Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

doi: 10.3791/54934 Published: February 24, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פגמי סחוס במפרק לא לרפא באופן טבעי. כתוצאה מכך, השתלת תא גזע הוצעה גישה מבטיחה לתיקון סחוס לקוי. עם זאת, שיטה זו דורשת היא רכישת מספר מספיק של תאי גזע ואת האינדוקציה של תאים אלה כדי לעבור התמיינות chondrogenic. מח עצם (בע"מ) כבר בשימוש נרחב כמקור לתאי גזע, אבל בידוד תא מ- BM יש שני חסרונות עיקריים: הפולשנות ואת התשואה מספיק. בגלל הקלות של רכישתה, רקמת שומן היא מקור עדיף של תאי גזע. מחקרים קודמים הדגימו את ההיתכנות של בידוד תאי גזע מרקמות שומן התרמת בידול chondrogenic בתאים אלה באמצעות ציטוקינים, כגון TGF-β1 1, 2. שיטות אלו יעילות אבל יקרות.

כחלופה עלות נמוכה יותר כדי ציטוקינים, לחץ מכני יכול לשמשלהשרות התמיינות chondrogenic. העמסה מכאנית משחקת תפקיד קריטי בשמירה על הבריאות של סחוס במפרק 3, וזה יכול לגרום פנוטיפים chondrogenic בתאים שונים. לדוגמא, לחץ ההידרוסטטי גורם פנוטיפים chondrogenic ב ובתאים נגזרים synovium דרך מסלול קינאז / JNK MAP 4, ודחיסה מכאנית גורם chondrogenesis בתאי גזע mesenchymal אדם (MSCs) על ידי upregulating גני chondrocytic 5. בנוסף, מאמץ הגזירה תורם הביטוי של מטריקס הקשורות chondrogenesis (ECM) ב MSCs אדם 6. הכביד צנטריפוגלי (CG), מתח מכאני שיושם לשלוט בקלות שנוצר על ידי צנטריפוגה, יכול לגרום ביטוי גני הפרש בתאי 7. לדוגמה, בתאי קרצינומה אפיתל ריאות, הביטוי של אינטרלוקין (IL) -1b הוא upregulated ידי צנטריפוגה 8. Therefore, כמו לחץ מכאני מושרה באופן ניסיוני, CG יכול לשמש כדי לגרום ביטוי גני chondrocytic בתאי גזע. עם זאת, עדיין לא ברור האם CG יכול לגרום בידול chondrogenic של תאי גזע.

במחקר זה, מצאנו כי CG המושרה הגברת הביטוי של SOX9, רגולטור אדון chondrogenesis, ב ASCs האדם, וכתוצאה מכך ביטוי יתר של גנים chondrocytic. בנוסף, השווינו את ההשפעות של CG על chondrogenesis לאלה של β1 TGF, גורם הגדילה הנפוץ ביותר כדי לגרום במבחנה chondrogenesis בתאי גזע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול מחקר אושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי של האוניברסיטה הקתולית של קוריאה (KC16EAME0162) ובצע בהתאם להנחיות NIH. כל הרקמות התקבלו עם הסכמה מדעת בכתב.

1. טוען Gravity צנטריפוגלי ו גלולה תרבות

  1. תרבות קציר ניידים
    1. ASCs תרבות (P2-P3; לראות רשימה של חומרים) ברמת הגלוקוז הבינוני-הנמוך של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM-LG) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2.
    2. כאשר התאים מגיעים 80 מפגש%, לבטל את בינוני לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט 1x (PBS).
    3. הוסף 1 מ"ל של המכיל 1 PBS mM EDTA דגירה במשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 5% CO 2.
    4. הקש על צלחת תרבות בעדינות, להוסיף 4 מ"ל של מדיום חדש, ולהעביר את התאיםצינור חרוטי 15 מ"ל, ו צנטריפוגות התאים ב g 250 × 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  2. טעינה הכביד צנטריפוגלי
    1. לאחר צנטריפוגה (שלב 1.1.4), להסיר את supernatant מבלי להפריע גלולה ו resuspend גלולה ב 10 מ"ל של DMEM-LG עם 10% FBS. ספירת התאים באמצעות hemocytometer.
    2. לטעינת CG, להעביר 2.5 × 10 5 תאים לצינור צנטריפוגות 15 מיליליטר חרוטים חדשים g 2,400 × במשך 15 דקות.
  3. תרבות הגלולה
    1. מיד לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant ולהוסיף 500 μL של מדיום בידול chondrogenic מוגדר (CDM, גבוהה גלוקוז DMEM בתוספת 1% FBS, 1% Premix + ITS, 100 dexamethasone ננומטר, 1x MEM שאינם חיוניים פתרון חומצה אמינו, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​L-פרולין, ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין). הוסף 50 מיקרוגרם / מיליליטר של פוספט 2 המוכן טרי L-החומצה אסקורבית בכל החלפה בינונית. כביקורת חיובית, לגרום differentiati chondrogenicעל בתאים uncentrifuged ידי הוספת CDM המכיל 10 ng / mL TGF-β1.
    2. מניח את צינורות כתרים רופפים המכילים את הכדורים בעמידה לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת humidified המכילה 5% CO 2.
    3. שינוי המדיום פעם ביומיים למשך 3 שבועות.
  4. תרבות Micromass
    1. מיד לאחר צנטריפוגה (שלב 1.2.2; 2,400 גרם × במשך 15 דקות), לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 10 μL של CDM.
    2. כדי ליצור micromass, למקם את התאים resuspended במרכז באר צלחת 24 באר.
    3. לאחר 2 שעות, בזהירות להוסיף 1 מ"ל של CDM אל הבאר, pipetting אל הקיר של הצלחת כדי למנוע שיבוש micromass. כביקורת חיובית, לבצע תרבות micromass עם תאים uncentrifuged ידי הוספת CDM המכיל 10 ng / mL TGF-β1.
    4. דגירה micromass על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 2 5% CO.
    5. שנה את ev הבינוניery ימים למשך 3 שבועות.

2. תגובת שרשרת הפוך transcriptase-פולימראז (RT-PCR) כדי לאתר upregulation תעתיק של סמנים בידול Chondrogenic

  1. ביום 14, השתמש פיפטה להעביר את כדורי אליפטית לצינור 1.5 מיליליטר חדש ולשטוף אותם 1x PBS.
  2. חלץ את RNA הכולל את הכדורים בשיטת חילוץ פנול, כלורופורם thiocyanate guanidinium 9.
  3. לסנתז cDNA מ 2 מיקרוגרם של רנ"א סך באמצעות transcriptase הפוכה על פי הפרוטוקול של היצרן (לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 1 שעות ולאחר מכן לנטרל את האנזים ב 70 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות).
  4. בצע PCR עם פריימרים ספציפיים עבור סמני בידול chondrogenic 10.

3. מכתים לזהות את התבטאות יתר של חלבונים מרקר בידול Chondrogenic

  1. פרפין הטבעת כדורי תא
    1. ביום 21,להשתמש פיפטה לקצור את כדורי אליפטית ולשטוף אותם עם PBS 1x.
    2. תקן את כדורי אליפטית על ידי טבילה paraformaldehyde 4% במשך 24 שעות.
      זהירות: Paraformaldehyde היא רעילה ביותר. יש להימנע ממגע עם עיניים, עור, או ריריות. מזעור החשיפה ולהימנע משאיפת במהלך ההכנה. ללבוש ציוד מגן אישי מתאים.
    3. מחק את מקבע ולשטוף את כדורי תא עם מים ללא יונים (DW).
    4. מניח שכבה אחת של גזה על הקלטת ולהעביר את הכדורים הקבועים בעזרת פיפטה. מכסה את הכדור על ידי קיפול הגזה ולסגור את מכסת הקלטת.
    5. מייבש את הכדורים.
      1. לטבול את הכדורים ב 70% אתנול (EtOH) במשך 5 דקות ב RT.
      2. לטבול את הכדורים ב 80% EtOH במשך 5 דקות ב RT.
      3. לטבול את הכדורים ב 95% EtOH במשך 5 דקות ב RT.
      4. לטבול את הכדורים ב 100% EtOH במשך 5 דקות ב RT. חזור פעמיים.
      5. לטבול את כדורי קסילן 100% במשך 15 דקות ב RT. טווי חזורלִספִירַת הַנוֹצרִים.
    6. הטמע את כדורי תא הקבועים פרפין ב 56 מעלות צלזיוס בתוך תבנית; ניתן להטביע את הכדורים לתוך פרפין באמצעות מערכות עיבוד רקמות מיוחדות אוטומטיות.
    7. חותכים 5 חלקים מיקרומטר בעובי מן התא גלולה מוטבע פרפין באמצעות microtome סיבובית.
    8. Float את הסעיפים 50% EtOH ולאחר מכן להעביר אותם באמבט מים 50 ° C באמצעות שקופיות.
    9. מניחים את הסעיפים צף על גבי שקופיות.
  2. Safranin O ו כתמים כחולים Alcian
    1. רעננותם חלקי פרפין.
      1. לטבול את השקופיות קסילן במשך 15 דקות. חזור פעמיים.
      2. לטבול את השקופיות EtOH 100% במשך 5 דקות. חזור פעמיים.
      3. לטבול את השקופיות 90% EtOH למשך 5 דקות.
      4. לטבול את השקופיות EtOH 80% במשך 5 דקות.
      5. לטבול את השקופיות EtOH 70% במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם 1x PBS.
    2. כתם בסעיפי rehydrated עם 1% Safranin O פתרון ו -3% הכחולים Alcian עבור30 דק.
    3. מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את החלקים עם DW.
    4. הכתם בסעיפים עם פתרון Hematoxylin / Eosin (counterstain) 1 דקות.
    5. מחק את הפתרון מכתים ולשטוף את החלקים עם DW.
    6. מניחים ירידה של המדיום גובר על coverslip לאחר הסרת כל שאריות מים. בזהירות במקום להחליק (תא בצד למטה) על coverslip המכיל את המדיום גובר.
    7. אפשר השקופיות להתייבש במשך 2-3 שעות ב RT.
    8. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (מיקרוסקופ זקוף אוטומטי, 50X ו 200X).
  3. assay immunofluorescence
    1. רעננותם סעיפים כמפורט בסעיף 3.2.1.
    2. לטבול את שקופיות חיץ נתרן ציטרט (נתרן ציטרט 10 מ"מימ, 0.05% Tween 20, pH 6.0), ולאחר מכן לשמור אותם בטמפרטורה רותחת משנה עבור 10 דקות באמצעות מיקרוגל.
    3. מצננים את השקופיות עבור 20 דקות ב RT ולאחר מכן לשטוף אותם עם מי ברז.
    4. דגירת השקופיות ב 3%H 2 O 2 (ב 1x PBS) במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם עם מי ברז במשך 15 דקות 11.
    5. חסום את השקופיות עם חסימת חיץ (10% נסיוב עז נורמלי ב PBS) במשך שעה 1.
    6. לשאוב את הפתרון החוסם, ולאחר מכן להחיל נוגדן ראשוני מדולל 5% נסיוב עז נורמלי על השקופיות.
    7. דגירת שקופיות הלילה ב 4 ° C..
    8. שטפו את השקופיות שלוש פעמים 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    9. דגירה השקופיות ב נוגדנים משני מצומדות fluorochrome מדולל 5% נסיוב עז נורמלי במשך שעה 1 ב RT בחושך.
    10. שטפו את השקופיות שלוש פעמים 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד בחושך.
    11. דגירה השקופיות עם DAPI (1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף אותם פעמיים ב 1x PBS במשך 5 דקות כל אחד.
    12. מניחים ירידה של המדיום גובר על coverslip לאחר הסרת כל שאריות מים. בזהירות במקום להחליק (תא בצד למטה) על הרכבה בינונית.
    13. אפשר השקופיות להתייבש במשך 2-3h בחושך ב RT.
    14. דמיינו את השקופיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Rhod: 594 ננומטר, DAPI: 340 ננומטר; 60X והגדלה 200X) 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הכביד צנטריפוגלי ומשרה את ביטוי היתר של סמני בידול chondrogenic בתאי גזע שמקורם שומן.

כדי לקבוע את מידת כוח הכבידה צנטריפוגלי שרלוונטי להשרות התמיינות chondrogenic, ASCs היו מגורה עם דרגות שונות של CG (0, 300, 600, 1,200, ו -2,400 XG) במשך 15 דקות. לאחר גירוי, את ASCs היו מחדש זורעים לצלחות תרבות בתרבית למשך 24 שעות. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', ביטוי SOX9 mRNA הוגדל משמעותית ב- 2400 XG; זה היה כ 1.5 גבוה פי ב- 2400 XG מ בבקרה (ASCs לא עמוס CG). כדי לברר האם CG גורם בידול chondrogenic, אנו מגורה ASCs ידי טעינת CG או על ידי טיפול TGF-β1. כביקורת שלילית, ASCs היו בתרבית ללא כל גירוי. דוגמאות נבצרו ביום 14 ו qRT-PCR בוצעה. כפי שניתן לראות Figure 1, COL2A1 mRNA, סמן בידול נציג chondrogenic, היה שהוגברו ASCs מגורה על ידי קרוב משפחה CG לשלוט התאים (את ASCs unstimulated). רמת הגברת הביטוי של COL2A1 mRNA על ידי גירוי CG היה דומה לזה המושרה על ידי טיפול TGF-β1. מצד שני, COL10, סמן של כונדרוציטים היפרטרופית, היה downregulated ידי גירוי CG. Acan mRNA, מקודד מרכיב מבני גדול של סחוס במפרק, היה upregulated כ פי 2 על ידי גירוי CG, ואילו col1 לא היה יחסית גבוהים במובחן לבקרות. לא Acan ולא col1 היו שהוגבר ASCs שטופל-β1 TGF.

הכביד צנטריפוגלי גרם הביטוי של מטריקס הקשורות chondrogenesis בתרבות הגלולה של תאי גזע שמקורם שומן.

לְהַפְקִיד יון של ECM, כגון glycosaminoglycan, הוא פנוטיפ ההיכר של בידול chondrogenic. כדי לזהות את החומר הזה, אנחנו מוכתמים גלולה תרבותי ASCs עם Safranin O וכחול Alcian ביום 21. כפי שניתן לראות בתרשים 2A, ASCs מגורה עם CG שהופקדו יותר glycosaminoglycan (אדום עבור Safranin O וכחול עבור כחול Alcian) בהשוואה לקבוצת הביקורת, בכל רמה דומה לזו שהופקדה על ידי ASCs שטופל-β1 TGF. בניסויים אלה, מכתים חיובי הצביע על ההיווצרות של מטריצת סחוס. לקבלת אישור נוסף, אנחנו במעקב הביטוי של חלבון COL2A1 באמצעות נוגדן אנטי COL2A1 PE מצומדות. COL2A1 היה ביטוי יתר ASCs מגורה עם CG במידה רבה יותר במקצת מזה של ASCs שטופלו-β1 TGF (איור 2 ב).

היווצרות המצרפי Chondrogenic מושרה על ידי כוח הכבידה צנטריפוגלי בתרבות micromass של תאי גזע שמקורם השומן.

ether.within-page = "1"> היווצרות צבירת chondrogenic (או עיבוי) היא תנאי הכרחי בידול chondrogenic 13. לכן, השווינו התעבות micromass בין התרבויות של ASCs המלא ASCs מגורה עם CG או-β1 TGF. כפי שניתן לראות בתרשים 3, גדולים צפופים מצבורים של ASCs (בצבע לבן בכיכר המקווקות) התגלו בתרבויות micromass עשויים ASCs מגורה עם CG או TGF-β1 מאשר בתרבויות שליטה.

SOX9 הוא שהוגבר על ידי כוח הכביד צנטריפוגלי בתאי גזע שמקורם שומן.

Sox9 הוא רגולטור של בידול chondrogenic 14, 15. על מנת לקבוע האם CG גורם גברת הביטוי של Sox9 ב ASCs, אנחנו במעקב בעת SOX9 mRNA ב ASCs חשוף משכים שונים של CG stimulation (2,400 גרם ×). ביטוי SOX9 נחקר בבית בדרגות שונות של CG, אבל זה לא היה שונה באופן משמעותי בין תנאי CG עם כוחות גדולים מ -2,400 גרם × (מידע לא מוצג). ביטוי של SOX9 mRNA החל להגדיל לאחר 15 דקות של גירוי CG, וזה היה רווי אחרי 30 דק '(איור 4 א). בשלב הבא, כדי לקבוע כיצד ביטוי יתר Sox9 CG-induced ארוך יכול להישמר מסקנו ASCs CG-מגורה בנקודות הזמן המצוין וליווה את הביטוי של Sox9. כפי שניתן לראות בתרשים 4 ב ', את הביטוי של חלבון Sox9 גדל עד 3 שעות לאחר גירוי CG ונשאר ברמה זו במשך שעות 12 לפחות.

איור 1
איור 1. צנטריפוגלי הכביד גורם גברת הביטוי של סמני בידול chondrogenic בתאי גזע שומן נגזר. א) כדי לקבוע כמוכוח הכבידה צנטריפוגלי uitable, ASCs היו centrifuged ב CG שונים (0, 300, 600, 1,200, ו -2,400 XG) במשך 15 דקות. ביטוי mRNA SOX9 הוערך ב 24 שעות לאחר גירוי CG. B) כדי להעריך את הביטוי של גנים הקשורים chondrogenesis, RNA הכולל היה שחולץ מן ASCs שהיה centrifuged, שטופל-β1 TGF (10 ng / mL), או unstimulated (שולט). רנ"א היה נתון הפוך שעתוק לסנתז cDNA, אשר היה מוגבר מכן על ידי RT-PCR. כל הניסויים בוצעו לפחות שלוש פעמים. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. ** P <0.01 עבור ASCs מגורה עם CG לעומת קבוצת ביקורת (ASCs הלא מגורה).

איור 2
איור 2. הכבידה צנטריפוגלי משרה מטריקס הקשורות chondrogenesis בתרבויות גלולות של תאי גזע שמקורם שומן. א) בפורמט מטריקס proteoglycanיון ידי טעינת CG. B) ביטוי יתר נגרמת CG של קולגן מסוג 2. לטעינת CG, ASCs היה centrifuged ב 2,400 גרם × במשך 15 דקות. ביטוי היתר של ECM chondrogenesis הקשורות הוערך כדורי אליפטית מורכב ASCs centrifuged באמצעות Safranin O ו כתמי כחולי Alcian. התבטאות יתר של קולגן מסוג 2 אושרה על ידי immunofluorescence באמצעות נוגדן נגד קולגן מסוג 2 ו נוגדן משני אלקסה פלואוריד 594 מצומדות (Rhod: 594 ננומטר, DAPI: 340 ננומטר). כדי לקבוע את ההשפעה של CG על ביטוי יתר ECM הקשורות chondrogenesis, ASCs טופלו-β1 TGF (10 ng / mL) כביקורת חיובית. השליטה השלילית הייתה תרבות גלולה לא נתונה טעינת CG או טיפול TGF-β1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 איור 3. היווצרות המצרפי Chondrogenic מושרה על ידי כוח הכבידה צנטריפוגלי בתרבויות micromass של תאי גזע שמקורם השומן. כדי להשרות התמיינות chondrogenic, ASCs (2.5 × 10 5) היו מגורה על ידי צנטריפוגה ב 2400 גרם × או על ידי טיפול עם TGF-β1 (10 ng / mL). ASCs unstimulated שמש שולט. כדי ליצור micromasses, תאים (2.5 × 10 5/10 μL) הונחו במרכז בארות צלחת 24 באר. לאחר 2 שעות של דגירה, טרי בינוני-CDM עבור בקרות centrifuged ASCs ו CDM המכילים β1 TGF (10 ng / mL) עבור ASCs שטופלו TGF-β1-נוספה בארות, ואת דגימות הודגרו במשך 14 ימים. עיבוי הכונדרוציטים הוערך על ידי הגודל של אגרגטים.

איור 4
איור 4. SOX9 הוא upregulated על ידי כוח הכבידה צנטריפוגלי בתאי גזע שמקורם השומן. א) הגברת הביטוי של SOX9 mRNA על ידי גירוי CG עבור מרווחי זמן שונים. B) Sox9 ביטוי החלבון ASCs מגורה CG בנקודות זמן שונות. ASCs הורשה לגדול ככל monolayer במשך 24 שעות לאחר טעינת CG. גברת ביטוי mRNA ואת ביטוי החלבון של Sox9 אושרו על ידי RT-PCR ו מערבי סופגים, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מדינת stemness של תאים חשובה מאוד עבור ביטוי יתר נגרמת CG של SOX9. במחקר שלנו, ביטוי SOX9 יכול להיגרם על ידי CG ב ASCs מוקדם-חלוף (2-3), אך לא ASCs-מעבר מאוחר יותר. זה כבר דווח כי, במהלך טיפוח, ASCs מכיל CD34 + תאים עד 3 קטעים 16. ASCs נוטה לאבד את הביטוי של CD34 כמו התאים passaged, וכתוצאה מכך תגובה נמוכה כדי CG.

עם כוח הכבידה צנטריפוגלי, הלחץ ההידרוסטטי ניתן הועמסו על התאים במהלך הגירוי CG. לכן, נפח בינוני עשוי להיות אחד הגורמים המשפיעים על אינדוקציה של SOX9. כדי לשמור על סביבה הלחץ ההידרוסטטי אפילו עבור כל ניסוי, 1 מ"ל של מדיום שימש לכל 1 × 10 5 תאים צינור של 15 מ"ל. בנוסף, רוטור תנופה-דלי שמש ליישם CG באופן שווה על התאים (על ידי יצירת זווית ישרה).

לעומת TGF-β1, CG וגילתה יכולת נמוכה יותרלהשרות SOX9 וביטוי סמן chondrogenic ב ASCs. זה עשוי להיות מגבלה של טכניקה זו. עבור יישום קליני, זה צריך להיחקר עוד אם ASCs מגורה CG להתחדש סחוס לקוי עד לרמה של תפקוד תקין במודל vivo.

בתרבות במבחנה עם גורמי גדילה, במיוחד TGF-β1, היא השיטה היעילה ביותר כדי להשרות התמיינות chondrogenic של תאי גזע 17. שיטה זו ידועה להיות שימושי עבור העשרה תא ואינדוקצית בידול chondrogenic. עם זאת, הזדקנות מוקדמת והבחנת שושלת ולעתים בלתי צפויה להתרחש במהלך במבחנת התרבות 18, 19. חמור יותר הוא בסיכון הגבוה של זיהום בתרבויות במבחנה. מצד השני, השיטה שלנו אינה דורשת בידול chondrogenic במבחנה עם גורמי גדילה. ניתן להשתיל תאי גזע לתוך patient מייד לאחר בידוד צנטריפוגה הבא, אשר עשוי להבטיח סיכון זיהום נמוך וזמן עיבוד מקוצר. במיקרו-סביבה סביב תאי גזע הוא קריטי לזירוז בידול chondrogenic. בידול שושלת צפוי להיגרם מאי פסול בסביבה חוץ גופייה. כאמור בשיטה שלנו, כי תאי גזע centrifuged ניתן להשתיל לתוך הסחוס של חולה (הסביבה הנכונה לבידול chondrogenic) ללא תהליך התמיינות נוסף, בידול שושלת הלא צפוי עשוי להיות ירידה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשתמשת CG להשרות התמיינות chondrogenic של ASCs. התוצאות שלנו מראות כי CG גורם upregulation Sox9 פנוטיפים בידול chondrogenic ב ASCs, כולל ביטוי יתר COL2A1, בתצהיר ECM נרחב יותר, ואת היווצרות המצרפי chondrogenic. בהתבסס על התוצאות שלנו, ASCs החשוף CG הוא תחליף טוב עבור הMSCs הדואר שטופל-β1 TGF ולכן עשוי לשמש השתלות להתחדשות סחוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
100 mm Dish TPP 93100
60 mm Dish TPP 93060
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
ASC Culture Media Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
DMEM Low glucose Life Technologies 11885-084 growth base media
Penicilin Streptomycin Sigma Aldrich P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 10%
PBS/1 mM EDTA Life Technologies 12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose Life Technologies 11995 chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Life Technologies 11140-050
Dexamethasone Sigma Aldrich D2915 100 nM
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 1%
Ascorbate-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 50 μg/mL
L-proline Sigma Aldrich P5607 50 μg/mL
ITS BD 354352 1%
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Molecular Probe A-11037 1:200
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10x TBE Buffer Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs) Catholic MASTER Cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9, (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290, (2), 763-769 (2002).
  3. Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7, (5), 619-636 (1989).
  4. Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16, (7), 805-814 (2008).
  5. Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16, (2), 575-584 (2010).
  6. Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5, (9), 722-732 (2011).
  7. Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13, (2), 154-161 (2005).
  8. Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9, (5), 1142-1143 (2002).
  9. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  11. Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133, (11), 2601-2608 (2013).
  12. Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
  13. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87, (4), 351-371 (2009).
  14. Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16, (21), 2813-2828 (2002).
  15. Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17, (4), 2336-2346 (1997).
  16. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51, (2), 142-150 (2015).
  17. Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32, (21), 4793-4805 (2011).
  18. Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443, (7110), 421-426 (2006).
  19. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).
Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jang, Y., Jung, H., Ju, J. H. Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity. J. Vis. Exp. (120), e54934, doi:10.3791/54934 (2017).More

Jang, Y., Jung, H., Ju, J. H. Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity. J. Vis. Exp. (120), e54934, doi:10.3791/54934 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter