşabilir kontaminasyon birincil kaynak birinde vardır.
  3. Istikrarlı hidrasyon siteleri 60 oluşumunu teşvik etmek için ışığı kısa bir süre (<5 dakika) UV ucu maruz. o ucu veya inc zarar verebilir gibi uzun overexposure süreleri kaçınınonun eğrilik yarıçapı artma.
  4. Görüntüleme çözeltisi 50 ul ~ AFM konsol tutucu ve pipet içine konsol yerleştirin (örnek bağlıdır çözeltisi doğası araştırılmaktadır, ama bu durumda, aşırı saf su içinde rubidyum klorür, 10 mM çözelti kullanın) dirsek üzerine ve o ıslak öncesi ucu; örnek yaklaşırken bu hava kabarcıklarının görünümünü sınırlayacaktır.

AFM Hücre 4. Set-up

  1. Numune sahneye örnek disk ve alt tabakayı takın ve görüntüleme bir sıvı damlacık (en yüksek noktada sıvı genellikle 2-3 mm kalınlığında) ekleyin.
  2. AFM için konsol tutucu bağlayın.
  3. Konsol / ucu numune üzerinde akışkanlar arasında bir kılcal köprü oluşturacak şekilde yakın ilişkiye de zorlamaktadır konsol ve örnek getirin.

5. Başlatma Ölçme ve Cantilever Kalibrasyon

  1. uç-e yakın ölçüm lazer (genellikle kırmızı) hizalayınkonsolun nd. AFM modeline bağlı olarak, yazılım denetimleri yoluyla veya lazer pozisyonunun manuel ayar yoluyla bunu. Sıvı içinde konsol termal spektrum elde (Şekil 1A bakınız). süreç konsol ana rezonans (temel eigenmode) sıklığını bulmak amacıyla, lazer kullanarak konsolun termal dalgalanmaları kaydeder. en modern AFM, bu yazılım kontrolleri otomatik prosedürler aracılığıyla yapılır, ancak ayrıntılar AFM gelen AFM değişebilir.

Şekil 1
Şekil 1: Tuning ve konsol kalibre. A: Temel eigenmode (kırmızı) bir basit harmonik osilatör (SHO) oturuş konsol dikey sapma (siyah) Termal gürültü spektrumu. Burada rezonans suda 18.7 kHz. İlk üç eğilme eigenmodlar karşılık gelen ilk üç rezonans frekansları Işıklı olanmavi oklarla ghted. B: Konsol en Ters Optik Kolu Duyarlılık Kalibrasyon. sert (deforme olmayan) yüzeyine karşı bastırılıp bu konsol doğrusal saptırma cinsinden ölçülen volt sapma ve nanometre karşılık gelen değeri arasında dönüşüm faktörü (InvOLS) ölçülmesi için kullanılır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

  1. Sert bir yüzeye (örneğin, mika veya cam) üzerinde konsol ile mesafe eğrisi bir saptırma kaydedin ve (Şekil 1B gibi) doğrusal sapma bölgede eğrisinin eğimi birlik 61 olduğunu empoze ederek saptırma kalibre - 63.
    Not: Bu işlem (volt cinsinden) photodetector ölçülen sapma arasındaki dönüşüm faktörünü bulur ve (nanometre) konsolun gerçek sapması - knoTers Optik Kolu Duyarlılık (InvOLS) olarak wn. Kalibrasyon ucu zarar verebilir, nedenle tüm ölçümler tamamlandıktan sonra yapılması daha iyidir. Kalibrasyon önce gerçek genlik tahmini (genellikle>% 90 doğru) almak için bir önceki deney sırasında aynı türde başka bir konsol için türetilmiş InvOLS değerini kullanın.
  2. Konsol yay sabitini elde etmek için 66 - bir basit harmonik osilatör modeli 64 ile termal spektrumunda rezonans tepe takın. Bu prosedür en AFM yazılımı otomatik olarak yapılır ve genellikle söz konusu modelin uzman bilgisi gerektirmez.
  3. Dinle konsol. Dışarıdan sürülen zaman konsolun genlik yanıtını bulun (örneğin, akustik veya fototermal uyarma) tarafından nominal rezonans frekansı yakın bir frekans aralığında. hafifçe sola, bu spektrumda maksimum yakın sürüş frekansı ayarlayın. Konsol acou isestically tahrik, birçok sahte maksimum zaman ayar görünebilir.
    1. olarak mümkün olduğunca yakın (ve zarfın içinde) AFM kontrol eden yazılım türü ve sürümüne göre farklılık gösterebilir AFM ancak ayrıntılarda kontrol yazılımı kullanarak termal spektrumunda tanımlanan rezonans bir rezonans tepe seçin.

6. Yaklaşım ve Numune Başlangıç ​​Kontrol

  1. serbest salınım genliği yaklaşık 5 nm böylece sürüş genlik ayarlayın. Bu genellikle en AFMs üzerinde 0.2-0.8 V karşılık (durumda InvOLS kalibre değildir). genlik ayar noktasını serbest genlik ~% 80 olarak ayarlayın.
  2. nispeten yüksek (mutlak değer AFM bağlıdır) geribildirim kazançları Set ancak istikrarsızlık ya da zil meydana emin olun.
  3. (~ 1 Hz ve 10 nm sırasıyla, örneğin), küçük değerlere ilk tarama hızı ve tarama boyutunu ayarlayın. Bu, bazı geribildirim parametreleri kötü ayarlanır halinde ucu korunmasına yardımcı olurBüyük mesafelerde tarama kaçınarak. Tarama boyutu, daha sonra tarama koşulları uygun görünüp görünmediğini daha büyük bir değere (örneğin, 100 nm) artırılabilir.
  4. yaklaşımının hemen öncesinde (bu, optik olarak yapılması gereken bazı durumlarda) yüzeyinin yaklaşık yüksekliğini belirler.
  5. AFM kontrol yazılımı kullanarak yüzeye ucun yaklaşımını başlatın. Bu sürecin ince ayrıntıları kullanılan AFM ve yazılım modeline bağlıdır.
    1. Yumuşak bir konsol kullanırken yaklaşımla sorunlar varsa, iletişim modunda yaklaşım yapmak. Bu durumda, kazanç AM modunda daha düşük olduğundan emin olun, ve bahşiş korumak için (photodetector lazer merkezleme sonra 0.1-0.2 V) nispeten düşük bir değere ayar noktasını ayarlayın.
    2. ucu hafifçe set değeri (kontak modu veya azalma AM modunda artış) değiştirerek görüntü başlatmadan yüzeye erişip. ucu yüzeyinde ise, t üzerindeki etkisio Z-piezo uzatılması ihmal olmalıdır. Z-piezo canlı hareketleri genellikle en AFM kontrol yazılımı grafiksel görüntülenir. nominal değer değişiminin piezo görünür bir hareket tetikler, bu bir yanlış meşgul olduğunu gösterir. İkinci durumda ise, biraz daha yüksek (temas) veya daha düşük (AM) ayar noktası kullanılarak, mevcut uç konumundan yaklaşım yeniden başlatın.
  6. uç yüzeyi ulaştığında, (basitçe 'dur' tuşuna basarak genellikle) Z-piezo geri çekin ve konsol retune (adımı yineleyin 5.4.); rezonans frekansı olasılıkla nedeniyle uç-numune etkileşimleri daha düşük bir değere kaymıştır olacaktır.
  7. set noktasını (bu uç-örnek mesafede) Yeni ayarlanan serbest genlik ~% 80 olarak değiştirin.
  8. Konsol Engage ve görüntüleme parametreleri uygun olduğunu doğrulamak için AM modunda yüzeyin bir 10 × 10 nm 2 tarama yapmak.
    1. (Soldan sağa tarama) iz ve (sol tarama hakkı) izini kontrol edinprofilleri üst üste. değil ayrıca eğer set değerini azaltmak ve kazancını artırmayı deneyin.
    2. Görüntü gürültülü hale gelirse kazançlar indirin.
  9. 1 × 1 mikron 2 × 5 mikron 2 ila 5 - - with a large işlemi tekrarlayın numunenin tarama bu mümkün sağladı. yumuşak veya biyolojik örnekler, bu uç bir kirlenme meydana gelebilir.

7. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme

  1. Özellikleri görselleştirmek için müsait bir değer tarama boyutu azaltılması (örneğin, 100 x 100 mil protein kristalleri 2 veya mika veya kalsit 20 x 20 mil 2).
  2. otomatik olarak Z-piezo ve dolayısıyla yüzeyden ucu geri çekilmesi için geri besleme döngüsü için yeterli konsolun sürücü genliği azaltın. konsol yüzeyinden uzağa iken konsol genliği, böylece ~ 1-2 nm (peak-to-peak) Sürücü genlik ayarlayın.
  3. AFM kontrol yazılımı kullanarak, gelişmişliğininZ-piezo yüzeye doğru tekrar uzanır ve orijinal görüntü kurtarıldı kadar ğı bir defada nominal değer mV birkaç on azaltır. % 75 ve yeni serbest genlik% 95 arasında set genliği tutun.
  4. AFM kontrol yazılımı kullanarak kazançları yeniden ayarlayın; daha yüksek kazanç önemli gürültü yol açmadan daha düşük amplitüdlerde kullanılabilir.
    1. ücretsiz genlik, set değeri en iyi kombinasyonu belirlemek ve yüksek çözünürlüklü kazanmak amacıyla adımlar 7.2-7.4 tekrarlayın. optimum şartlar numune (çözme manzara ve sıvının ıslatma özellikleri) değil, aynı zamanda dirsek (sabit yay, sertlik) bağlıdır.
    2. görüntüleme koşulları optimize etmek için genlikleri farklı kombinasyonları keşfedin. Yine ücretsiz genliği 42 artırmak için gerekli olabilir. Böyle bir durumda, ilk daha yüksek bir değere ayar noktası ayarlamak ve sonra sürücüyü (genlik azaltmak için kullanılan daha, yani ters prosedürü) artar.
    3. setpoi tutmak0.5 nM ila nt amplitüd - 1.5 mil (tepe noktası) ayar noktası oranları (genellikle 0.75-0.95) 0.7 üzerinde tutulmalıdır. 2 N / m - solvophilic arabirimler için, 0.5 'lik bir yay sabiti ile konsol kullanımı. Bu yüzey çarpmadan ara yüzey sıvının bir kısmının çıkarılması için uç için yeterlidir. Dikkat etmeniz gereken bir kural denklem önerilmiştir. Referans 29 4.

Representative Results

Önceki bölümde tarif edilen protokolü başarılı bir şekilde Molecular ya da atomik düzey görüntü elde etmek için çeşitli ticari AFMS ile uygulanmıştır. Tüm görüntüler tek tek prosedürü izleyerek düzeltilmiş 0.5 nm ve 1,5 nm arasında çalışan genlikleri ile elde edilmiştir 7.1-7.4 adımları tekrarlayın. Sonuçlar, yumuşak (Şekil 2) ve katı (Şekil 3) bir numune, geniş bir aralık içinde elde edilebilir. Her iki durumda da, ilgi konusu özellikler vurgulanır. Tekniğin en büyük avantajlarından biri, küçük salınım amplitüdleri ve yüksek ayar noktaları lipidler (Şekil 2A), protein (Şekil 2B, D) kırılgan kendini montajları sağlar, örnek ucu tarafından uygulanan kuvveti en aza indirmek ve bu bir amfifilik moleküller (Şekil 2C) çözeltisi içinde bir zarar vermeden, görüntülenecek. Bu mineraller (Şekil 3A, B, D) ve benzeri gibi sert kristalimsi maddelerbir yüzey (Şekil 3C) üzerinde adsorbe tek bir metal iyonları, her bir durumda, etkin tarif edilen protokol ile görüntülenmiş olan arayüzey sıvı için bir yaklaşım kullanılarak görüntülenebilir. Çözünme kuvvetleri Şekil 2 ve 3 gösterilen örneklerde karşılaştırılabilir: Tüm numuneler (daha genel olarak Şekil 2C'de 3B, 3D durumunda "solvophilic") görüntüleme çözeltisine göre hidrofiliktir. Sürekli, karşılaştırılabilir sertliği ile dirsekleri (0,2-0,8 N / m) tüm olgularda kullanıldı. Örnek ve uç Hem sıvı moleküllerinin görüntülenebilir iyi tanımlanmış bir çözme yapı oluşturmak sağlamak için solvophilic olmalıdır. Bu her zaman yeterli bir koşul değildir, ancak çoğu durumda ve nispeten küçük sıvı molekülleri, örnek simetri taklit eden bir şekilde sıvı yeniden yapıları kendisi. yüksek çözünürlüklü ana sürücü adsorbe çözücü moleküllerinin afinite yerel varyasyon(Şekiller 2A, 3A, 3C halinde Ångström ölçekli) yüzeyler için. Solvent yapı yüzeyi boyunca büyük ölçüde değişir nereye teknik nedenle iyi malzeme için uygundur.

şekil 2
Şekil 2: sulu çözeltilerde AM-AFM tarafından görüntülendi Yumuşak arayüzleri. C: jel fazında dipalmitoil-fosfatidilkolin (DPPC), lipid iki katmanlı, 150 mM KCl görüntülenmiştir. altıgen dolu lipid ana grupları hidrasyon site-spesifik çeşitlerini gösteren yerel kontrast ile birlikte, topografya ve faz hem de ayırt edilebilir. B: 150 mM KCI, 10 mM Tris, pH 7.4 görüntülenmiştir halobakteriyum salinarumun Mor membranlar. Birkaç bakteriyorodopsin protein trimerler vurgulanır. Faz nedeniyle proteinler üzerinde yerel hidrasyon sitelerine topografyası farklı bir kontrast sergiliyor. Bireysel protein trimerler dışarı yapılabilir (kesik çizgiler). C: Bir boya hassas güneş pili olarak, bir TiO2 nanopartikül yüzeyinde adsorbe Amfifilik boya (Z907) moleküller. Görüntü etil-izopropil sülfon elde edilmiştir. Sünger benzeri bir görünüm adsorbe boya molekülleri tarafından oluşturulur. D: B. Bir aquaporin tetramer aynı tamponda görüntülü yerli sığır lens zarlarında Aquaporin kristal vurgulanır. Faz nedeniyle protein yakın alışılmadık su davranışına çarpıcı farklı kontrast gösterirken arası sarmal döngüler karşılık gelen alt yapı topografya görülebilir. Çıkan sayılı referanslarda 36 (B) 'ref 38 (C) ve ref 67 (D) uyarlanmıştır. Ölçek çubuğu renk ölçeği, sırasıyla 200 pM ve 15 ° (A), 600 yüksekliği ve faz değişimi gösterir 5 mil (A), 10 mil (B), (C) 3 nm ve 15 nm (D) PM 4 ° (B), 2.5 nm ve 2.5 ° (C) ve 1.6 nm ve 9.5 ° (D).yük / 54924 / 54924fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: akışkan çözümlerinde sert numunelerin Temsilcisi AM-AFM görüntüleri. A: Kalsit kristal [ Equation2 Bir dengelenmiş ultra saf su çözeltisi içinde görüntülü] yüzey. B: stronsiyum titanat dimetil sülfoksit (DMSO) 'de elde edilen görüntüsü alınmıştır. Yüksek çözünürlüklü suda mümkün değildi. C: 3 mM RbCl görüntülü Moskof mika - tek adsorbe Rb + iyonları hem faz ve yükseklik taramaları mika en kafes sitelerinde görebilir. D: DMSO görüntülü olarak Silisyum karbür. Beklenen kristalografik düzenlemeler resim B'de gösterilmektedir ve D ve görüntüler, Ref 68 (A) ref 42 (B ve D) uyarlanmıştırve ref 44 (C). ölçek çubuğu 3 mil (A, B, D) ve 5 nm (c) 'dir. renk skalası sırasıyla 250 pm ve 14 ° (A), 600 pm ve 5.5 ° (B), 800 pm ve 15 ° (C) ve 500 pm ve 3.5 ° (D) bir yükseklik ve faz değişimi gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Görüntüleme ve sıvı konsol sertliği uygun şekilde seçilmiştir varsayarsak, başarılı yüksek çözünürlükte elde etmek için en kritik adımlar görüntüleme genlik ayarı ve incelenen sistemin genel temizlik vardır.

Arayüzey sıvı bölge (tipik olarak en az 2 mil) kalınlığı ile karşılaştırılabilir genlikleri ara yüzey çözücü 42 özelliklerinde özellikle değişik probes. Salınım genliği çok büyükse, titreşimli ucu konsol hareket istikrar engel ve kaçınılmaz olarak çözünürlükte bozulma ile sonuçlanan, ne olursa olsun görüntüleme koşulları 29 örnek isabet uzun menzilli, doğrusal olmayan kuvvet alanları 52 erişir. Kenara çözünürlükte kaybı, yüksek harmonikler ucu hareket görünmeye başlar ve sistem 55 model daha karmaşık hale gelir. Alternatif olarak, görüntüleme genliği ise çok küçük oarayüzü nly kısmı (ara yüzey sıvı, tipik olarak belirli bir kat) incelenir ve sabit görüntüleme yalnızca sert konsol ile elde edilebilir riski ile tatmin edici bir sinyal-gürültü oranı için (> Su 53, 10 N / m), büyük boy varyasyonları üzerinde zarar yumuşak örnekleri. sert konsollar için ihtiyaç küçük genlikli çalışırken ölçülen sinyal, ucu ve numune arasındaki uzun menzilli etkileşimleri hala mevcut, ama büyük ölçüde sabittir ve etkilemez daha önemli hale gelebilir termal gürültü üstesinden gelmektir elde edilen görüntülerde yüksek çözünürlüklü kontrast.

yüksek çözünürlüklü AFM geldiğinde görüntüleme ortamının Temizlik büyük önem taşımaktadır. sistemde istenmeyen bileşikler görüntüleme ve kuvvet spektroskopi hem engelleyebilir. deneyler etkileme eğilimindedir kontaminasyon iki ana kategorisi vardır: (i) kirletici doğrudan görünür görüntüleme sırasında ( (Şekil 4A) karşı tezat su mika arayüzünde olduğu gibi son derece idealize sistemlerde meydana eğilimindedir. ucu ve örnek değiştirmeden önce, etkili defalarca sert numune karşı ucu basarak, büyük bir sapma ile spektroskopik eğrileri elde değer. Bu normalde yeni bir ipucu zarar verecek, ama bazen kirli ucunun temizlenmesi veya görüntüleme için uygun istikrarlı hidrasyon siteleri neden olabilir. Bu ipucu, ancak kaçınılmaz körelmiş olması ve dolayısıyla görüntü geliştirir bile düz numune için sadece uygun olacaktır. sert numuneler üzerinde şüpheli bulaşma durumunda, yukarıda açıklanan biraz yıkıcı prosedür başlamadan önce konsolun ikinci eigenmode ile görüntü denemeye değer olabilir. Bu sadece sw gerektirirİkinci eigenmode sürüş frekansı kaşıntı ve genlik / set değeri (aşağıdaki sorun giderme tartışmaya bakınız) tekrar ayarlanmasına. İkinci eigenmode işletilen ve herhangi bir zayıf adsorbe kirletici görüntüleme sırasında ucuyla itti olabilir ölçüde konsol artar etkili sertlik. Bu strateji, temiz numune ve bahşiş ihtiyacını yerine, ama bir ipucu / örnek açıkça ideal değildir zaman tatmin edici görüntüler elde etmek için biraz daha fazla yollar sunuyor değildir.

Şekil 4,
Şekil 4: yüksek çözünürlüklü görüntüleme inhibe muskovit mika görüntüleme sırasında gözlenen kirlenme örnekleri. A: Mika 5 mM RbCl görüntülü - hiçbir kirletici partikülleri görebilir. B: Kirlilik sözde ultra saf su içinde görüntüleme sırasında karşısında nm onlarca düzenin agrega şeklini alarak. C: contami tarafından oluşturulan Öz-monte yapılardoğada, muhtemelen amfifilik nant parçacıklar. Görüntüleme daha nominal ultra saf su içinde gerçekleştirilmiştir. D: Mika en atomik düz bir yüzey sapma gösteren A, B ve C kesikli çizgilerle karşılık gelen dikey ofset bölümleri. A, B ve C Ölçek çubukları 300 nm'ye karşılık gelmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Olgu (ii) daha sık ve alt nanometre özellikler sadece ne olursa olsun görüntüleme koşulları, çözülemez sinir bozucu gerçeği ile ağırlıklı olarak karakterizedir. Bu tür durumlar imzası bazı tutarsızlıkları gösterme eğilimindedir kuvvet spektroskopisi ölçümünde genellikle görülebilir. Bunlar önemli ölçüde tipik sigmoid şekil 42 sapma mesafe eğrileri vs kötü tekrarlanabilir eğrileri ve genlik içerebilir. iyonik veya başka kirletici, eğer, dispers vardıred homojen sıvının boyunca, onlar topografik görüntülemede görünmeyebilir ama düzenli bir ucu numune etkileşimi 29 sürdürmek ve yüksek çözünürlüklü 70 elde etmek için çok önemlidir numunenin 69, hidrasyon yapısını bozabilir. aynı zamanda, özellikle yumuşak ve biyolojik deneyler örnek kirletici maddelerin doğrudan etkileri olabilir. Alt nanometre düzeyinde çözünürlük imkansız hale, 73 - Örneğin, iyi (temizlik prosedüründen) alkoller varlığı jel faz lipid iki katmanlı 71 sıvılaştırmamah bilinmektedir. yüksek çözünürlüklü mümkün değilse, bakımı ilk görüntüleme çözeltisi ile temas herhangi bir ekipman, özellikle odaklama, temizleme işleminde alınmalıdır. Tam tedavi edilmezse, epoksi reçine gibi da görünürde sabit bileşikler bir dereceye kadar sıvı içinde solvat olabilir.

AM-AFM ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme, zorlu bir sabır gerektirir veMümkün olan en iyi görüntüleme koşulları ulaşmadan önce genellikle birkaç denemeler. Küçük deneysel konular kolayca kadar önemli hale gelebilir yüksek çözünürlüklü ve sorun çözme becerileri gereklidir önlemek için. Bundan sonra biz bizim önerilen çözüm ile karşılaşılan en yaygın sorunlardan bazılarını şöyle sıralayabiliriz.

konsol ayarlama

Çoğu ticari AFMs konsol sürücüye akustik uyarma kullanın. Adım 5.4'de tarif edildiği gibi rezonans frekansı çoğu zaman hava kullanım için yeterli bir performans sağlar yakınındaki Bu durumda, konsol ayarlama. Sıvı ortamlarda sıvı gibi konsol çipi ve tutucu olarak AFM farklı mekanik parçaları arasında bazı bağlantıyı ikna etmek eğilimindedir. Bu genellikle yaygın bir "doruklarına orman" olarak tanımlanan çok keskin zirveleri ve vadiler sergileyen bir konsol frekans spektrumu ile gösterilen konsolun belirgin rezonans, etkileyebilir. Bunun bir sonucu olarak, karşılık gelerek bulmak genellikle zordurct sürücü frekansı. Bu tepeler aynı zamanda gaz ortamlarında bulunabilecek, fakat konsolun kalite faktörünün yüksek bir değere, rezonansları de genlik 74,75 ölçüde büyüktür. sıvı içinde konsol sürücüye uygun tepe seçilmesi kolay değil olabilir ve deneme yanılma gerektirebilir. Uygulamada, rezonans frekansı etrafında "zirveleri orman" genlik eteklere varyasyon ile frekans pik genellikle rezonans ve genellikle yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için yeterli bir sürüş frekansı sağlar mutlaka tam olmasına rağmen iyi bahistir.

görüntü bozulma

Görüntüleme sürüklenme genellikle yüksek çözünürlüklü isteyen bir konudur ve görüntüler bozuk (tipik gergin) görünmesini sağlar. Kökeni tarayıcı / AFM denge işletim sıcaklığına ulaştığında değil çünkü, ya da numune sıvının bir parçası hızla buharlaşan çünkü (örneğin, görüntüleme alkoller ya, genelde termal olduğunu ). Her durumda, sürüklenme termal denge durumunda ihmal edilebilir. Örnek mümkünse sıcaklığını saptamak faydalıdır. Aksi takdirde, deney yapmadan önce birkaç saat (yavaş tarama hızında büyük boy tarama) boş bir örnek tarama AFM bırakarak değer. Buharlaşma bir sorun değilse, bu işlem en iyi ilk bir uca yüzeyinden kısa bir mesafe (örneğin, 20 mikron) çekilme özen prosedürün 6. adımında sonra yapılır. Bazen, sürüklenme bile geniş termalizasyon sonra kalacaktır. Bu genellikle konsol ya da çip kısmen örnek sürükleyerek olduğunu gösterir iken görüntüleme gibi ince filmler olarak veya uç / konsol / yonga uygun yer değilse, yumuşak yapışkan örnekleri üzerinde olabilir bir şey. bilgisayar birden fazla konsol / uç, kullanımda olmayan ziyade onları yüzey üzerinde sürüklemesine izin konsol kırmak için genellikle yararlıdır cips.

İyonik güç

görüntüleme Arayüzey sıvı hakim olduğundan ntent ">, bu. su içinde yüklü yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görüntüleme için biraz tuz eklemek için bazen yararlı tuz rolü iki yönlüdür. Birincisi, hidrasyon manzara değiştirir genellikle kontrastı adsorpsiyon üzerine görüntülü yüzey. İkincisi, bu. genellikle, daha büyük iyonları potasyum, rubidyum ve sezyum nedeniyle özel hidrasyon özellikleri daha iyi görüntü sağlayan (mika, örneğin) ucu ve numune arasındaki ekran güçlü elektrostatik etkileşimler olur 76 ve genellikle benzersiz bir hidrasyon durumuna 77 ağırlıklı olarak adsorbe olması.

Kötü konsol / ucu

(yukarıda tarif edilen belirtilerle) dirsekli bir kirlenme kaynağı olduğu şüphesi varsa, ilk bir optik mikroskop altında kontrol edilmelidir. Bir jel kutusunda saklanan varsa, konsol jel polimerler veya görünebilir silikon yağı 59 izleri pick up olabilirAşırı durumlarda, koyu noktalar gibi, çıkıntı arkasındaki (Şekil 5A'da olduğu gibi). konsol fototermal salınımı benzer noktalar uyarabilir, ancak sürüş lazer tarafından konsol kaplamanın bozulması / aşırı ısınma nedeniyle vardır. Kirlenme için konsol rastgele görünür eğilimindedir. saf su ile daha sonra izopropanol ve birlikte daha uzun (12 saat) temizlik, konsol herhangi bir istenmeyen partikülleri kaldırabilirsiniz.

Şekil 5,
Şekil 5, yeni bir konsol ve uzun bir süre için bir jel kutusuna sert yüzeylerde yaygın olarak kullanılır ve bırakılmış özdeş bir karşılaştırılması. A: Üst; (Yordama bakın) temizlenmiş yepyeni konsolun optik görüntü. Alt; Jel kutusundan görünür kirlenme görünümünü (mavi ok) gösteren optik görüntü. B: dirseklerin 'kendi termal spektrumları karşılaştırılması.Eski konsol ilk rezonans zirve genişletilmesi açıktır (yeşil ok) ve bazı üst düzey modları (mavi ok) geliştirilmiştir. Spectra dikey ofset ve netlik için bir log-log ölçeğinde sunulmuştur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Gerekli alt nanometre çözünürlük elde değilse, düşük çözünürlükte kabul edilebilir görüntüleri rağmen, AFM ucu kimyasal depolama ortamına sırasında değiştirilmiş haline gelmiştir olması mümkündür. Bu uç 60, hidrofilik bir yüzey gruplarının oluşumunu yardımcı 120 saniye için bir ultraviyole oksitleyici için dirsekli çip maruz bırakılarak muamele edilebilir. Bakım uç geometrisi ve UV gücüne bağlı olarak değişebilir Gerekli olan tam zaman gibi, ancak alınmalıdır ve aşırı maruz kalma ucu ve indirgenmiş çözünürlük köreltme ile sonuçlanabilir.

Termal gürültü </ P>

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme yürürlükte varyasyonlar ve mesafeler (genellikle alt pN güçleri ve alt Ångström 78 mesafeler) büyük hassasiyet gerektirir. yumuşak konsollar için, nedeniyle içsel Brown hareketi (termal titreşim) ile konsolun termo-mekanik hareket bir sorun olabilir. Ilk yaklaşımda, sertlik k bir konsol ile, daha küçük özellikleri ölçmek mümkün değildir Equation1 K B Boltzmann sabiti ve T sıcaklığı termal gürültü, genliği. Pratikte, yüksek rezonans frekansları ile konsol kullanarak daha geniş bir frekans aralığında ses yayılır ve ölçüm bant genişliği 79 genel gürültü seviyesini azaltır.

Yüksek eigenmode görüntüleme

Bazen ikinci eigenmode de konsol çalıştırmak için yararlı olabilirartış etkili sertlik nedeniyle (bulaşma tartışmaya bakınız). Pratikte, bu ikinci eigenmode de konsol sürüş basitçe yapılır (yüksek frekansta ikinci rezonans zirveye, Şekil 1A bakınız). konsol ayarlarken, sadece yerine ana rezonans ikinci eigenmode seçin ve 5,4 adıma geçin. Konsol ikinci eigenmode tahrik edildiğinde InvOLS farklı olacağını unutmayın; tipik bir dikdörtgen konsol için adım 5.2 ölçülen InvOLS arasında ~ 1/3.

tekniğin ana sınırlama o numunenin yüzeyinde kararlı bir çözme manzara gerektirir. Örnek numunenin kendisinin önemli deformasyon yaratmadan arayüzey sıvı perturbing izin vermek için yeterince sağlam olmalıdır. Bu çok yumuşak ve kararsız örnekleri gibi büyük biyomoleküllerin üzerinde zor olabilir. Ayrıca, küçük genlikli AFM p ile ilgili mekanik bilgi alamıyor burada açıklandığı gibiBir örnek zellikler, konsol ucu ara yüzey sıvısında zamanının çoğunu geçirdiği gibi. Bunun için, tür Kantitatif Nanomekanik Haritalama 80 gibi diğer yaklaşımlar kullanabilir veya konsol hareket yüksek harmonik faydalanmak için yararlı olabilir. 83 ve aynı zamanda bir topografya ve örnekler 25,81 sertliğini sağlayabilir - - (düşük kalite faktörleri) sıvısında 29,81 görüntülerken, belirli daha yüksek harmonicas genel geliştirilmiştir 84, ancak genellikle yüksek bir çözünürlüğe zararlıdır. tüm tarama probu mikroskopi teknikleri doğasında diğer sınırlamalar, özellikle burada hala sonuçlar kaçınılmaz ölçüm ucu hakkında bilgi içeren gerçeği geçerlidir. Küçük genliklerinin kullanımı aynı zamanda büyük yüksekliği varyasyonları ile numuneler için ideal değildir; yükseklik değişimleri görüntüleme genlik daha büyük olduğunda geri besleme döngüsü kaçınılmaz dolayısıyla örnek ve ucu zarar verme riski, daha yavaş tepki verecektir. kullanımı için of yumuşak konsol belli bir ölçüde bu sorunu azaltır.

Burada sunulan yöntemin en önemli avantajı makinenin gürültü seviyeleri yeterince düşük olması koşuluyla, sıvı AFM ile mümkün olan en yüksek görüntü çözünürlüğü sağlar, ancak herhangi bir ticari AFM üzerinde uygulanabilir olmasıdır. Ticari araçlara ilişkin karşılaştırılabilir çözünürlük genellikle sert konsol FM-AFM zaman zaman temas modunda elde tutulur. AM modunda ve nispeten yumuşak dirseklerin ile çalışan örneklerin daha geniş bir seçim sağlar ve çoğu sistemde FM-AFM daha uygulamak daha kolaydır. yaklaşım çözünürlüğünü artırmak ve yerel kimyasal bilgiyi elde etmek için herhangi bir katı ve sıvı arasındaki arayüzde mevcut çözme güçlerini istismar dayanmaktadır. Bu prensipte sadece havanın nem nedeniyle çoğu yüzeyde kadar bina su katmanları (tipik olarak birkaç nanometre kalınlığında) dayanarak, ortam koşullarında kullanılabilir. temel ilkeleryüksek çözünürlüklü stratejisi değişmeden kalır ama ucu en uç apeks ve örnek 85 arasındaki tek bir kılcal köprüsü ile, havada. Yüksek çözünürlüklü bu koşullar 86,87 sert numuneler üzerinde kanıtlanmıştır. görüntüleme koşulları nedeniyle konsol en salınım daha yüksek bir Q-faktörü dalmış sıvının daha ancak farklıdır. Pratik, biz zor muhtemelen nedeniyle kılcal köprünün geçici değişikliklere, yumuşak ya da düzensiz numuneler üzerinde dengeli çalışmasını sağlamak bulundu ve belirli bir konsol sertlik Q-faktörü artmıştır.

Burada tarif edilen bir protokol en modern ticari AM-AFMS sıvı içinde örneklerin moleküler seviyede çözünürlüklü görüntüler elde etmek için bir yöntem sunmaktadır. Biz görüntüleme parametrelerinin bizim seçim ardındaki bilimsel mantığı sağlamak ve çözme güçlerinin rolünü vurgulamaktadır. Biz de ortak sorunları ve özellikle kontaminasyon tartışır. Belirli ucu örnek etkileşimleri can önemli ölçüde görüntüleme çözümü, konsol geometrisi ve malzeme ve örnek kimyası içeriğine bağlı olarak değişir. Tarama sırasında mevcut egemen güçlerin doğası pratik bir anlayış, yeni sistemlere bu protokolü adapte ve güvenilir sonuçlar elde etmek elzemdir. Optimize edilmiş, deneysel yaklaşım çözeltisi içinde in-situ örneklerinin yerel moleküler düzeyde anlayışlar kazanmak için güçlüdür.

Acknowledgments

Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi Fon (hibe 1452230 ve EP / M023915 / 1), Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi ve Avrupa Konseyi (FP7 CIG 631186) müteĢekkiriz (BB / M024830 / 1 hibe).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multimode IIIA AFM Brucker NA One of the machine used
Cypher ES AFM Asylum Resarch NA One of the machine used
AFM cantilever/tip Nanoworld Arrow UHF-AUD best for high frequency
AFM cantilever/tip Olympus RC800-PSA versatile and cheap
ultrapure water Milipore NA lab filtering systems can induce contamination
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aaldrich 200-664-3  standard chemical, no further purification
Monovalent salts Sigma-Aaldrich standard chemical, no further purification
Lipids Avanti Polar Lipids lipid bilayers formed using stadard protocols
Crystals MTI polished crystals
Scotch tape 3M Scotch Magic Tape Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical mapping of single membrane proteins at submolecular resolution. Nano Lett. 11 (9), 3983-3986 (2011).
  3. Payam, A. F., Ramos, J. R., Garcia, R. Molecular and nanoscale compositional contrast of soft matter in liquid: interplay between elastic and dissipative interactions. ACS Nano. 6 (6), 4663-4670 (2012).
  4. Grandbois, M. How Strong Is a Covalent Bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
  5. Oesterhelt, F. Unfolding Pathways of Individual Bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), 143-146 (2000).
  6. McLean, R. S., Doyle, M., Sauer, B. B. High-Resolution Imaging of Ionic Domains and Crystal Morphology in Ionomers Using AFM Techniques. Macromolecules. 33 (17), 6541-6550 (2000).
  7. Scheuring, S., Reiss-Husson, F., Engel, A., Rigaud, J. L., Ranck, J. L. High-resolution AFM topographs of Rubrivivax gelatinosus light-harvesting complex LH2. EMBO J. 20 (12), 3029-3035 (2001).
  8. Novoselov, K. S., et al. Two-dimensional atomic crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (30), 10451-10453 (2005).
  9. Freeman, M. R., Choi, B. C. Advances in magnetic microscopy. Science. 294 (5546), 1484-1488 (2001).
  10. Bockrath, M., et al. Scanned Conductance Microscopy of Carbon Nanotubes and λ-DNA. Nano Lett. 2 (3), 187-190 (2002).
  11. Oliver, R. A. Advances in AFM for the electrical characterization of semiconductors. Reports Prog. Phys. 71 (7), 076501 (2008).
  12. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6 (1), 1-7 (1995).
  13. Majumdar, A., Carrejo, J. P., Lai, J. Thermal imaging using the atomic force microscope. Appl. Phys. Lett. 62 (20), 2501 (1993).
  14. Vezenov, D. V., Noy, A., Ashby, P. Chemical force microscopy: probing chemical origin of interfacial forces and adhesion. J. Adhes. Sci. Technol. 19 (3-5), 313-364 (2005).
  15. Gerber, C., Lang, H. P. How the doors to the nanoworld were opened. Nat. Nanotechnol. 1 (1), 3-5 (2006).
  16. Bharat, B. Encyclopedia of Nanotechnology. , Springer Netherlands. Dordrecht. (2012).
  17. Giessibl, F. J. Subatomic Features on the Silicon (111)-(7x7) Surface Observed by Atomic Force Microscopy. Science. 289 (5478), 422-425 (2000).
  18. Haugstad, G. Atomic Force Microscopy. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2012).
  19. Moreno-Herrero, F., Colchero, J., Gòmez-Herrero, J., Barò, A. M. Atomic force microscopy contact, tapping, and jumping modes for imaging biological samples in liquids. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 69 (3), Pt 1 031915 (2004).
  20. Gan, Y. Atomic and subnanometer resolution in ambient conditions by atomic force microscopy. Surf. Sci. Rep. 64 (3), 99-121 (2009).
  21. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
  22. Picco, L. M., et al. High-speed AFM of human chromosomes in liquid. Nanotechnology. 19 (38), 384018 (2008).
  23. Fantner, G. E., et al. Components for high speed atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 106 (8-9), 881-887 (2006).
  24. Garcia, R., Herruzo, E. T. The emergence of multifrequency force microscopy. Nat. Nanotechnol. 7 (4), 217-226 (2012).
  25. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat. Nanotechnol. 6 (12), 809-814 (2011).
  26. Fukuma, T., Higgins, M. J., Jarvis, S. P. Direct imaging of individual intrinsic hydration layers on lipid bilayers at Angstrom resolution. Biophys. J. 92 (10), 3603-3609 (2007).
  27. Higgins, M. J., et al. Structured water layers adjacent to biological membranes. Biophys. J. 91 (7), 2532-2542 (2006).
  28. Kobayashi, K., Oyabu, N., et al. Visualization of hydration layers on muscovite mica in aqueous solution by frequency-modulation atomic force microscopy. J. Chem. Phys. 138 (18), 184704 (2013).
  29. Voïtchovsky, K. Anharmonicity, solvation forces, and resolution in atomic force microscopy at the solid-liquid interface. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 88 (2), 022407 (2013).
  30. Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat. Nanotechnol. 3 (5), 261-269 (2008).
  31. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Di Cerbo, A., Caramaschi, T., Facci, P. What do we really measure in AFM punch-through experiments on supported lipid bilayers. Soft Matter. 7 (15), 7054 (2011).
  32. Schmidt, S., Biegel, E., Müller, V. The ins and outs of Na(+) bioenergetics in Acetobacterium woodii. Biochim. Biophys. Acta. 1787 (6), 691-696 (2009).
  33. Bippes, C. A., Muller, D. J. High-resolution atomic force microscopy and spectroscopy of native membrane proteins. Reports Prog. Phys. 74 (8), 086601 (2011).
  34. Chada, N., et al. Glass is a Viable Substrate for Precision Force Microscopy of Membrane Proteins. Sci. Rep. 5, 12550 (2015).
  35. Möller, C., Allen, M., Elings, V., Engel, A., Müller, D. J. Tapping-mode atomic force microscopy produces faithful high-resolution images of protein surfaces. Biophys. J. 77 (2), 1150-1158 (1999).
  36. Antoranz Contera, S., Voïtchovsky, K., Ryan, J. F. Controlled ionic condensation at the surface of a native extremophile membrane. Nanoscale. 2 (2), 222-229 (2010).
  37. Kumaki, J. Observation of polymer chain structures in two-dimensional films by atomic force microscopy. Polym. J. 48 (1), 3-14 (2015).
  38. Voïtchovsky, K., et al. In Situ Mapping of the Molecular Arrangement of Amphiphilic Dye Molecules at the TiO Surface of Dye-Sensitized Solar Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 10834-10842 (2015).
  39. Segura, J. J., et al. Adsorbed and near surface structure of ionic liquids at a solid interface. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (9), 3320-3328 (2013).
  40. Hayes, R., Warr, G. G., Atkin, R. Structure and Nanostructure in Ionic Liquids. Chem. Rev. 115 (13), 150601082109009 (2015).
  41. Fukuma, T., Kobayashi, K., Matsushige, K., Yamada, H. True atomic resolution in liquid by frequency-modulation atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 87 (3), 034101 (2005).
  42. Voïtchovsky, K., Kuna, J. J., Contera, S. A., Tosatti, E., Stellacci, F. Direct mapping of the solid-liquid adhesion energy with subnanometre resolution. Nat. Nanotechnol. 5 (6), 401-405 (2010).
  43. Siretanu, I., et al. Direct observation of ionic structure at solid-liquid interfaces: a deep look into the Stern Layer. Sci. Rep. 4, 4956 (2014).
  44. Ricci, M., Spijker, P., Voïtchovsky, K. Water-induced correlation between single ions imaged at the solid-liquid interface. Nat. Commun. 5, 4400 (2014).
  45. Kiracofe, D., Raman, A. On eigenmodes, stiffness, and sensitivity of atomic force microscope cantilevers in air versus liquids. J. Appl. Phys. 107 (3), 033506 (2010).
  46. San Paulo, A., Garcìa, R. High-resolution imaging of antibodies by tapping-mode atomic force microscopy: attractive and repulsive tip-sample interaction regimes. Biophys. J. 78 (3), 1599-1605 (2000).
  47. Garcìa, R., San Paulo, A. Attractive and repulsive tip-sample interaction regimes in tapping-mode atomic force microscopy. Phys. Rev. B. 60 (7), 4961-4967 (1999).
  48. Butt, H. J. Electrostatic interaction in atomic force microscopy. Biophys. J. 60 (4), 777-785 (1991).
  49. Israelachvili, J. N. Intermolecular and Surface Forces. Intermol. Surf. Forces. , (2011).
  50. Yu, C. -J., et al. Order in molecular liquids near solid-liquid interfaces. Appl. Surf. Sci. 182 (3-4), 231-235 (2001).
  51. Ortiz-Young, D., Chiu, H. -C., Kim, S., Voïtchovsky, K., Riedo, E. The interplay between apparent viscosity and wettability in nanoconfined water. Nat. Commun. 4, 2482 (2013).
  52. Patil, S. V., Hoffmann, P. M. Small-Amplitude Atomic Force Microscopy. Adv. Eng. Mater. 7 (8), 707-712 (2005).
  53. Fukuma, T., Jarvis, S. P. Development of liquid-environment frequency modulation atomic force microscope with low noise deflection sensor for cantilevers of various dimensions. Rev. Sci. Instrum. 77 (4), 043701 (2006).
  54. Burkhardt, M., et al. Concept of a molecular charge storage dielectric layer for organic thin-film memory transistors. Adv. Mater. 22 (23), 2525-2528 (2010).
  55. Garcìa, R. Amplitude Modulation Atomic Force Microscopy. , Wiley: Weinheim. (2010).
  56. Uchihashi, T., et al. Quantitative force measurements in liquid using frequency modulation atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 85 (16), 3575 (2004).
  57. Yamada, H., et al. Molecular Resolution Imaging of Protein Molecules in Liquid Using Frequency Modulation Atomic Force Microscopy. Appl. Phys. Express. 2 (9), 095007 (2009).
  58. Stark, M., et al. From Images to Interactions: High-Resolution Phase Imaging in Tapping-Mode Atomic Force Microscopy. Biophys. J. 80 (6), 3009-3018 (2001).
  59. Lo, Y. -S., et al. Organic and Inorganic Contamination on Commercial AFM Cantilevers. Langmuir. 15 (19), 6522-6526 (1999).
  60. Akrami, S. M. R., Nakayachi, H., Watanabe-Nakayama, T., Asakawa, H., Fukuma, T. Significant improvements in stability and reproducibility of atomic-scale atomic force microscopy in liquid. Nanotechnology. 25 (45), 455701 (2014).
  61. Meyer, G., Amer, N. M. Novel optical approach to atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 53 (12), 1045 (1988).
  62. Alexander, S., et al. An atomic-resolution atomic-force microscope implemented using an optical lever. J. Appl. Phys. 65 (1), 164 (1989).
  63. Green, C. P., et al. Normal and torsional spring constants of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 75 (6), 1988 (2004).
  64. Cleveland, J. P., Manne, S., Bocek, D., Hansma, P. K. A nondestructive method for determining the spring constant of cantilevers for scanning force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 64 (2), 403 (1993).
  65. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev. Sci. Instrum. 64 (7), 1868 (1993).
  66. Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 66 (7), 3789 (1995).
  67. Ricci, M., Quinlan, R., Voitchovsky, K. No Title. Soft Matter. , Forthcoming (2016).
  68. Ricci, M., Spijker, P., Stellacci, F., Molinari, J. -F., Voïtchovsky, K. Direct visualization of single ions in the Stern layer of calcite. Langmuir. 29 (7), 2207-2216 (2013).
  69. Kilpatrick, J. I., Loh, S. -H., Jarvis, S. P. Directly probing the effects of ions on hydration forces at interfaces. J. Am. Chem. Soc. 135 (7), 2628-2634 (2013).
  70. Fukuma, T., et al. Mechanism of atomic force microscopy imaging of three-dimensional hydration structures at a solid-liquid interface. Phys. Rev. B. 92 (15), 155412 (2015).
  71. Maula, T., Westerlund, B., Slotte, J. P. Differential ability of cholesterol-enriched and gel phase domains to resist benzyl alcohol-induced fluidization in multilamellar lipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (11), 2454-2461 (2009).
  72. Schroeder, F., Morrison, W. J., Gorka, C., Wood, W. G. Transbilayer effects of ethanol on fluidity of brain membrane leaflets. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 946 (1), 85-94 (1988).
  73. Tierney, K. J., Block, D. E., Longo, M. L. Elasticity and phase behavior of DPPC membrane modulated by cholesterol, ergosterol, and ethanol. Biophys. J. 89 (4), 2481-2493 (2005).
  74. Basak, S., Raman, A. Dynamics of tapping mode atomic force microscopy in liquids: Theory and experiments. Appl. Phys. Lett. 91 (6), 064107 (2007).
  75. Eslami, B., Solares, S. D. Experimental approach for selecting the excitation frequency for maximum compositional contrast in viscous environments for piezo-driven bimodal atomic force microscopy. J. Appl. Phys. 119 (8), 084901 (2016).
  76. Collins, K. D., Neilson, G. W., Enderby, J. E. Ions in water: characterizing the forces that control chemical processes and biological structure. Biophys. Chem. 128 (2-3), 95-104 (2007).
  77. Lee, S. S., Fenter, P., Park, C., Sturchio, N. C., Nagy, K. L. Hydrated cation speciation at the muscovite (001)-water interface. Langmuir. 26 (22), 16647-16651 (2010).
  78. Liang, S., et al. Thermal noise reduction of mechanical oscillators by actively controlled external dissipative forces. Ultramicroscopy. 84 (1-2), 119-125 (2000).
  79. Hodges, A. R., Bussmann, K. M., Hoh, J. H. Improved atomic force microscope cantilever performance by ion beam modification. Rev. Sci. Instrum. 72 (10), 3880 (2001).
  80. Adamcik, J., Berquand, A., Mezzenga, R. Single-step direct measurement of amyloid fibrils stiffness by peak force quantitative nanomechanical atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 98 (19), 193701 (2011).
  81. Preiner, J., Tang, J., Pastushenko, V., Hinterdorfer, P. Higher harmonic atomic force microscopy: imaging of biological membranes in liquid. Phys. Rev. Lett. 99 (4), 046102 (2007).
  82. Dulebo, A., et al. Second harmonic atomic force microscopy imaging of live and fixed mammalian cells. Ultramicroscopy. 109 (8), 1056-1060 (2009).
  83. Xu, X., Melcher, J., Basak, S., Reifenberger, R., Raman, A. Compositional contrast of biological materials in liquids using the momentary excitation of higher eigenmodes in dynamic atomic force microscopy. Phys. Rev. Lett. 102 (6), 060801 (2009).
  84. Turner, R. D., Kirkham, J., Devine, D., Thomson, N. H. Second harmonic atomic force microscopy of living Staphylococcus aureus bacteria. Appl. Phys. Lett. 94 (4), 043901 (2009).
  85. Barcons, V., Verdaguer, A., Font, J., Chiesa, M., Santos, S. Nanoscale Capillary Interactions in Dynamic Atomic Force Microscopy. J. Phys. Chem. C. 116 (14), 7757-7766 (2012).
  86. Wastl, D. S., Weymouth, A. J., Giessibl, F. J. Atomically resolved graphitic surfaces in air by atomic force microscopy. ACS Nano. 8 (5), 5233-5239 (2014).
  87. Wastl, D. S., Judmann, M., Weymouth, A. J., Giessibl, F. J. Atomic Resolution of Calcium and Oxygen Sublattices of Calcite in Ambient Conditions by Atomic Force Microscopy Using qPlus Sensors with Sapphire Tips. ACS Nano. 9 (4), 3858-3865 (2015).

Tags

Mühendislik Sayı 118 atomik kuvvet mikroskopisi sıvı alt nanometre çözünürlüklü görüntüleme genlik modülasyonu çift katlı lipid biyomembranlar kristaller konsol harmonikler eigenmode çözünme kuvvetleri
Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, E. J., Trewby, W., Farokh… More

Miller, E. J., Trewby, W., Farokh Payam, A., Piantanida, L., Cafolla, C., Voïtchovsky, K. Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid. J. Vis. Exp. (118), e54924, doi:10.3791/54924 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter