Protocol
1. Framställning av material och odlingsmedium
- För dissekering och dissociation av SCZ, vira hjärnan matris, tveeggat rakblad, och pincett med aluminiumfolie, och sedan sterilisera dem genom autoklavering.
- Förbered 50 ml kall PBS-buffert för att tvätta hela mushjärna.
- Inrätta en dissektion mikroskop och förbereda kirurgiska verktyg som krävs för dissekering av hjärnan (autoklave sax och pincett) och isolering av SCZ (1 ml spruta, 30 G nål, hjärna matris och fin pincett) den.
- Framställning av N2-medium:
- Förbereda F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + natriumbikarbonat) medium med 2% B27, 1% N2 kosttillskott, och en% penicillin-streptomycin.
Anmärkning: Tillväxtmediet består av N2-medium och tillväxtfaktorer (20 ng / ml renad epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 20 ng / ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF2)).
- Förbereda F-12 / DMEM (+ L-glutamin, + natriumbikarbonat) medium med 2% B27, 1% N2 kosttillskott, och en% penicillin-streptomycin.
- Förbered en nedbrytningsbuffert (40 enheter / ml papain, 2,4 enheter / ml dispase II, och 2% penicillin-streptomycin i PBS) för vävnads matsmältningen.
- Framställning av beläggnings Plate och Cover:
- Framställa poly-L-ornitin (PLO; 0,01%) och laminin (10 | ag / ml upplöst i DH 2 O). Att belägga 6-brunnars plattor för upprätthållande av SCZ-aNSCs som ett monoskikt eller 18 mm täckglas för immunfärgning, inkubera dem med PLO över natten vid 4 ° C. Tvätta dem sedan 3 gånger med DH 2 O. Låt plattorna och täck att torka efter den sista tvättningen.
- Därefter inkubera plattorna med laminin över natten vid 4 ° C. Sedan tvätta dem 3 gånger med DH 2 O.
Varning: Torka inte laminin, vilket kommer att påverka cellvidfästning.
Notera: Beläggningslösningarna kan återanvändas 3 gånger.
2. Isolering och Dissociation av vuxen SCZ
- Före kultur förberedelse, placera hjärnan matrisen och tveeggat rakkniv på is.
Obs: inte frysa hjärnan matrisen, eftersom brain kunde fästa till det. - Offra en mus (8 veckor gamla) genom CO 2 kvävning eller cervikal dislokation.
- Hugga huvudet med vass sax efter sprutning 70% etanol. Att immobilisera huvudet, hålla båda sidorna av huvudet tätt. Skär huden med en sax vid mittlinjen i en caudal-rostralt riktning. Detta främjar fullständigt avlägsnande av huden från skallen.
- Ta bort den bakre delen av skallen (posteriort lambda) först, och sedan in pincetten mellan skallen och hjärnan vid ryggens mittlinje läge. Ta vänster (eller höger) hjässben och försiktigt dra bort det. Upprepa denna procedur för avlägsnande av den andra parietala benet.
Beakta: Bortkoppling av synnerven och avlägsnande av meningerna från hjärnan göra det lättare att lösgöra hjärnan från skallen. - Överföra hjärnan till kall PBS-buffert (25 ml) och skölj den två gånger för att avlägsna överskott av blod.
- Placera hjärnan in i hjärnan matrisen på is och make koronala snitt för att erhålla en mm tjocka skivor. Överför hjärnan skivor (1 mm) som innehåller de SCZ regioner som är belägna i den bakre delen av hjärnan till en kall PBS i en 35 mm plastpetriskål.
Varning: För att få en parallell plan koronalt sektioner, se till att hjärnan spricka är placerad i mittlinjen av hjärnan matrisen; är det kritiskt att undvika onödiga variationer i sektionerna.
Obs: Skaffa hjärnan skivor på 2-3 mm posteriort bregma; detta medger separationen av SCZ från SVZ. - Enligt dissekera mikroskop med en låg förstoring, mikro-dissekera SCZ från den vita substansen området cortex och hippocampus med en böjd 30G nål 6,9. Ta sedan bort cortex områdena ovanför SCZ. Placera dissekerade SCZ regionen från skivorna i en 35 mm plastpetriskål på is utan kall PBS.
Obs: Förorening av extra regioner som innehåller mogna nervceller kan påverka lönsamheten för aNSCs och neurosphere formation Because de undergår celldöd i aNSC odlingsbetingelser. - Med hjälp av en böjd 30 G nål, omedelbart hacka dissekerade vävnaderna i små bitar.
Obs: Om det krävs en längre tid för att dissekera SCZ vävnad, sänk ned dissekerade vävnader i kall PBS före hackning. - Återsuspendera den hackade vävnaden med 1 ml nedbrytningsbuffert, överföra vävnaden till ett 15 ml rör innehållande 2 ml av digereringsbuffert och inkubera det i 30 min i ett 37 ° C vattenbad.
Obs: Skaka röret var 10 min för att blanda väl.
3. Subcallosal Zone-härledda vuxna neurala stamceller Cell Culture
- Knacka på röret milt för att dissociera den digererade vävnaden, och sedan centrifugera röret vid 145 xg under 5 min. Kassera supernatanten, resuspenderas den nedbrutna vävnaden med en ml förvärmda N2-medium för att tvätta ut matsmältningen buffert och försiktigt pipettera provlösningen högst 5 gånger med en P1000 pipett.
Obs: Över triturering med en smalpipettspets kan minska cellviabiliteten och efterföljande tillväxt. - Centrifugera röret vid 145 xg under 5 min. Efter kassering av supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 1 ml N2-medium.
- Förbereda 1 ml N2-medium i en icke-belagd 6-brunnar och tillsätt 1 ml av de suspenderade cellerna för att göra en slutlig volym av 2 ml.
- Lägga EGF (20 ng / ml) och bFGF (20 ng / ml) i varje brunn. Skaka försiktigt sex brunnar odlingsskål för hand för att blanda tillsatta tillväxtfaktorer med pläterade celler. Hålla 6-brunnar i en 37 ° C och 5% CO2 inkubator.
- Lägga EGF (20 ng / ml) och bFGF (20 ng / ml) till varje brunn varje dag under 8 dagar. Var tredje dag, tillsätt 200 | il av N2 media för att upprätthålla den ungefärliga 2 ml volym av mediet.
4. Passaging av NSCs som Neuro och monolagerkulturer
- Samla neuro och överföra dem till en ny 15 ml koniska rör.
Obs: Antalet neuro (> 50 um diameter) per väl från SCZ av en enda mushjärna var 64,3 ± 7,31, vilket var mindre än den för SVZ (190,5 ± 6,33) 9. - Inkubera neurosfärer med 0,5 ml dissociationsbuffert för 5 min i en 37 ° C vattenbad för att dissociera neurosfärerna in i enstaka celler. Primära neuro kan skiljas i enskilda celler och bibehålls under flera passager som neuro eller monolagerkulturer.
Obs: Expanderande SCZ-aNSCs som ett monoskikt är överlägsen neuro eftersom SCZ-aNSCs kan passe> 10 gånger i en monolagerkultur format, men <5 gånger i neurosphere kultur format.
Försiktighet: SCZ-aNSCs uppvisar stark aggregering, och det är svårt att dissociera dem in i enstaka celler. Således är neurosfärkultur format som inte rekommenderas för rutinmässig cellexpansion. - pipettera försiktigt provlösningen upp och ner med en P1000 pipett mindre än 5 gånger och centrifugera röret vid 145 xg under 5 minuter. Kassera supernatanten och åter-subringa neuro med 1 ml N2-medium.
Obs: Under finfördelning med en smal pipettspetsen kan minska cellviabiliteten och efterföljande tillväxt. - Att räkna cellerna, gör en 1: 1 blandning av cellsuspensionen (10 ^ il) och 0,4% lösning av trypanblått, och sedan räkna antalet levande celler på en hematocytometer. Efter beläggning en 6-brunnar med PLO / laminin, platta cellerna vid 2,5 x 10 5 celler / ml med 2 ml N2-medium för varje brunn.
Obs: Förändringar i celltäthet kan påverka deras tillstånd och differentiering potential. - Bibehålla SCZ-aNSCs med en daglig behandling av tillväxtfaktorer (2 ml, 20 ng / ml) under 5 dagar, och dem passage dem.
5. Differentiering av Subcallosal Zone-härledda vuxna neurala stamceller
- Platt aNSCs på en PLO / Laminin-belagda 18 mm täckglas med 1 x 10 5 celler / ml i 1 ml N2 med tillväxtfaktorer (20 ng / ml) under differentiering av SCZ-aNSCs.
- Nästa dag,när cellerna stadigt fäst vid täck, byta ut odlingsmedium med N2 för att avlägsna tillväxtfaktorer.
- Efter 6 dagar, tvätta de differentierade cellerna med 1 ml PBS för att avlägsna cellrester och rätta till dem för immunfärgning.
Notera: BrdU kan inkorporeras i den nyligen syntetiserade DNA: t av prolifererande celler. Därför, om så önskas, BrdU (10 | ig / ml) kan tillsättas för att leva celler före fixering av celler.
6. Immunfärgning adulta neurala stamceller och differentierade stamceller
- För immunfärgning, tvätta cellerna med PBS och fixera dem med 4% PFA under 20 minuter vid rumstemperatur.
Varning: PFA är mycket giftigt; undvika kontakt med hud och ögon. - Ta bort 4% PFA, skölj de fixerade cellerna med PBS 3 gånger, och sedan lagra dem vid 4 ° Cuntil de behövs för immunfärgning.
- Inkubera cellerna på täckglas med blockeringslösning (3% bovint serumalbumin och 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS) under minst 30 minuter vid rumstemperatur.
- Förbereda de primära antikropparna i färsk blockeringslösning och inkubera proverna över natten vid 4 ° C.
- Immunfärgning de aNSCs
- Färga aNSCs användning av anti-nestin och anti-BrdU-antikroppar. Före fixering, tillsätt 20 | ig av BrdU till aNSCs och inkubera dem under 2 timmar. Utföra denatureringssteget med användning av 2 N HCl under 20 min vid 37 ° Cbefore utföra blockeringssteget.
- Immunfärgning de differentierade stamceller:
- Använda anti-O4, anti-BIII-tubulin, och anti-gliafibrillärt surt protein (GFAP) antikroppar för att märka de differentierade stamfäder.
- Immunfärgning de aNSCs
- Tvätta proverna med PBS 3 gånger och inkubera dem med sekundära antikroppar konjugerade till fluorescerande färgämnen (1: 500) i blockeringslösning under 30 min vid rumstemperatur. Då, tvätta proverna 3 gånger med PBS.
Obs: Använd sekundära antikroppar som matchar värdarna i den primäraantikroppar. Hoechest33343 (1: 2000) används för nukleär färgning. - Lägg monteringslösning till ett objektglas och fortsätt med monteringen. Observera och bild provet på en konfokalmikroskop vid flera våglängder: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), och Hoechest33343 (405 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Definiera odlingssystemet för aNSCs från det okända neurogen regionen är viktig för att förstå dessa celler och för att utveckla deras potentiella användning i hjärnan reparation 12. Det är känt att NSCs i olika utvecklingsstadier eller i olika regioner beter sig annorlunda 3,4. Nyligen rapporterades det att SCZ-härledda celler uppvisar differential potentialer för neuronal differentiering in vivo och in vitro jämfört med SVZ-härledda celler 7-9. Därför, för att exakt isolera varje neurogen region, var hjärnan skivor som inkluderar SCZ dissekerades med användning av en 1 mm hjärna matris (Figur 1A). Efter 8 dagars odling med tillväxtfaktorer, kan aNSCs härledda från SCZ bilda neurosfärer, i vilka cellerna kan därefter upprätthållas (Figur 1B).
Eftersom en delmängd av NSCs i neurosfärerna kan vara spontaneously differentierade 13, ett monoskikt kultursystem är också till hjälp för upprätthållandet av den relativt homogen population av SCZ-aNSCs. Tillväxtfaktorer och dissociation enzymer såsom trypsin inte lätt tränga djupt inne i neurosphere 14,15. Monolagerkulturer ger jämnare villkor för utbyggnaden av NSCs. Från primära neuro var SCZ-aNSCs dissocieras till enskilda celler genom en nedbrytningsbuffert behandling. En dag efter cellsådd, har aNSCs fäst på den belagda plattan och uppvisade cellproliferation (Figur 2A). För att bekräfta deras potens för spridning var BrdU tillsattes i mediet. Efter inkubation med BrdU under 2 h, fick cellerna lätt färgade med anti-BrdU (en markör för proliferation) och anti-nestin (en markör för neurala stamceller) antikroppar, vilket indikerar att SCZ-aNSCs aktivt prolifererande och bibehålla de viktigaste egenskaperna hos stamceller (Figur 2B). Följaktligen har de inte exhiBit markörer för differentierade celler, såsom EGFR (uttryckt i transient-amplifierande celler) och DCX (uttryckt i neuroblaster) (figur 2C).
För att bekräfta den multipla differentieringspotentialen för SCZ-aNSCs ades tillväxtfaktorer avlägsnas från odlingsmediet. Efter 6 dagar, cellerna immun med olika beslutsfattare för differentierade celler. Uppvisa olika avkommor av aNSCs, markörer för neuroner (Tuj1), astrocyter (GFAP) och oligodendrocyter (O4) användes; alla av dessa celltyper genererades från SCZ-aNSCs (Figur 3).
Figur 1: Isolering av SCZ regionen och bildning av neurosfären. (A) Förfarande för dissektion av SCZ region från vuxen mus hjärnan. Att odla SCZ-AnSC är en åtta veckor gammal mushjärna placeras på en hjärna matris (1 mm mellanrum). Efter sektionering, hjärnan en mm skivor som inkluderade SCZ regionen (2-3 mm från bregma) dissekerades (indikeras av den röda streckade linjen). (B) neurosphere bildning. Åtta dagar efter in vitro-odling, primära neuro (passage 0) bildades och passerades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Underhåll av SCZ-aNSCs som en monoskiktskultur. (A) En dag efter sådd dissekerade celler, SCZ-aNSCs fästes och expanderat på en belagd maträtt i ett monoskikt sätt (till vänster). Tre dagar efter underhåll, var antalet SCZ-aNSCs ökade (till höger). (B) Immunfärgning med BrdU (röd, en markör för prolifererande celler), nestin (grön, en markör för neurala stamceller), och Hoechest33343 (blå, en markör för kärnor). (C) Immunfärgning med neurala stam / progenitorceller markörer nestin (röd, en markör för typ B neurala stamceller), EGFR (grön, en markör för typ C gående förstärkande celler), och DCX (blå, en markör för typ A neuroblaster). Kärnor motfärgades med Hoechest33343 (vit). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: immunfärgning av de differentierade cellerna från SCZ-aNSCs. Immunfärgning med differentieringsmarkörer Tuj1 (grön, en markör för omogna neuroner), O4 (röd, en markör för oligodendrocyter) och GFAP (skrikaow, en markör för astrocyter). Förstorade bilder visas som inläggningar. Hoechest33343 (blå) användes för kontra färgning av kärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för att generera NSCs från vuxen mus SCZ och att hålla dem för olika tillämpningar. Det finns tre viktiga steg för att fastställa in vitro odlingssystemet som krävs för att rena och expandera SCZ-NSCs. För det första är det viktigt att se till att SCZ regionen är exakt dissekerades ut från andra potentiella neurogena regioner (figur 1B). Tjocka och exakta sektioner innehållande SCZ regionerna erhölls med en 1 mm intervall hjärna matris, och sedan en fin nål användes för mikro dissektion av SCZ från andra kortikala regioner (Figur 1A). När icke-NSCs från angränsande vävnader, såsom hjärnbarken, odlas med SCZ-aNSCs inträffar katastrofala död, vilket negativt påverkar lönsamheten och sfär-bildning av SCZ-NSCs 16-18,22. Den bakre SCZ (2-3 mm posteriort bregma) bekräftades som den bästa regionen för att generera olika SCZ-aNSCs. För det andra, appropriate enzymatisk behandling i upptagningsområdena och passage steg är avgörande för att uppnå ett högt utbyte av celler. Dispas II och papain var effektivare för att isolera aNSCs än trypsin. Dissociation av celler för passage med dissociation buffert istället för trypsin förbättrat sin lönsamhet 19. Mekanisk dissociation och triturering med en pipett bör vara minimal. För det tredje är en cell sil som vanligtvis används i primära odlingssystem för att avlägsna cellrester efter vävnads matsmältningen. Emellertid, på grund av lokaliseringen av SCZ-aNSCs, är dessa celler erhålls efter brott på vita substansen genom enzymdigerering och mekanisk triturering. Under filtrering med en cellfilter, skulle en väsentlig mängd av celler att gå förlorade. Därför odling SCZ-aNSCs utan att använda en cell sil är ett bättre sätt att få ett högt utbyte av celler.
Även om båda neurosfärkulturer och monoskiktkulturer kan appliceras på upprätthållandet av NSCs, en begränsning av neurosfär kultur är att enskilda NSCs dissocierade efter uppdelningen kan slumpmässigt ihop. Sammanläggning resulterar i olika storlekar av neuro. När storleken på en neurosfär når ett visst kritiskt värde, växer neurosfären som en heterogen struktur, på grund av en brist på näringsämnen, tillväxtfaktorer, och syre vid kärnan 20. Dessutom är neuro med stora storlekar inte lätt skiljas med dissociation buffert och kräver längre enzymatiska behandlingstider med omfattande mekanisk finfördelning, vilket leder till lägre cellviabilitet. Därför är monokultur systemet rekommenderas för att bibehålla SCZ-aNSCs genom flera passager. I en monoskiktskultur system är aNSCs stabilt bibehållas som NSCs (typ B) utan spontan differentiering till specificerade celler, såsom stamceller (typerna C och A) (figur 3A). SCZ-aNSCs passerades under längre perioder, <5 passager i en neurosfär format och> 10 passager som ett monolager. Detta är nackdelaristent med tidigare resultat, som tyder på att den monoodlingssystemet upprätthåller NSCs in vitro i långsiktiga kulturer 21. Men minskade prolifererande hastighet, och den del av döende celler ökade under 5 passager. Utökad passage påverkar multipotens och neuronal differentiering med ökad kromosomavvikelser 22. För att undvika långa passage effekter, är det rekommenderat att använda tidig passage (<passage 5) celler för proliferation och differentiering analys. Även om risken för självförnyelse av SCZ-aNSCs liknar SVZ-aNSCs var mindre neuronal differentiering som visas i SCZ-aNSCs 9.
Metoder för att isolera aNSCs från neurogena regioner i den vuxna hjärnan, inklusive SVZ och dentate gyrus (DG), har fastställts 22. Även om sådana protokoll har främjat isoleringen och odlingen av aNSCs in vitro, finns det flera begränsningar för att erhålla ett högt antalceller. Många protokoll använder en hjärnvävnad chopper som kan orsaka förlust av hjärnvävnad under skärförfarandet. Ett annat sätt att isolera aNSCs från neurogena regioner använder en coronal snitt genom hjärnan med hjälp av en skalpell. Detta följs av mikro dissektion av SVZ eller för GD utmed den längsgående spricka 23. Närvaron av andra områden i hjärnan kan orsaka andra celltyper för att förorena aNSC kultur, som kan påverka cellernas livsduglighet in vitro. Med det nuvarande protokollet, kan många olika prover hanteras i ett enda experiment, inklusive kontroller jämfört med en mängd olika experimentella grupper. Också skivning med hjälp av en hjärna matris är överlägsen en hjärna hackverktyg, eftersom det gör det möjligt att uppnå NSCs från olika hjärnregioner med en hög cellutbyte. Det gör det också möjligt att jämföra aNSCs från olika regioner i samma hjärnan.
Transplantation och konstruktion av endogena NSCs har varit considered som möjliga strategier för stamcellsterapi. För detta in vitro-studier om egenskaperna hos aNSCs bör också omfattande utforskas. Därför kommer inrättandet av en väldefinierad in vitro odlingssystem vara till hjälp för att främja tillämpningen av NSCs. I denna kultur systemet, stamcellsegenskaper SCZ-aNSCs var väl underhållna, vilket framgår av självförnyelse och flera härstamning differentiering under lämpliga förhållanden. Därför kan denna kultur system användas för utbyggnad av SCZ-aNSCs för biologiska studier och terapeutiska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medium components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | +L-glutamin, +Sodium bicarbonate |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Growth factor | |||
| bFGF | R&D | 233-FB | |
| EGF | Gibco | PHG0313 | |
| Buffer | |||
| PBS (10x) | BIOSOLUTION | BP007a | 1x dilution |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | |
| Dissociattion buffer | |||
| Dispase II | Roche | 04-942-078-001 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| Accutase | ICT | AT-104 | |
| Tool | |||
| Fine forceps | WPI | 555229F | |
| Scissors | Storz | E3321-C | |
| Brain matrix (1 mm) | RWD | 68707 | |
| Double-edged razor | DORCO | ST-300 | |
| 30 G needle | SUNGSHIM | N1300 | |
| Materials | |||
| 15 ml tubes | SPL | 50015 | |
| 50 ml tubes | SPL | 50050 | |
| 35 mm dish | SPL | 10035 | Petri dish |
| 100 mm dish | SPL | 10090 | Petri dish |
| Cover slip (18 mm) | Deckglaser | 111580 | |
| 12 well dish | SPL | 32012 | non-coating |
| 6 well dish | SPL | 32006 | non-coating |
| Coating materials | |||
| PLO | Sigma | P4957 | 0.01% |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | 10 mg/ml |
| Primary antibodies | |||
| Nestin | Millipore | MAB353 | mouse (1:1,000) |
| EGFR | Abcam | ab2430 | rabbit (1:1,000) |
| DCX | Santa Cruz | SC8066 | goat (1:500) |
| Tuj1 | Sigma | T2200 | rabbit (1:2,000) |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | rat (1:1,000) |
| O4 | Millipore | MAB345 | mouse (1:500) |
| BrdU | Abcam | ab6326 | Rat (1:500) |
| Secondary antibodies | |||
| anti-mouse 488 | Invitrogen | A21202 | 1:500 |
| anti-mouse cy3 | Jackson | 715-165-151 | |
| anti-mouse 647 | Jackson | 715-606-150 | |
| anti-rabbit 488 | Alexa | A21206 | |
| anti-rabbit cy3 | Jackson | 711-165-152 | |
| anti-rabbit 647 | Jackson | 711-605-152 | |
| anti-goat 488 | Alexa | A11055 | |
| anti-goat cy3 | Jackson | 705-165-147 | |
| anti-goat 647 | Invitrogen | A21447 | |
| anti-rat 488 | Invitrogen | A21208 | |
| anti-rat cy3 | Jackson | 712-166-150 | |
| anti-rat 647 | Jackson | 712-605-153 | |
| Immunostaining materials | |||
| BSA | Millipore | 82-100-6 | 3% BSA with 0.1% Triton X-100 in PBS |
| Triton X-100 | usb | 22686 | |
| 4% PFA | Biosesang | P2031 | |
| Hoechest33342 | Life Technology | H3570 | Dye for staining nuclei |
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Developmental biology. 175, 1-3 (1996).
- Babu, H., Cheung, G., Kettenmann, H., Palmer, T. D., Kempermann, G. Enriched monolayer precursor cell cultures from micro-dissected adult mouse dentate gyrus yield functional granule cell-like neurons. PloS one. 2, e388 (2007).
- Alvarez-Buylla, A., Garcia-Verdugo, J. M. Neurogenesis in adult subventricular zone. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 629-634 (2002).
- Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Hippocampus. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 7, a018812 (2015).
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Seri, B., et al. Composition and organization of the SCZ: a large germinal layer containing neural stem cells in the adult mammalian brain. Cereb Cortex. 16 Suppl 1, i103-i111 (2006).
- Kim, W. R., et al. Evidence for the spontaneous production but massive programmed cell death of new neurons in the subcallosal zone of the postnatal mouse brain. The European journal of neuroscience. 33, 599-611 (2011).
- Kim, H. J., Kim, J. Y., Sun, W. Age-dependent changes in the subcallosal zone neurogenesis of mice. Neurochemistry international. 61, 879-884 (2012).
- Kim, J. Y., et al. Promotion of Cortical Neurogenesis from the Neural Stem Cells in the Adult Mouse Subcallosal Zone. Stem Cells. , (2015).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature medicine. 9, 439-447 (2003).
- Gould, E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nature reviews. Neuroscience. 8, 481-488 (2007).
- Gage, F. H., Temple, S. Neural stem cells: generating and regenerating the brain. Neuron. 80, 588-601 (2013).
- Shaker, M. R., Kim, J. Y., Kim, H., Sun, W. Identification and characterization of secondary neural tube-derived embryonic neural stem cells in vitro. Stem cells and development. 24, 1171-1181 (2015).
- Jensen, J. B., Parmar, M. Strengths and limitations of the neurosphere culture system. Molecular neurobiology. 34, 153-161 (2006).
- Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 14506-14511 (2002).
- Richards, L. J., Kilpatrick, T. J., Bartlett, P. F. De novo generation of neuronal cells from the adult mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 8591-8595 (1992).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Epidermal and fibroblast growth factors behave as mitogenic regulators for a single multipotent stem cell-like population from the subventricular region of the adult mouse forebrain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 3287-3297 (1999).
- Wachs, F. P., et al. High efficacy of clonal growth and expansion of adult neural stem cells. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 949-962 (2003).
- Xiong, F., et al. Optimal time for passaging neurospheres based on primary neural stem cell cultures. Cytotechnology. 63, 621-631 (2011).
- Lee, S. W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19, 175-180 (2015).
- Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nature protocols. 7, 2005-2012 (2012).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. JoVE (Journal of Visualized Experiments). , e51225 (2014).
