Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Published: December 15, 2016 doi: 10.3791/54929
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Anatomy, Korea University College of Medicine

Protocol

1. إعداد المواد والثقافة المتوسطة

  1. للتشريح والتفكك من SCZ، والتفاف مصفوفة الدماغ، ذو حدين شفرة حلاقة، وملقط مع رقائق الألومنيوم، ومن ثم تعقيم لهم من قبل التعقيم.
  2. تجهيز 50 مل من العازلة في برنامج تلفزيوني البارد لغسل دماغ الفأر كله.
  3. انشاء المجهر تشريح وإعداد الأدوات الجراحية اللازمة لتشريح الدماغ (مقص وملقط تعقيمها) وعزل (مل حقنة 1، 30 إبرة G، مصفوفة الدماغ، وملقط غرامة) SCZ.
  4. إعداد N2 المتوسطة:
    1. إعداد F-12 / DMEM (+ L-glutamin، + بيكربونات الصوديوم) متوسطة مع 2٪ B27، 1٪ المكملات N2، و 1٪ البنسلين، الستربتوميسين.
      ملاحظة: يتكون متوسط ​​النمو المتوسطة ونمو العوامل N2 (20 نانوغرام / مل عامل البشرة النقاء النمو (EGF) و 20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF2)).
  5. إعداد العازلة الهضم (40 وحدة / مل غراء، و 2.4 وحدة / مل dispasالبريد الثاني، و 2٪ في برنامج تلفزيوني الستربتومايسين البنسلين) لعملية الهضم الأنسجة.
  6. إعداد لوحة طلاء وساترة:
    1. إعداد بولي-L-الأورنيثين (منظمة التحرير الفلسطينية، 0.01٪) و laminin (10 ميكروغرام / مل حل في DH 2 O). إلى معطف 6 لوحات جيدا للحفاظ على SCZ-aNSCs كما أحادي الطبقة أو 18 coverslips ملم لالمناعية، احتضان لهم مع منظمة التحرير الفلسطينية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ثم غسلها 3 مرات مع DH 2 O. السماح لوحات وcoverslips حتى يجف بعد الغسيل الماضي.
    2. بعد ذلك، احتضان لوحات مع laminin بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. ثم، غسلها 3 مرات مع DH 2 O.
      تحذير: لا تجف في laminin، والتي سوف تؤثر على مرفق الخلية.
      ملاحظة: حلول الطلاء يمكن إعادة استخدامها 3 مرات.

2. العزلة والتفكك من SCZ الكبار

  1. قبل إعداد والثقافة، ووضع مصفوفة الدماغ والحلاقة ذو حدين على الجليد.
    ملاحظة: لا تجميد مصفوفة الدماغ، لأن رعين يمكن أن نعلق عليه.
  2. تضحية الماوس (8 أسابيع من العمر) من خلال CO 2 الخنق أو خلع عنق الرحم.
    1. قطع الرأس مع مقص حاد بعد رش 70٪ من الإيثانول. لشل حركة الرأس، وعقد كلا جانبي الرأس بإحكام. قطع الجلد مع مقص في خط الوسط في اتجاه الذيلية منقاري. هذا يشجع على الإزالة الكاملة للجلد من الجمجمة.
    2. إزالة جزء الذيلية من الجمجمة (الخلفي لامدا) أولا، ومن ثم إدراج ملقط بين الجمجمة والدماغ في موقف ظهري خط الوسط. الاستيلاء على اليسار (أو اليمين) الجداري العظام وقشر بعناية تشغيله. كرر هذا الإجراء لإزالة العظم الجداري الآخرين.
      ملاحظة: انقطاع العصب البصري وإزالة السحايا من الدماغ يجعل من الاسهل لفصل المخ من الجمجمة.
    3. نقل الدماغ لالعازلة في برنامج تلفزيوني الباردة (25 مل)، وشطفه مرتين لإزالة الدم الزائد.
  3. وضع الدماغ في مصفوفة الدماغ على الجليد وأماهكه خفض الاكليلية للحصول على شرائح سميكة 1 مم. نقل شرائح الدماغ (1 مم) الذي يحتوي على مناطق SCZ التي تقع في الجزء الخلفي من الدماغ إلى برنامج تلفزيوني الباردة في 35 مم طبق بتري البلاستيكية.
    تحذير: من أجل الحصول على طائرة موازية من أقسام الاكليلية، تأكد من أن الشق الدماغ يتم وضعها في خط الوسط من مصفوفة الدماغ. فمن الأهمية بمكان لتجنب الاختلافات التي لا داعي لها في الفروع.
    ملاحظة: الحصول على شرائح الدماغ بمعدل 2-3 ملم الخلفي إلى bregma. وهذا يسمح للفصل SCZ من SVZ.
  4. تحت المجهر تشريح مع تضخم منخفض، والصغرى تشريح SCZ من منطقة المادة البيضاء من القشرة والحصين مع عازمة 6،9 30G إبرة. ثم، وإزالة مناطق القشرة فوق SCZ. وضع المنطقة SCZ تشريح من شرائح إلى 35 مم طبق بتري البلاستيك على الجليد دون برنامج تلفزيوني الباردة.
    ملاحظة: تلوث مناطق إضافية تحتوي على الخلايا العصبية الناضجة يمكن أن تؤثر على سلامة aNSCs وneurosphere تشكيل بecause أنها تخضع لموت الخلايا في ظروف ثقافة aNSC.
  5. باستخدام عازمة 30 إبرة G، ختم على الفور الأنسجة تشريح الى قطع صغيرة.
    ملاحظة: إذا كنت بحاجة لوقت أطول لتشريح الأنسجة SCZ، تزج الأنسجة تشريح في برنامج تلفزيوني الباردة قبل تقطيع.
  6. اعادة تعليق الأنسجة المفروم مع 1 مل من العازلة الهضم، ونقل الأنسجة لأنبوب 15 مل تحتوي على 2 مل من العازلة الهضم، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
    ملاحظة: هز أنبوب كل 10 دقيقة لتخلط جيدا.

3. المستمدة المنطقة، تحت الثفني ثقافة الكبار الخلايا الجذعية العصبية

  1. الاستفادة من أنبوب أقل ما يقال لفصل الأنسجة هضمها، ثم الطرد المركزي الأنبوب في 145 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف، إعادة تعليق الأنسجة هضمها مع 1 مل من قبل حرارة متوسطة N2 لتغسل العازلة الهضم، والماصة بلطف محلول العينة بحد أقصى 5 مرات باستخدام ماصة P1000.
    ملاحظة: أكثر من الطحن مع ضيقطرف الماصة يمكن أن يقلل من بقاء الخلية والنمو اللاحق.
  2. أنبوب الطرد المركزي في 145 x ج لمدة 5 دقائق. بعد التخلص من طاف، وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من N2 المتوسطة.
  3. إعداد 1 مل من N2 المتوسطة في لوحة غير المغلفة 6 جيدا وإضافة 1 مل من الخلايا مع وقف التنفيذ لجعل الحجم النهائي من 2 مل.
  4. إضافة EGF (20 نانوغرام / مل)، وbFGF (20 نانوغرام / مل) في كل بئر. يهز بلطف طبق ثقافة 6 جيدا باليد لخلط عوامل النمو واضاف مع الخلايا مطلي. الحفاظ على لوحة 6 جيدا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 الحاضنة.
  5. إضافة EGF (20 نانوغرام / مل)، وbFGF (20 نانوغرام / مل) لكل جيدا كل يوم لمدة 8 أيام. كل يوم الثالث على التوالي، إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام N2 للحفاظ على وحدة التخزين 2 مل التقريبي المتوسط.

4. الركض من NSCs كما Neurospheres والثقافات أحادي الطبقة

  1. جمع neurospheres ونقلها إلى أنبوب جديد مخروطي 15 مل.
    ملاحظة: عدد neurospheres (> 50 ميكرون قطر) بيوص جيدا من SCZ من الدماغ ماوس واحدة 64.3 ± 7.31، الذي كان أقل من ذلك من SVZ (190.5 ± 6.33) 9.
  2. احتضان neurospheres مع 0.5 مل من العازلة تفارق لمدة 5 دقائق في 37 ° C حمام الماء لفصل وneurospheres إلى الخلايا وحيدة. يمكن فصلها neurospheres الأساسي في الخلايا واحدة وحافظت على العديد من المقاطع كما neurosphere أو أحادي الطبقة الثقافات.
    ملاحظة: توسيع SCZ-aNSCs كما أحادي الطبقة متفوقة على neurospheres لSCZ-aNSCs يمكن passaged> 10 مرات في شكل ثقافة أحادي الطبقة، ولكن <5 مرات في شكل ثقافة neurosphere.
    تحذير: SCZ-aNSCs يحمل تجميع قوي، وأنه من الصعب فصل تحويلها إلى خلايا واحدة. وبالتالي، لا ينصح شكل ثقافة neurosphere للتوسع الخلايا الروتينية.
  3. الماصة بلطف محلول العينة صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 أقل من 5 مرات وأجهزة الطرد المركزي الأنبوب في 145 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وإعادة سوقضاء neurospheres مع 1 مل من N2 المتوسطة.
    ملاحظة: أكثر من الطحن مع طرف ماصة ضيق يمكن أن تقلل بقاء الخلية والنمو اللاحق.
  4. عد الخلايا، وجعل 1: 1 خليط من تعليق خلية (10 ميكرولتر) وبنسبة 0.4٪ التريبان حل الأزرق، ومن ثم حساب عدد الخلايا الحية على الكريات. بعد طلاء لوحة 6 جيدا مع منظمة التحرير الفلسطينية / laminin، لوحة الخلايا عند 2.5 × 10 5 خلية / مل مع 2 مل من المتوسط N2 لكل بئر.
    ملاحظة: التغييرات في كثافة الخلايا يمكن أن تؤثر على حالتهم وإمكانية التمايز.
  5. الحفاظ على SCZ-aNSCs مع العلاج يوميا من عوامل النمو (2 مل 20 نانوغرام / مل) لمدة 5 أيام، ومنها مرور لهم.

5. تمايز المستمدة المنطقة، تحت الثفني الخلايا الجذعية البالغة العصبية

  1. aNSCs لوحة الصعود إلى المغلفة Laminin ومنظمة التحرير الفلسطينية / ساترة 18 ملم مع 1 × 10 5 خلية / مل في 1 مل N2 مع عوامل النمو (20 نانوغرام / مل) للتمايز SCZ-aNSCs.
  2. اليوم المقبل،عندما يتم إرفاق الخلايا بقوة إلى ساترة، تبادل المتوسطة النمو مع N2 لإزالة عوامل النمو.
  3. بعد 6 أيام، وغسل خلايا متباينة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الحطام الخلية ومعالجتها لالمناعية.
    ملاحظة: يمكن إدراجها BrdU في الحمض النووي توليفها حديثا من الخلايا المتكاثرة. لذلك، إذا رغبت في ذلك، BrdU (10 ميكروغرام / مل) ويمكن أن يضاف للعيش الخلايا قبل التثبيت من الخلايا.

6. المناعية الكبار العصبية الخلايا الجذعية ومتباينة أسلاف

  1. لالمناعية، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واصلاحها مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: PFA شديدة السمية. تجنب الاتصال مع الجلد والعينين.
  2. إزالة 4٪ PFA، وشطف الخلايا الثابتة مع برنامج تلفزيوني 3 مرات، ومن ثم تخزينها في 4 درجات Cuntil تكون هناك حاجة إليها لالمناعية.
  3. احتضان الخلايا على ساترة مع عرقلة الحل (3٪ ألبومين المصل البقري و 0.1٪ تريتون X-100 في 1X PBS) لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.
  4. إعداد الأجسام المضادة الأولية في عرقلة الحل الطازجة واحتضان عينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    1. المناعية للaNSCs
      1. وصمة عار على aNSCs استخدام الألغام المضادة للNestin وأضداد BrdU. قبل التثبيت، وإضافة 20 ميكروغرام من BrdU إلى aNSCs واحتضان لهم لمدة 2 ساعة. تنفيذ الخطوة تغيير طبيعة باستخدام 2 N حمض الهيدروكلوريك لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة Cbefore أداء خطوة الحجب.
    2. المناعية الأسلاف متباينة:
      1. استخدام مكافحة O4، ومكافحة BIII تويولين، وأضداد الدبقية ييفي البروتين الحمضية (GFAP) لتسمية الأسلاف متباينة.
  5. غسل العينات مع PBS 3 مرات واحتضان لهم مع الأجسام المضادة الثانوية مترافق الأصباغ الفلورية (1: 500) في عرقلة الحل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم، وغسل العينات 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: استخدام الأجسام المضادة الثانوية التي تتناسب مع المضيفين من المرحلة الابتدائيةالأجسام المضادة. يستخدم لتلطيخ النووي: Hoechest33343 (2000 1).
  6. إضافة الحل المتصاعدة إلى الشريحة الزجاجية، والمضي قدما في تصاعد مستمر. مراقبة وصورة العينة على المجهر متحد البؤر في موجات متعددة: FITC (488 نانومتر)، و Cy3 (543 نانومتر)، Cy5 (647 نانومتر)، وHoechest33343 (405 نانومتر).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحديد نظام للثقافة aNSCs من المنطقة العصبية غير معروفة من الضروري لفهم هذه الخلايا وتطوير استخدامها المحتمل في إصلاح الدماغ 12. ومن المعروف أن NSCs في مراحل تنموية مختلفة أو في مناطق مختلفة تتصرف بشكل مختلف 3،4. في الآونة الأخيرة، أفيد أن الخلايا المشتقة SCZ-يحمل إمكانات التفاضلية للتمايز الخلايا العصبية في الجسم الحي في المختبر بالمقارنة مع الخلايا المشتقة SVZ-7-9. لذلك، لعزل بالضبط كل منطقة العصبية، تم تشريح شرائح الدماغ التي تشمل SCZ باستخدام مصفوفة الدماغ 1 مم (الشكل 1A). بعد 8 أيام من الثقافة مع عوامل النمو، يمكن aNSCs المستمدة من SCZ تشكيل neurospheres، حيث تقوم الخلايا يمكن الحفاظ عليه فيما بعد (الشكل 1B).

منذ مجموعة فرعية من NSCs في neurospheres قد يكون مكتب التخطيط الاستراتيجيمتباينة ntaneously 13، نظام الثقافة أحادي الطبقة مفيد أيضا للحفاظ على السكان متجانسة نسبيا من SCZ-aNSCs. عوامل النمو والإنزيمات التفكك مثل التربسين لا تتخلل بسهولة داخل العميق للneurosphere 14،15. توفر الثقافات أحادي الطبقة ظروف أكثر حتى لتوسيع NSCs. من neurospheres الأساسي، تم فصلها SCZ-aNSCs إلى الخلايا واحد من العلاج عازلة الهضم. بعد يوم واحد من البذر الخلية، وكانت تعلق aNSCs لوحة المغلفة وعرضت تكاثر الخلايا (الشكل 2A). لتأكيد قوتها من انتشار الأسلحة النووية، وأضيف BrdU في وسائل الإعلام. بعد الحضانة مع BrdU لمدة 2 ساعة، تم صبغ الخلايا بسهولة مع مكافحة BrdU (علامة للانتشار) ومكافحة Nestin (علامة للخلايا الجذعية العصبية) الأجسام المضادة، مشيرا إلى أن SCZ-aNSCs تنتشر بنشاط والحفاظ على الخصائص الرئيسية ل الخلايا الجذعية (الشكل 2B). وفقا لذلك، فإنها لم EXHIBIT علامات للخلايا متباينة، مثل EGFR (معبرا في تضخيم الخلايا عابر) وDCX (معبرا في neuroblasts) (الشكل 2C).

لتأكيد إمكانية التمايز متعددة من SCZ-aNSCs، وإزالة عوامل النمو من وسائل الإعلام الثقافة. بعد 6 أيام، و immunostained الخلايا مع صناع المختلفة للخلايا متباينة. ليحمل السلالات المختلفة من aNSCs، علامات لالخلايا العصبية (Tuj1)، النجمية (GFAP)، و oligodendrocytes (O4) كانوا يعملون. تم إنشاؤها كل من هذين النوعين من الخلايا من SCZ-aNSCs (الشكل 3).

شكل 1
الشكل 1: عزل المنطقة SCZ وتشكيل neurosphere. (A) إجراء تشريح المنطقة SCZ من مخ الفأر الكبار. إلى ثقافة SCZ-ANالمنبوذة، يتم وضع دماغ الفأر البالغ الاسبوع-8 على مصفوفة الدماغ (1 ملم فترات). بعد باجتزاء، شرائح الدماغ 1 ملم التي شملت المنطقة SCZ (2-3 ملم من bregma) تم تشريح (المشار إليها بواسطة خط منقط أحمر). تشكيل (ب) Neurosphere. تشكلت بعد ثمانية أيام في المختبر الثقافة، neurospheres الأساسي (مرور 0) وpassaged. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الصيانة من SCZ-aNSCs كثقافة أحادي الطبقة. (A) بعد يوم واحد بذر خلايا تشريح، كانت تعلق SCZ-aNSCs وتوسيعها على طبق المغلفة بطريقة أحادي الطبقة (يسار). بعد ثلاثة أيام من الصيانة، وزيادة عدد SCZ-aNSCs (يمين). (ب) المناعية مع BrdU (أحمر، علامة لتكاثر الخلايا)، Nestin (الأخضر، علامة للخلايا الجذعية العصبية)، وHoechest33343 (الأزرق، علامة لنوى). (C) المناعية مع الجذعية العصبية / علامات خلية سلفية Nestin (أحمر، علامة للخلايا نوع B العصبية الجذعية)، EGFR (الأخضر، علامة لنوع C تضخيم الخلايا عابر)، وDCX (الأزرق، علامة لنوع A neuroblasts). تم counterstained نوى مع Hoechest33343 (أبيض). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): المناعية للخلايا متباينة من SCZ-aNSCs. المناعية مع علامات التمايز Tuj1 (الأخضر، علامة لالخلايا العصبية غير ناضج)، O4 (أحمر، علامة لقليلة التغصن)، وGFAP (يصيحآه، علامة للالنجمية). وتظهر الصور المكبرة كما إدراجات. وقد استخدم Hoechest33343 (الأزرق) مقابل تلطيخ مكافحة نوى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتصف هذه الورقة بروتوكول مفصلة لتوليد NSCs من SCZ الماوس الكبار والمحافظة عليها لمختلف التطبيقات. هناك ثلاث خطوات حاسمة لإقامة المختبر في نظام الثقافة اللازمة لتنقية وتوسيع SCZ-NSCs. أولا، من المهم التأكد من أن المنطقة SCZ يتم تشريح بالضبط الخروج من المناطق العصبية المحتملة الأخرى (الشكل 1B). وقد تم الحصول على أبواب سميكة ودقيقة تحتوي على مناطق SCZ مع 1 مم الفاصلة مصفوفة الدماغ، ومن ثم تم استخدام إبرة دقيقة لتشريح الجزئي للSCZ من المناطق القشرية الأخرى (الشكل 1A). عندما غير NSCs-من الأنسجة المجاورة، مثل قشرة الدماغ، هي مثقف مع SCZ-aNSCs تحدث الوفاة كارثية، مما يؤثر سلبا على سلامة والمجال تشكيل لSCZ-NSCs 16-18،22. وأكد SCZ الذيلية (2-3 ملم الخلفي إلى bregma) كأفضل منطقة لتوليد متميزة SCZ-aNSCs. الثاني، appropالعلاج الأنزيمية riate في الحصاد والركض خطوات حاسمة لتحقيق عائد مرتفع من الخلايا. كانت Dispase الثاني وغراء أكثر فعالية لعزل aNSCs من التربسين. تفكك خلايا لالركض مع العازلة التفكك بدلا من التربسين تعزيز حيويتها 19. وينبغي أن يكون التفكك الميكانيكية وسحن مع ماصة الحد الأدنى. ثالثا، يتم استخدام مصفاة الخلية عموما في نظم الاستزراع الأولية لإزالة الحطام الخلوي بعد الهضم الأنسجة. ولكن نظرا لتوطين SCZ-aNSCs، ويتم الحصول على هذه الخلايا بعد الكسر من المادة البيضاء من قبل انزيم الهضم وسحن الميكانيكية. خلال الترشيح مع مصفاة الخلية، وكمية كبيرة من خلايا ستضيع. ولذلك، زراعة SCZ-aNSCs دون استخدام مصفاة الخلية هو أفضل وسيلة للحصول على عائد مرتفع من الخلايا.

في حين أن كلا الثقافات neurosphere والثقافات أحادي الطبقة يمكن تطبيقها على الحفاظ على NSCs والحد من العصبيةثقافة المجال هي أن NSCs واحدة نأت بعد انفصالها يمكن تجميع عشوائي. نتائج تجميع في أحجام مختلفة من neurospheres. عندما يكون حجم من neurosphere يصل قيمة حرجة معينة، ينمو neurosphere كهيكل غير متجانسة، وذلك بسبب نقص المواد الغذائية، عوامل النمو، والأكسجين في صميم 20. وعلاوة على ذلك، neurospheres مع الأحجام الكبيرة لا تنفصل بسهولة مع العازلة تفارق وتتطلب مرات العلاج يعد الأنزيمية مع سحن الميكانيكية واسعة النطاق، مما يؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية. لذلك، ينصح نظام الثقافة أحادي الطبقة للحفاظ على SCZ-aNSCs من خلال ممرات متعددة. في نظام الثقافة أحادي الطبقة، يتم الاحتفاظ aNSCs مستقر كما NSCs (نوع B) دون التمايز عفوية إلى خلايا محددة، مثل الأسلاف (أنواع C و A) (الشكل 3A). تم passaged SCZ-aNSCs لفترات طويلة، <5 مقاطع في شكل neurosphere و> 10 الممرات كما أحادي الطبقة. هذا هو سلبياتistent مع النتائج السابقة، والتي تشير إلى أن نظام الثقافة أحادي الطبقة يحافظ NSCs في المختبر في الثقافات على المدى الطويل 21. ومع ذلك، انخفضت سرعة المتكاثرة، وزيادة جزء من الخلايا الميتة أكثر من 5 فقرات. الركض الموسعة يؤثر على multipotency وتمايز الخلايا العصبية مع زيادة كروموسوم انحراف 22. لذلك، لتجنب الآثار الركض طويلة، فمن المستحسن استخدام مرور وقت مبكر (<مرور 5) خلايا لانتشار وتحليل التمايز. على الرغم من أن إمكانية التجديد الذاتي من SCZ-aNSCs مشابهة لSVZ-aNSCs، وقد تبين التمايز أقل الخلايا العصبية في SCZ-aNSCs 9.

طرق لعزل aNSCs من المناطق العصبية في الدماغ الكبار، بما في ذلك SVZ والتلفيف المسنن (DG)، تم إنشاء 22. على الرغم من أن هذه البروتوكولات عززت عزل وزراعة aNSCs في المختبر، وهناك العديد من القيود المفروضة على الحصول على عدد كبير منالخلايا. العديد من البروتوكولات الاستفادة من المروحية أنسجة المخ التي قد تتسبب في فقدان أنسجة المخ أثناء إجراء تقطيع. وثمة نهج آخر لعزل aNSCs من المناطق العصبية يستخدم قطع الاكليلية من خلال الدماغ باستخدام مشرط. ويتبع هذا من قبل تشريح الصغير من SVZ أو من المديرية العامة على طول الشق الطولي 23. وجود مناطق أخرى من الدماغ يمكن أن تسبب أنواع أخرى من الخلايا إلى تلوث ثقافة aNSC، والتي قد تؤثر على سلامة الخلايا في المختبر. مع البروتوكول الحالي، العديد من عينات مختلفة يمكن أن تدار في تجربة واحدة، بما في ذلك الضوابط مقابل مجموعة متنوعة من المجموعات التجريبية. أيضا، تشريح باستخدام مصفوفة الدماغ متفوقة على أداة تقطيع الدماغ، لأنها تسمح لتحقيق NSCs من مناطق الدماغ المختلفة مع تحقيق عائد خلية عالية. كما أنها تمكن المقارنة بين aNSCs من مناطق مختلفة من نفس الدماغ.

وقد زرع وهندسة NSCs الذاتية considereد عن الاستراتيجيات الممكنة لعلاج الخلايا الجذعية. لهذا، في الدراسات المختبرية عن خصائص aNSCs كما ينبغي استكشاف شامل. ولذلك، فإن إنشاء تتميز بشكل جيد في نظام الثقافة المختبر تكون مفيدة لتعزيز تطبيق NSCs. في هذا النظام الثقافة وخصائص الخلايا الجذعية من SCZ-aNSCs والواقعات، كما يتضح من تجديد الذات والتمايز متعددة النسب في ظل الظروف المناسبة. وبالتالي، فإن هذا النظام يمكن استخدام الثقافة لتوسيع SCZ-aNSCs للدراسات البيولوجية والتطبيقات العلاجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medium components
DMEM/F12  Gibco 11320-033 +L-glutamin, +Sodium bicarbonate
Pen/Strep Invitrogen 15140-122
N2 supplement Gibco 17502-048
B27 supplement Gibco 17504-044
Growth factor
bFGF R&D 233-FB
EGF Gibco PHG0313
Buffer
PBS (10x) BIOSOLUTION BP007a 1x dilution
HBSS Gibco 14175-095
Dissociattion buffer
Dispase II Roche 04-942-078-001
Papain Worthington 3126
Accutase ICT AT-104
Tool
Fine forceps WPI 555229F
Scissors Storz E3321-C
Brain matrix (1 mm) RWD 68707
Double-edged razor DORCO ST-300
30 G needle SUNGSHIM N1300
Materials
15 ml tubes SPL 50015
50 ml tubes SPL 50050
35 mm dish SPL 10035 Petri dish
100 mm dish SPL 10090 Petri dish
Cover slip (18 mm) Deckglaser 111580
12 well dish SPL 32012 non-coating
6 well dish SPL 32006 non-coating
Coating materials
PLO Sigma P4957 0.01%
Laminin Gibco 23017-015 10 mg/ml
Primary antibodies 
Nestin Millipore MAB353 mouse (1:1,000)
EGFR Abcam ab2430 rabbit (1:1,000)
DCX Santa Cruz SC8066 goat (1:500)
Tuj1 Sigma T2200 rabbit (1:2,000)
GFAP Invitrogen 13-0300 rat (1:1,000)
O4 Millipore MAB345 mouse (1:500)
BrdU Abcam ab6326 Rat (1:500)
Secondary antibodies
anti-mouse 488 Invitrogen A21202 1:500
anti-mouse cy3 Jackson 715-165-151
anti-mouse 647 Jackson 715-606-150
anti-rabbit 488 Alexa A21206
anti-rabbit cy3 Jackson 711-165-152
anti-rabbit 647 Jackson 711-605-152
anti-goat 488 Alexa A11055
anti-goat cy3 Jackson 705-165-147
anti-goat 647 Invitrogen A21447
anti-rat 488 Invitrogen A21208
anti-rat cy3 Jackson 712-166-150
anti-rat 647 Jackson 712-605-153
Immunostaining materials
BSA Millipore 82-100-6 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS
Triton X-100 usb 22686
4% PFA Biosesang P2031
Hoechest33342 Life Technology H3570 Dye for staining nuclei

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
  2. Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
  3. Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).
  4. Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
  5. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  6. Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
  7. Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
  8. Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
  9. Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
  10. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
  11. Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
  12. Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
  13. Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
  14. Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
  15. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
  16. Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
  17. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  18. Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
  19. Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
  20. Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
  21. Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
  22. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
  23. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).

Tags

علم الأعصاب، العدد 118، بيولوجيا الأعصاب، الكبار الخلايا الجذعية العصبية، منطقة تحت الثفني، ثقافة الأولية، Neurosphere، التفاضل
العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. Y., Lee, J. H., Sun, W.… More

Kim, J. Y., Lee, J. H., Sun, W. Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone. J. Vis. Exp. (118), e54929, doi:10.3791/54929 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter