Introduction
在关节软骨缺损不自然愈合。因此，干细胞移植已被提出作为削弱的软骨的修复一个有前途的方法。然而，该方法需要有足够数量的干细胞的同时获取和这些细胞的诱导来进行软骨细胞分化。骨髓（BM）已被广泛使用作为干细胞的来源，但是从骨髓细胞分离有两个主要的缺点：侵袭和产量不足。因为它易于获得的，脂肪组织是干细胞的一个优选来源。以往的研究表明，从脂肪组织中分离干细胞和诱导用细胞因子，如TGF-β11,2这些细胞软骨分化的可行性。这些方法是有效的，但价格昂贵。
作为一个成本较低的替代细胞因子，机械应力可以用来诱导软骨细胞分化。机械加载在维持关节软骨3的健康至关重要的作用，并且它可以诱导各种细胞软骨表型。例如，静水压经由MAP激酶/ JNK途径4诱导滑膜衍生的祖细胞的软骨形成的表型，和机械压缩通过上调软骨基因5诱导软骨在人类间质干细胞（MSCs）。此外，剪切应力有助于软骨相关的细胞外基质（ECM）的人MSC 6的表达。离心重力（CG），离心产生很容易地应用和控制的机械应力，可诱导细胞7差异表达基因。例如，在肺上皮癌细胞，白细胞介素（IL）-1b的表达通过离心8上调。 ŧherefore，作为实验诱导机械应力，CG可用于诱导干细胞软骨基因表达。然而，它的CG能否诱导干细胞的软骨细胞分化还不清楚。
在这项研究中，我们发现，CG诱导SOX9的上调，软骨的主要调控，在人类携带者，导致软骨细胞基因的过度表达。此外，我们比较的CG上与TGF-β1的软骨的影响，生长因子最常用于在体外诱导软骨中的干细胞。
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Protocol
该研究方案是根据美国国立卫生研究院的指导方针批准由韩国天主教大学（KC16EAME0162）的机构审查委员会和执行。与书面知情同意书，得到的所有组织。
1.离心重力加载和颗粒文化
- 细胞培养和收获
- 培养的ASC（P2-P3;见材料的列表）在补充有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素（P / S）的Dulbecco改良的Eagle氏培养基，低葡萄糖（DMEM-LG）中于37℃下在含有5％CO 2的加湿培养箱。
- 当细胞达到80％汇合时，丢弃培养基，用5ml 1×磷酸盐缓冲盐水的（PBS）洗涤细胞。
- 添加1毫升的PBS含1mM EDTA的的并在含有5％CO 2的潮湿培养箱中于37℃孵育2分钟。
- 轻轻敲击培养板中，添加4毫升新鲜培养基中，将细胞转移到有15毫升锥形管，并离心将细胞在250×g下在室温（RT）下2分钟。
- 离心重力加载
- 离心（步骤1.1.4）后，除去上清而不会干扰沉淀并用10％的FBS重悬在10mL的DMEM-LG的沉淀。算使用血球细胞。
- 对于CG装载，转移2.5×10 5个细胞到一个新的15毫升锥形管和离心机2400×g的15分钟。
- 团培养
- 立即离心后，吸出上清液，并添加定义软骨分化培养基500μL的（CDM，高糖DMEM补充有1％FBS，1％ITS +预混料，100nM的地塞米松，1×MEM非必需氨基酸溶液，50微克/ mL的L-脯氨酸，和1％青霉素/链霉素）。在每次更换培养基添加新鲜制备的L-抗坏血酸-2-磷酸的50微克/毫升。作为阳性对照，诱导软骨differentiati在uncentrifuged细胞通过加入CDM含有10纳克/毫升TGF-β1。
- 放置装有粒料松散封管在站立位置并在含有5％CO 2的潮湿培养箱中于37℃孵育。
- 改变介质隔日3周。
- 微团培养
- 离心（步骤1.2.2; 2400×g的15分钟）后，立即吸出上清液和悬浮颗粒在CDM的10微升。
- 为了形成微团，将重悬的细胞在24孔板的孔的中心。
- 2小时后，小心地加入1毫升CDM向好，对板材的墙吸液，以免破坏微团。作为阳性对照，通过将含有10纳克/毫升TGF-β1的CDM执行与uncentrifuged细胞微团培养。
- 孵育在37℃的微团在含5％CO 2的加湿培养箱。
- 改变介质EVERY一天3周。
2.逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测软骨分化标志转录上调
- 在第14天，用一个移液管，以1×PBS中的球体粒料转移到一个新的1.5毫升管中并把它们洗干净。
- 提取使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法9颗粒中的总RNA。
- 从根据制造商的方案使用逆转录酶的总RNA的2微克合成cDNA（孵育在42℃进行1小时，然后使酶失活，在70℃，5分钟）。
- 用特异于软骨细胞分化标志物10的引物进行PCR。
3.染色检测软骨分化标志蛋白的表达
- 石蜡包埋细胞团
- 在第21天，用吸管收获球体粒料和用1×PBS洗涤。
- 固定在4％低聚甲醛通过浸渍球体粒料24小时。
注意：多聚甲醛是高毒。避免与眼睛，皮肤或粘膜接触。尽量减少暴露，并避免在制备过程中吸入。穿戴合适的个人防护装备。 - 丢弃固定液和冲洗用去离子水（DW）的细胞沉淀。
- 放置纱布一层到所述盒，并用移液管转移固定粒料。通过折叠的纱布覆盖颗粒并关闭盒盖。
- 脱水粒料。
- 沉浸在70％乙醇（EtOH中）的粒料在室温下5分钟。
- 沉浸在80％EtOH中的粒料在室温下5分钟。
- 沉浸在95％EtOH中的粒料在室温下5分钟。
- 浸泡在100％的乙醇的粒料在室温下5分钟。重复两次。
- 浸泡在100％二甲苯粒料在室温15分钟。重复TWICE。
- 嵌入在石蜡中固定细胞沉淀在56℃下在模具中;粒料可以使用专门的自动组织处理系统被嵌入到石蜡中。
- 从用旋转切片机的石蜡包埋细胞沉淀切成5微米厚的切片。
- 浮动部分在50％EtOH中，然后用幻灯片将它们转移到50℃的水浴中。
- 浮动部分放置到幻灯片。
- 番红O和阿尔新蓝染色
- 再水合石蜡切片。
- 沉浸在二甲苯幻灯片15分钟。重复两次。
- 浸泡在100％EtOH中的幻灯片5分钟。重复两次。
- 沉浸在90％EtOH中的幻灯片5分钟。
- 沉浸在80％EtOH中的幻灯片5分钟。
- 浸入70％乙醇的幻灯片5分钟，然后把它们洗干净在1X PBS。
- 染色再水化切片用1％的番红O解决方案和3％阿尔新蓝为30分钟。
- 丢弃染色液并用DW冲洗部分。
- 染色用苏木精/曙红溶液（染液）中1分钟的部分。
- 丢弃染色液并用DW冲洗部分。
- 将安装介质上盖玻片下降消除任何残余的水后。小心地将含所述安装平台盖玻片滑动（细胞面朝下）。
- 允许载片干燥，在室温2-3小时。
- 使用明场显微镜（自动直立式显微镜，50倍和200倍）拍摄图像。
- 再水合石蜡切片。
- 免疫荧光法
- 补充水分的章节，如第3.2.1所述。
- 沉浸在柠檬酸钠缓冲液的幻灯片（10mM柠檬酸钠，0.05％吐温20，pH 6.0）中，然后用微波在子沸点温度保持他们10分钟。
- 酷幻灯片在室温下20分钟，然后用自来水清洗。
- 孵育载玻片在3％的 H 2 O 2（在1×PBS）中15分钟，然后把它们洗干净用自来水15分钟11。
- 封锁1小时封闭缓冲液（在PBS中的10％正常山羊血清）的幻灯片。
- 吸出封闭溶液，然后应用，用5％正常山羊血清稀释到幻灯片的第一抗体。
- 过夜孵育载玻片于4℃。
- 洗玻片三次在1×PBS中，每次5分钟。
- 孵育在黑暗用5％正常山羊血清在RT稀释1小时荧光标记的第二抗体的幻灯片。
- 洗玻片三次在1×PBS中，在黑暗中，每次5分钟。
- 孵育载玻片用DAPI（1微克/毫升）10分钟，然后把它们洗干净两次在1×PBS中，每次5分钟。
- 将安装介质上盖玻片下降消除任何残余的水后。小心地将安装介质上的滑动（细胞面朝下）。
- 允许的幻灯片干燥2-3在RT的黑暗小时。
- 可视化使用荧光显微镜玻片（RHOD：594纳米，DAPI：340纳米; 60X和200倍）12。
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Representative Results
离心重力诱导的脂肪来源的干细胞的软骨形成分化标记物的表达。
以确定的离心力重力是适于诱导软骨细胞分化的程度，携带者用15分钟不同程度的CG（0，300，600，1200，2400 XG）刺激。刺激之后，将携带者进行了重新接种到培养板和培养24小时。如在图1A中所示，SOX9 mRNA表达显著2400 xg离心增加;它是约2400 XG比（携带者未装载有CG）的控制1.5倍。要确认是否CG诱导软骨分化中，我们通过CG装载或TGF-β1处理刺激携带者。作为阴性对照，携带者是无任何刺激培养。样品收集在第14天，并进行定量RT-PCR检测。如图F中igure 1，COL2A1基因，具有代表性的软骨细胞分化的标记，在由CG相对刺激来控制细胞（未刺激的ASC）携带者上调。由CG刺激COL2A1 mRNA的上调水平相似，由TGF-β1处理诱导。另一方面，COL10，肥大软骨细胞的标记物，是由CG刺激下调。 ACAN的mRNA，其编码的关节软骨的主要结构部件，由CG刺激上调约2倍，而COL1相对于对照检测地升高不是。无论是禁毒常务委员会也不COL1与TGF-β1治疗的ASC上调。
离心重力诱导脂肪来源的干细胞的沉淀培养物软骨相关细胞外基质的表达。
存款ECM的离子，如葡糖胺聚糖，是软骨细胞分化的标志表型。为了检测这种材料，我们沾了藏红和21天阿辛兰颗粒培养的ASCs 如图2a所示，用CG刺激的ASC沉积比对照组多聚糖（红色藏红和蓝色阿尔新蓝），在类似于由与TGF-β1处理的ASCs沉积水平。在这些实验中，阳性染色指示的软骨基质的形成。为了进一步确认，我们采用PE标记的抗COL2A1抗体监测COL2A1蛋白的表达。 COL2A1是与CG刺激比在与TGF-β1（ 图2B）处理的ASCs稍微更大程度的ASCs过表达。
软骨聚集体形成是通过离心重力在脂肪来源的干细胞的微团培养诱导。
13的先决条件。因此，我们比较了与CG或TGF-β1刺激的对照携带者的文化和先进的结构陶瓷的微团凝结。正如图3所示，在由与CG或TGF-β1刺激的比在对照培养的ASC的微团培养物中检测到的更大和更密集的ASC（白色中的虚线正方形）的聚合。
SOX9通过离心重力在脂肪来源的干细胞上调。
SOX9是软骨分化14，15的主调节器。以确定的CG是否诱导的Sox9在携带者的上调，我们监测暴露于CG stimula的不同时间的ASC SOX9 mRNA的表达化（2 400×克）。不同程度的CG SOX9的表达进行了研究，但它并没有与部队2400×g以上CG条件中显著差异（数据未显示）。 SOX9 mRNA的表达开始的CG刺激15分钟后增加，并且它在30分钟后（ 图4A）饱和。接着，为了确定长CG诱导Sox9的表达可以如何进行维护，我们收获在所指示的时间点的CG刺激的ASC和监视Sox9的表达。 如图4B所示，Sox9的蛋白的表达增加，直到CG刺激后3小时，保持在这一水平至少12小时。
图1. 离心重力诱导的脂肪来源的干细胞的软骨形成分化标志物的上调。 A）确定为uitable离心重力，携带者在不同的CG（0，300，600，1200，2400 XG）15分钟，离心。 SOX9 mRNA表达在CG刺激后24小时进行评价。 b）评估的软骨相关基因的表达，总RNA从已被离心的ASC，用TGF-β1处理的萃取（10毫微克/毫升），或无刺激（对照）。将RNA进行逆转录以合成cDNA，然后将其通过RT-PCR扩增。所有实验均进行至少三次。误差棒代表标准偏差。 ** P <0.01与CG刺激与对照组（无刺激的ASC）携带者。
图2. 离心重力诱导脂肪来源的干细胞的沉淀培养物一软骨相关的细胞外基质。 A）蛋白多糖矩阵格式由CG装载离子。 B）的型胶原2.对于CG装货CG诱导表达，携带者2400×g离心15分钟。软骨相关ECM的过度表达通过利用番红O和阿尔新蓝染色组成离心携带者的球形颗粒进行了评估。 （：594纳米，DAPI：340纳米RHOD）型胶原2的过表达用针对胶原II型抗体和的Alexa Fluor 594缀合的二级抗体通过免疫荧光证实。以确定的CG上软骨相关的ECM过表达的影响，携带者用TGF-β1（10毫微克/毫升）作为阳性对照。阴性对照是未进行CG装载或TGF-β1处理的粒料培养。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 软骨聚集体形成是通过在脂肪来源的干细胞的微团培养离心重力引起。为了诱导软骨细胞分化，携带者（2.5×10 5），通过离心2400×g或通过用TGF-β1（10毫微克/毫升）的治疗的刺激。未刺激的ASC用作对照。为了形成micromasses，细胞（2.5×10 5/10微升）被放置在孔的24孔板的中心。温育后，新鲜培养基-CDM用于控制与处理过的ASCs 2小时并离心携带者和CDM含有TGF-β1（10毫微克/毫升）后，TGF-β1加入到孔中，将样品温育14天。软骨细胞缩合由聚集体的大小进行评价。
图4. SOX9是upreg通过离心重力在脂肪来源的干细胞ulated。 SOX9基因的）通过上调刺激CG的时间不同的时间间隔。 B）在不同时间点的CG刺激的ASC Sox9的表达。携带者被允许生长作为CG负荷后24小时的单层。表达上调和Sox9的蛋白表达，用RT-PCR和Western blot分别证实。
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Discussion
细胞的干性状态为SOX9的CG诱导过表达非常重要的。在我们的研究中，SOX9的表达可以通过CG在早期传代的ASC（2-3）引起的，而不是在后面通道的ASC。已经报道的是，在培养过程中，携带者包含CD34 +细胞，直至3代16。的ASCs往往失去的CD34的表达作为将细胞传代，从而产生至CG低响应。
离心重力，静水压力可以刺激CG过程中加载到细胞。因此，介质的体积可能是影响SOX9的诱导的因素之一。维护每个实验偶数静水压力的环境中，在每1×10 5个细胞用在一个15毫升管1毫升培养基。此外，摆动斗转子被用来均匀涂抹CG到细胞中（通过形成直角）。
相比，TGF-β1，CG呈现低能力诱导携带者SOX9和软骨细胞标志物的表达。这可能是这种技术的限制。对于临床应用，应当进一步研究的CG刺激的ASC是否再生软骨受损到正常功能的在体内模型中的水平。
在用生长因子，尤其是TGF-β1 体外培养，是诱导干细胞17的软骨细胞分化的最有效的方法。这种方法是已知的用于细胞的富集和软骨形成分化诱导有用。然而，早期的衰老和意想不到的谱系分化在体外培养18，19时经常发生。更为严重的是污染排出体外培养的高风险。另一方面，我们的方法不与生长因子体外软骨细胞分化需要。干细胞可移植到一个巴tient后立即分离和离心后，其可保证一个低污染的风险，并缩短处理时间。围绕干细胞微环境是软骨细胞分化诱导是关键。意想不到谱系分化可能导致不正确的体外环境。如在我们的方法所提到的，因为离心干细胞可以在没有附加的分化过程被移植到患者体内（为软骨细胞分化的适当的环境）的软骨，意想不到谱系分化可能降低。
这里，我们目前使用CG诱导的ASC的软骨细胞分化的协议。我们的结果表明，CG诱导Sox9的上调和携带者软骨分化的表型，包括COL2A1表达，更广泛的细胞外基质沉积和软骨聚集体形成。根据我们的结果，暴露CG的携带者是个很好的替代品È的MSC用TGF-β1处理的，因此可能在移植用于软骨再生使用。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
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