Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/54934

Introduction

Defekte im Gelenkknorpel nicht heilen natürlich. Folglich Stammzelltransplantation hat sich als vielversprechender Ansatz für die Reparatur von Knorpel beeinträchtigt vorgeschlagen worden. Jedoch erfordert dieses Verfahren sowohl die Übernahme von einer ausreichenden Anzahl von Stammzellen und die Induktion dieser Zellen chondrogene Differenzierung zu unterziehen. Knochenmark (BM) wurde als Quelle für Stammzellen weit verbreitet, aber Zellisolation aus BM hat zwei wesentliche Nachteile: Invasivität und ungenügender Ausbeute. Aufgrund seiner Leichtigkeit des Erwerbs, Fettgewebe ist eine bevorzugte Quelle für Stammzellen. Frühere Studien zeigten die Machbarkeit Stammzellen aus Fettgewebe zur Isolierung und chondrogene Differenzierung in diesen Zellen Zytokine, wie TGF-β1 1 unter Verwendung von 2 zu induzieren. Diese Verfahren sind wirksam, aber teuer.

Als preiswertere Alternative zu Cytokine können mechanische Belastungen verwendet werden,induzieren die chondrogene Differenzierung. Mechanische Belastung spielt eine kritische Rolle bei der Gesundheit von Gelenkknorpel Aufrechterhaltung 3, und es kann chondrogenen Phänotyp in verschiedenen Zellen induzieren. Beispielsweise induziert hydrostatischem Druck chondrogenen Phänotyp in Synovium abgeleiteten Vorläuferzellen über die MAP kinase / JNK - Weg 4 und mechanische Kompression induziert die Chondrogenese in mesenchymalen Stammzellen (MSCs) durch chondrozytische Gene 5 upregulating. Zusätzlich trägt Scherspannung auf die Expression von Chondrogenese bezogenen extrazellulären Matrix (ECM) in humanen MSCs 6. Kreiselschwerkraft (CG), ein leicht angewendet und kontrolliert mechanischer Beanspruchung durch Zentrifugation erzeugt, kann Differential Gen induzieren Expression in Zellen 7. Beispielsweise in Karzinomzellen Lungenepithelzellen, wird die Expression von Interleukin (IL) -1b durch Zentrifugation 8 nach oben reguliert. Therefore als experimentell induzierbaren mechanische Beanspruchung kann CG verwendet werden chondrozytische Genexpression in Stammzellen zu induzieren. Es bleibt jedoch unklar, ob CG die chondrogene Differenzierung von Stammzellen induzieren können.

In dieser Studie haben wir festgestellt, dass CG die Hochregulation von SOX9, einen Master-Regulator der Chondrogenese, in der menschlichen ASCS induziert, was zu einer Überexpression von chondrozytische Gene. Zusätzlich verglichen wir die Wirkungen von CG auf Chondrogenese mit denen von TGF-β1, die meisten der Wachstumsfaktor im Allgemeinen in vitro - Chondrogenese in Stammzellen zu induzieren , verwendet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Das Studienprotokoll wurde von der Ethikkommission der Katholischen Universität von Korea (KC16EAME0162) und führte nach NIH-Richtlinien zugelassen. Alle Gewebe wurden mit schriftliche Einverständniserklärung erhalten.

1. Kreisel Gravity Laden und Pelletkultur

  1. Zellkultur und Ernte
    1. Kultur ASCS (P2-P3, siehe Materialliste) in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium-Low Glucose (DMEM-LG), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
    2. Wenn die Zellen 80% Konfluenz erreichen, entsorgen Sie das Medium und die Zellen werden mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
    3. 1 ml PBS , enthaltend 1 mM EDTA und Inkubation für 2 min bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
    4. Tippen Sie auf die Kulturplatte sanft, 4 ml frisches Medium, übertragen die Zellenin 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 × g für 2 min bei Raumtemperatur (RT).
  2. Kreisel Schwere Belastung
    1. Nach der Zentrifugation (Schritt 1.1.4), entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören und das Pellet in 10 ml DMEM-LG mit 10% FBS resuspendieren. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
    2. Für CG Beladung übertragen 2,5 × 10 5 Zellen in ein neues 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 2.400 × g für 15 min.
  3. Pelletkultur
    1. Unmittelbar nach der Zentrifugation der Überstand absaugen und füge 500 ul definiert chondrogenen Differenzierungsmedium (CDM, High-glucose DMEM mit 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM Dexamethason, 1x MEM nicht-essentielle Aminosäurelösung, 50 ug / ml L-Prolin und 1% Penicillin / Streptomycin). In 50 ug / ml frisch zubereitet L-Ascorbinsäure-2-phosphat bei jedem Mediumwechsel. Als positive Kontrolle, veran chondrogene differentiatiauf in nicht-zentrifugierten Zellen durch Zugabe von CDM, das 10 ng / ml TGF-β1.
    2. Platzieren Sie die lose verschlossen Rohre , die Pellets in einer stehenden Position enthält , und Inkubieren bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
    3. Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag für 3 Wochen.
  4. Micro Kultur
    1. Unmittelbar nach dem Zentrifugieren (Schritt 1.2.2; 2.400 × g für 15 min), der Überstand absaugen und das Pellet in 10 ul CDM resuspendieren.
    2. Um einen Mikromasse bilden, legen Sie die resuspendierten Zellen in der Mitte eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
    3. Nach 2 h fügt vorsichtig 1 ml CDM zum Brunnen, Pipettieren gegen die Wand der Platte Störung der Mikromasse zu vermeiden. eine Mikromassenkultur mit nicht-zentrifugierten Zellen durch Zugabe von CDM, das 10 ng / ml TGF-β1 als Positivkontrolle, durchzuführen.
    4. Inkubieren des Mikromasse bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2.
    5. Ändern Sie das Medium evEry anderen Tag für 3 Wochen.

2. Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) Transcriptional Upregulation von chondrogenen Differenzierungsmarker zu erkennen

  1. Am Tag 14 eine Pipette verwenden, um die Sphäroid-Pellets in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und waschen Sie sie in 1x PBS zu übertragen.
  2. Extrahieren Sie die Gesamt - RNA aus den Pellets unter Verwendung des Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform - Extraktionsverfahren 9.
  3. Synthetisieren von cDNA aus 2 ug Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase gemß dem Protokoll des Herstellers (inkubieren bei 42 ° C für 1 h und dann Inaktivieren des Enzyms bei 70 ° C für 5 min).
  4. Führen PCR mit Primern , die spezifisch für chondrogenen Differenzierungsmarker 10.

3. Die Färbung zu erkennen, die Überexpression von chondrogene Differenzierung Markerproteinen

  1. Paraffin-Einbettung Zellpellets
    1. Am Tag 21Verwenden einer Pipette die Sphäroid-Pellets und waschen Sie sie mit 1x PBS zu ernten.
    2. Befestigen Sie die Sphäroid-Pellets durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd für 24 h.
      Achtung: Paraformaldehyd ist hochgiftig. Vermeiden Sie den Kontakt mit Augen, Haut oder Schleimhäute. Minimieren Sie Belichtung und vermeiden Einatmen während der Vorbereitung. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung.
    3. Entsorgen Sie die Fixiermittel und spülen Sie die Zellpellets mit VE-Wasser (DW).
    4. Legen Sie eine Schicht aus Gaze auf die Kassette und übertragen Sie die feste Pellets mit einer Pipette. Decken Sie das Pellet durch die Gaze Falten und schließen Sie den Kassettendeckel.
    5. Entwässern der Pellets.
      1. Eintauchen der Pellets in 70% Ethanol (EtOH) 5 min bei RT.
      2. Eintauchen der Pellets in 80% EtOH für 5 min bei RT.
      3. Eintauchen der Pellets in 95% EtOH für 5 min bei RT.
      4. Eintauchen der Pellets in 100% EtOH für 5 min bei RT. Zweimal wiederholen.
      5. Eintauchen der Pellets in 100% Xylol 15 min bei RT. Wiederholen Sie twice.
    6. Einbetten der festen Zellpellets in Paraffin bei 56 ° C in einer Form; Die Pellets können in Paraffin mit speziellen automatisierten Gewebeverarbeitungssysteme eingebettet werden.
    7. Schneiden Sie 5 um dicke Abschnitte aus dem Paraffin eingebetteten Zellpellet ein Rotationsmikrotom mit.
    8. Schwimmer die Abschnitte in 50% EtOH und übertragen sie dann auf ein 50 ° C Wasserbad eine Folie verwendet wird.
    9. Legen Sie die schwimmenden Abschnitte auf Objektträger.
  2. Safranin O und Alcianblaufärbung
    1. Rehydrieren die Paraffinschnitten.
      1. Tauchen Sie die Folien in Xylol für 15 min. Zweimal wiederholen.
      2. Tauchen Sie die Folien in 100% EtOH für 5 min. Zweimal wiederholen.
      3. Tauchen Sie die Folien in 90% EtOH für 5 min.
      4. Tauchen Sie die Folien in 80% EtOH für 5 min.
      5. Tauchen Sie die Folien in 70% EtOH für 5 Minuten und dann waschen Sie sie in 1x PBS.
    2. Stain die rehydratisierten Abschnitte mit 1% Safranin O-Lösung und 3% Alcianblau für30 Minuten.
    3. Entsorgen Sie die Farblösung und spülen Sie die Abschnitte mit DW.
    4. Beflecken die Abschnitte mit Hematoxylin / Eosin-Lösung (Gegenfärbemittel) für 1 min.
    5. Entsorgen Sie die Farblösung und spülen Sie die Abschnitte mit DW.
    6. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem Deckglas nach Restwasser zu entfernen. Legen Sie das Dia (Zellenseite nach unten) auf dem Deckglas des Montage Medium enthält.
    7. Ermöglichen die Objektträger für 2-3 h bei RT trocknen.
    8. Zum Aufzeichnen von Bildern mit einem Hellfeld-Mikroskop (Automatisiertes aufrechten Mikroskop, 50X und 200X).
  3. Immunfluoreszenztest
    1. Rehydrieren die Abschnitte, wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben.
    2. Eintauchen der Objektträger in Natriumcitrat-Puffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0), und dann halten sie an einem Unter Siedetemperatur für 10 min unter Verwendung einer Mikrowelle.
    3. Kühlen Sie die Folien für 20 min bei RT und dann waschen Sie sie mit Leitungswasser.
    4. Inkubieren Sie die Dias in 3%H 2 O 2 (in 1x PBS) für 15 Minuten und dann waschen Sie sie mit Leitungswasser für 15 min 11.
    5. Blockieren die Objektträger mit Blockierungspuffer (10% normales Ziegenserum in PBS) für 1 h.
    6. Saugen Sie das Blockierungslösung, und dann gelten die Folien eine primäre Antikörper verdünnt mit 5% normalem Ziegenserum auf.
    7. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 4 ° C.
    8. Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten.
    9. Inkubieren der Objektträger in Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörpers mit 5% normalem Ziegenserum verdünnt, für 1 h bei RT im Dunkeln.
    10. Waschen Sie die Objektträger dreimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten im Dunkeln.
    11. Inkubieren Sie die Objektträger mit DAPI (1 ug / ml) für 10 Minuten und dann waschen Sie sie zweimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten.
    12. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf einem Deckglas nach Restwasser zu entfernen. Legen Sie das Dia (Zellenseite nach unten) auf dem Montagemedium.
    13. Lassen Sie die Folien für 2-3 trocknenh im Dunkeln bei RT.
    14. Visualisieren Sie die Folien mit der Fluoreszenzmikroskopie (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X und 200 - facher Vergrößerung) 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kreiselschwerkraft induziert die Überexpression von chondrogenen Differenzierungsmarker in Fettgewebe gewonnenen Stammzellen.

Um das Ausmaß der Zentrifugal-Schwerkraft bestimmen, die geeignet ist die chondrogene Differenzierung zu induzieren, ASCs wurden mit unterschiedlichen Graden der CG stimuliert (0, 300, 600, 1.200 und 2.400 xg) für 15 min. Nach der Stimulation wurden die ASCs erneut ausgesät auf Kulturplatten und kultiviert für 24 h. Wie in 1A wurde SOX9 mRNA gezeigt Expression signifikant bei 2.400 xg erhöht; es war etwa 1,5-fach höher bei 2.400 xg als in der Kontrolle (ASCs nicht mit CG geladen). Um zu bestätigen, ob CG chondrogene Differenzierung induziert, stimuliert wir ASCS von CG Laden oder durch TGF-β1 Behandlung. Als negative Kontrolle wurden gezüchtete ASCs ohne Stimulation. Proben wurden am Tag 14 und geerntet qRT-PCR wurde durchgeführt. Wie in F gezeigtild 1, COL2A1 mRNA, eine repräsentative chondrogene Differenzierungsmarker, wurde von CG relativ stimuliert in ASCS upregulated Zellen zu steuern (die nicht - stimulierten ASCS). Die Aufregulation Niveau COL2A1 mRNA durch CG Stimulation war ähnlich dem durch die TGF-β1 - Behandlung induziert. Auf der anderen Seite, COL10, einem Marker von hypertrophen Chondrozyten, wurde durch CG Stimulation abreguliert. ACAN mRNA, die eine wichtige strukturelle Komponente des Gelenkknorpels codiert, wurde etwa 2-fach upregulated von CG Stimulation, während COL1 zu den Kontrollen nicht nachweisbar erhöhten relativen war. Weder ACAN noch COL1 wurden in ASCs aufreguliert mit TGF-β1 behandelt.

Zentrifugal-Schwerkraft induziert die Expression eines Chondrogenese bezogenen extrazellulären Matrix in der Pellet-Kultur von aus Fettgewebe abgeleiteten Stammzellen.

AnzahlungIon von ECM, wie Glykosaminoglykan, ist ein Markenzeichen Phänotyp der chondrogenen Differenzierung. Zu diesem Material erfassen, wir gefärbten pellet kultiviert ASCs mit Safranin O und Alcianblau am Tag 21. Wie in 2A gezeigt, mit CG stimulierte ASCs abgeschieden mehr Glycosaminoglycan (rot für Safranin O und blau für Alcian blue) als die Kontrollen, bei a Ebene ähnlich, dass mit TGF-β1 behandelt durch ASCS abgeschieden. In diesen Experimenten zeigten positive Färbung die Bildung einer Knorpelmatrix. Zur weiteren Bestätigung, überwacht wir die Expression von COL2A1 Protein mit der PE-konjugiertem anti-COL2A1 Antikörper verwendet. COL2A1 wurde in ASCs mit CG stimulierte überexprimiert zu einer etwas größeren Ausmaß als in ASCs behandelt mit TGF-β1 (2B).

Chondrogene Aggregatbildung wird durch die Zentrifugalkraft die Schwerkraft in einer Mikromassenkultur aus Fettgewebe gewonnenen Stammzellen induziert.

13. Daher verglichen wir Kondensation in den Mikromasse zwischen den Kulturen der Kontrolle ASCS und ASCS stimuliert mit CG oder TGF-β1. Wie in Abbildung 3 gezeigt, größer und dichter Ansammlungen von ASCS (weißer Farbe in der gepunkteten Quadrat) wurden stimuliert mit CG oder TGF-β1 in Mikromassenkulturen aus ASCS entdeckt als in den Kontrollkulturen.

SOX9 wird durch die Zentrifugalkraft die Schwerkraft in Fettgewebe gewonnenen Stammzellen nach oben reguliert.

Sox9 ist ein Hauptregulator der chondrogenen Differenzierung 14, 15. Um zu bestimmen , ob CG die Hochregulation von Sox9 in ASCS induziert, überwacht die Expression von SOX9 mRNA in ASCS verschiedenen Dauern von CG stimula ausgesetzttion (2.400 × g). SOX9 Expression wurde bei verschiedenen Graden der CG untersucht, aber es sich nicht signifikant unter CG Bedingungen mit Kräften von mehr als 2.400 × g unterscheiden (Daten nicht gezeigt). Expression von mRNA SOX9 begann nach 15 min von CG Stimulation zu erhöhen, und es wurde nach 30 min (4A) gesättigt. Als nächstes, um zu bestimmen, wie lange CG-induzierten Überexpression Sox9 aufrechterhalten werden kann, geerntet wir zu den angegebenen Zeitpunkten CG-stimulierte ASCs und die Expression von Sox9 überwacht. Wie in 4B gezeigt ist , erhöht die Expression von Protein Sox9 bis 3 h nach der Stimulation CG und blieben mindestens 12 h auf diesem Niveau.

Abbildung 1
Abbildung 1. Kreiselschwerkraft induziert die Hochregulation von chondrogenen Differenzierungsmarker in Fettgewebe gewonnenen Stammzellen. A) Um zu bestimmen , wieuitable zentrifugale Schwerkraft wurden ASCS bei verschiedenen CG zentrifugiert (0, 300, 600, 1.200 und 2.400 × g) für 15 min. SOX9 mRNA-Expression wurde bei 24 h nach CG Stimulation ausgewertet. B) Zur Auswertung wurde die Expression von Chondrogenese-verwandten Gene, Gesamt - RNA aus ASCs extrahiert , die zentrifugiert worden war, behandelt mit TGF-β1 (10 ng / ml) oder nicht - stimulierten (Kontrollen). Die RNA wurde einer reversen Transkription cDNA zu synthetisieren, die dann durch RT-PCR amplifiziert. Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. ** P <0,01 für mit CG stimuliert ASCS gegenüber der Kontrolle (nicht-stimulierten ASCS).

Figur 2
Abbildung 2. Kreiselschwerkraft induziert eine Chondrogenese bezogenen extrazellulären Matrix in Pelletkulturen von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen. A) Proteoglycanmatrix FormatIon von CG Laden. B) CG-induzierten Überexpression von Kollagen Typ 2. Für CG Beladung wurden ASCs bei 2.400 × g zentrifugiert für 15 min. Die Überexpression von Chondrogenese bezogenen ECM wurde in Sphäroid Pellets aus zentrifugierten ASCs durch die Verwendung von Safranin O und Alcian-Blau-Färbung ausgewertet. Überexpression von Kollagen Typ 2 wurde durch Immunfluoreszenz unter Verwendung eines Antikörpers gegen Kollagen Typ bestätigt 2 und einem Alexa Fluor 594-konjugierten Sekundärantikörper (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm). Um die Wirkung von CG auf Chondrogenese bezogenen ECM-Überexpression zu bestimmen, ASCs wurden mit TGF-β1 (10 ng / ml) als Positivkontrolle behandelt. Die negative Kontrolle war eine Pelletkultur nicht CG Laden oder TGF-β1-Behandlung unterzogen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3 Abbildung 3. Chondrogene Aggregatbildung wird durch die Zentrifugalkraft die Schwerkraft in Mikromassenkulturen von Fettgewebe gewonnenen Stammzellen induziert. Zu induzieren chondrogene Differenzierung ASCs (2,5 × 10 5) wurden durch Zentrifugation bei 2.400 × g oder durch Behandlung mit TGF-β1 (10 ng / ml) stimuliert. Unstimulierten ASCs wurden als Kontrollen verwendet. Zu bilden micromasses Zellen (2,5 × 10 5/10 ul) wurden in der Mitte der Vertiefungen in einer Platte mit 24 Vertiefungen gegeben. Nach 2 h Inkubation wurde frisches Medium-CDM für Kontrollen und zentrifugiert ASCs und CDM enthaltend TGF-β1 (10 ng / ml) behandelt mit ASCs TGF-β1-wurde in die Vertiefungen gegeben, und die Proben wurden für 14 Tage inkubiert. Chondrozyten Kondensation wurde durch die Größe der Aggregate ausgewertet.

Abbildung 4
Abbildung 4. SOX9 ist upregreproduziert noch zentrifugale Schwerkraft in Fettgewebe gewonnenen Stammzellen. A) Hochregulation von SOX9 mRNA durch CG Stimulation für verschiedene Zeitintervalle. B) Sox9 Proteinexpression in CG-stimulierte ASCs zu verschiedenen Zeitpunkten. ASCs durften als Monolayer für 24 h nach Belastung CG zu wachsen. mRNA upregulation und die Proteinexpression von Sox9 wurden durch RT-PCR und Western Blotting bestätigt, respectively.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die stemness Zustand von Zellen ist sehr wichtig für CG-induzierten Überexpression von SOX9. In unserer Studie konnte SOX9 Expression von CG in frühen Passage ASCs (2-3), aber nicht in späteren Durchgang ASCs induziert werden. Es wurde berichtet , dass während der Kultivierung ASCs 16 CD34 + -Zellen bis 3 Passagen enthalten. ASCS neigen dazu, die Expression von CD34 zu verlieren, wie die Zellen passagiert werden, in einer geringen Reaktion auf CG führt.

Mit zentrifugale Schwerkraft kann hydrostatischen Druck auf Zellen während CG Stimulation geladen werden. Daher kann das Volumen des Mediums einer der Faktoren sein, die die Induktion von SOX9 beeinflussen. Zur Aufrechterhaltung wurde eine gleichmäßige hydrostatische Druckumgebung für jedes Experiment, 1 ml Medium pro 1 × 10 5 Zellen in einem 15-ml - Röhrchen verwendet. Zusätzlich wurde eine Schwenkbecherrotor gleichmäßig auftragen CG für die Zellen verwendet wird (um einen rechten Winkel bilden).

Im Vergleich zu TGF-β1 ergab CG eine geringere Fähigkeit,SOX9 und chondrogenen Marker-Expression in ASCS induzieren. Dies kann eine Einschränkung dieser Technik sein. Für eine klinische Anwendung sollte weiter untersucht werden , ob CG-stimulierte ASCs beeinträchtigter Knorpel zu regenerieren bis zur Ebene der normalen Funktion in einem in vivo - Modell.

In - vitro - Kultur mit Wachstumsfaktoren, insbesondere TGF-β1, ist die effektivste Methode chondrogene Differenzierung von Stammzellen 17 zu induzieren. Dieses Verfahren ist bekannt, für die Zellanreicherung und chondrogenen Differenzierungsinduktions nützlich. Jedoch treten früh Seneszenz und unerwartete lineage Differenzierung oft während der In - vitro - Kultur 18, 19. Gravierender ist das hohe Risiko der Kontamination von in - vitro - Kulturen. Auf der anderen Seite, unsere Methode erfordert keine in vitro chondrogene Differenzierung mit Wachstumsfaktoren. Stammzellen können in eine pa transplantiert werdentienten sofort nach der Isolierung und nach der Zentrifugation, die eine niedrige Kontaminationsrisiko und eine verkürzte Bearbeitungszeit garantieren kann. Die Mikroumgebung um Stammzellen ist entscheidend für chondrogenen Differenzierungsinduktion. Unerwartete lineage Differenzierung von einer nicht ordnungsgemäßen in vitro - Umgebung führen kann. Wie in unserem Verfahren erwähnt, weil zentrifugiert Stammzellen in den Knorpel eines Patienten transplantiert werden kann (die richtige Umgebung für die chondrogene Differenzierung) ohne zusätzliche Differenzierungsprozess, kann es zu unerwarteten lineage Differenzierung verringert werden.

Hier stellen wir ein Protokoll, das CG verwendet die chondrogene Differenzierung von ASCs zu induzieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass CG Sox9 upregulation und chondrogene Differenzierung Phänotypen in ASCs, einschließlich COL2A1-Überexpression, umfassen ECM Ablagerung und chondrogene Aggregatbildung induziert. Basierend auf unseren Ergebnissen, ausgesetzt die ASCS zu CG sind ein guter Ersatz für the MSCs mit TGF-β1 behandelt und damit in Transplantationen zur Knorpelregeneration verwendet werden können.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP 93100
60 mm Dish TPP 93060
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
ASC Culture Media Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
DMEM Low glucose Life Technologies 11885-084 growth base media
Penicilin Streptomycin Sigma Aldrich P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 10%
PBS/1 mM EDTA Life Technologies 12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose Life Technologies 11995 chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Life Technologies 11140-050
Dexamethasone Sigma Aldrich D2915 100 nM
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 1%
Ascorbate-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 50 μg/mL
L-proline Sigma Aldrich P5607 50 μg/mL
ITS BD 354352 1%
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Molecular Probe A-11037 1:200
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10x TBE Buffer Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs) Catholic MASTER Cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
  3. Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
  4. Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
  5. Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
  6. Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
  7. Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
  8. Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
  9. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  11. Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
  12. Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
  13. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  14. Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
  15. Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
  16. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
  17. Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
  18. Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
  19. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).

Tags

Entwicklungsbiologie Heft 120 mechanische Beanspruchung zentrifugale Schwerkraft SOX9 Chondrogenese Fettgewebe gewonnenen Stammzellen die Knorpelregeneration
Chondrogene Differenzierung Induktion von Fettgewebe gewonnene Stammzellen durch Zentrifugalkraft Gravity
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jang, Y., Jung, H., Ju, J. H.More

Jang, Y., Jung, H., Ju, J. H. Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity. J. Vis. Exp. (120), e54934, doi:10.3791/54934 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter