Introduction
Defekter i ledbrusk ikke heler naturligt. Derfor celle transplantation er blevet foreslået som en lovende tilgang til reparation af forringet brusk stammer. Men denne metode kræver både erhvervelse af et tilstrækkeligt antal af stamceller og induktion af disse celler til at undergå chondrogen differentiering. Knoglemarv (BM) er blevet almindeligt anvendt som en kilde til stamceller, men celleisolering fra BM har to store ulemper: invasionsevne og utilstrækkelig udbytte. På grund af den lette erhvervelse, fedtvæv er en foretrukken kilde til stamceller. Tidligere undersøgelser demonstrerede gennemførligheden af at isolere stamceller fra fedtvæv og inducere chondrogen differentiering i disse celler ved anvendelse cytokiner, såsom TGF-β1 1, 2. Disse fremgangsmåder er effektive, men dyre.
Som en billigere alternativ til cytokiner, kan mekanisk belastning anvendes tilinducere chondrogen differentiering. Mekanisk belastning spiller en kritisk rolle i opretholdelsen af sundhed ledbrusken 3, og det kan inducere chondrogene fænotyper i forskellige celler. For eksempel, hydrostatisk tryk fremkalder chondrogene fænotyper i synovium progenitorceller via MAP-kinase / JNK-banen 4, og mekanisk kompression inducerer chondrogenese i humane mesenkymale stamceller (MSC'er) ved opregulering chondrocytisk gener 5. Desuden forskydningsspænding bidrager til ekspressionen af chondrogenese-relateret ekstracellulær matrix (ECM) i humane MSC'er 6. Centrifugal tyngdekraft (CG), en let anvendt og kontrolleret mekanisk spænding genereret ved centrifugering, kan inducere differentiel genekspression i celler 7. For eksempel i lungeepitelceller carcinomceller er ekspressionen af interleukin (IL) -1b opreguleres ved centrifugering 8. Therefore, som en eksperimentelt inducerbar mekanisk stress, CG kan anvendes til at inducere chondrocytisk genekspression i stamceller. Men det er uklart, om CG kan fremkalde den chondrogene differentiering af stamceller.
I denne undersøgelse fandt vi, at CG inducerede opregulering af Sox9, en master regulator af chondrogenese, i humane ASC'er, hvilket resulterer i overekspression af chondrocytisk gener. Desuden har vi sammenlignede virkningerne af CG på chondrogenese med de TGF-β1, vækstfaktor mest almindeligt anvendte til at fremkalde in vitro chondrogenese i stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse protokol blev godkendt af institutionelle gennemgang bestyrelse det katolske universitet i Korea (KC16EAME0162) og udføres i henhold til NIH retningslinjer. Alle væv blev opnået med skriftligt informeret samtykke.
1. Centrifugal Gravity Loading og pillefyr Kultur
- Celledyrkning og høst
- Kultur ASC'er (P2-P3, se liste over materialer) i Dulbeccos modificerede Eagles medium-low glucose (DMEM-LG) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S) ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2.
- Når cellerne når 80% konfluens, kasseres mediet og vaskes cellerne med 5 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS).
- Tilsæt 1 ml PBS indeholdende 1 mM EDTA og inkuberes i 2 minutter ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2.
- Tryk på kultur pladen forsigtigt, tilsættes 4 ml frisk medium, overføre cellerne til15 ml konisk rør, og centrifuger cellerne ved 250 x g i 2 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Centrifugal tyngdekraften lastning
- Efter centrifugering (trin 1.1.4), supernatanten fjernes uden at forstyrre pellet og pellet resuspenderes i 10 ml DMEM-LG med 10% FBS. Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer.
- For CG lastning, overføre 2,5 × 10 5 celler til en ny 15-mL konisk rør og centrifugeres ved 2.400 x g i 15 minutter.
- pellet kultur
- Umiddelbart efter centrifugering aspireres supernatanten og tilsæt 500 pi defineret chondrogen differentiering medium (CDM, høj-glucose DMEM suppleret med 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM dexamethason, 1x MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning, 50 ug / mL L-prolin, og 1% penicillin / streptomycin). Tilsæt 50 ug / ml frisk fremstillet L-ascorbinsyre 2-phosphat ved hvert medium forandring. Som en positiv kontrol, fremkalde chondrogene differentiatiindenfor ikke-centrifugerede celler ved tilsætning CDM indeholdende 10 ng / mL TGF-β1.
- Placer løst lukkede rør indeholdende pillerne i en stående stilling og inkuberes ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2.
- Skift medium hver anden dag i 3 uger.
- mikromassekultur
- Umiddelbart efter centrifugering (trin 1.2.2, 2400 × g i 15 min), aspireres supernatanten og pellet resuspenderes i 10 pi CDM.
- Til dannelse af en mikromasse, placere de resuspenderede celler i centrum af en brønd i en plade med 24 brønde.
- Efter 2 timer forsigtigt tilsættes 1 ml CDM til brønden, pipettering mod væggen af pladen for at undgå at forstyrre mikromasse. Som en positiv kontrol, udføre en mikromassekultur med ikke-centrifugerede celler ved tilsætning af CDM indeholdende 10 ng / mL TGF-β1.
- Inkuber mikromasse ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO2.
- Skift medium every anden dag i 3 uger.
2. revers transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR) for at detektere transkriptionelle opregulering af chondrogensupplering differentieringsmarkører
- På dag 14, skal du bruge en pipette til at overføre sfæroide pellets til en ny 1,5-ml rør og vaske dem i 1x PBS.
- Ekstraher totalt RNA fra pellets under anvendelse af guanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion metode 9.
- Syntetisere cDNA fra 2 ug totalt RNA under anvendelse af revers transkriptase ifølge fabrikantens protokol (inkuber ved 42 ° C i 1 time og derefter inaktivere enzymet ved 70 ° C i 5 minutter).
- Udfør PCR med primere specifikke for chondrogene differentieringsmarkører 10.
3. Farvning at Detect overekspression af chondrogen differentieringsmarkør Proteiner
- Paraffin-indlejring cellepellets
- På dag 21,bruge en pipette til at høste sfæroide pellets og vaske dem med 1x PBS.
- Fastgør sfæroide pellets ved nedsænkning i 4% paraformaldehyd i 24 timer.
Forsigtig: Paraformaldehyd er meget giftigt. Undgå kontakt med øjne, hud eller slimhinder. Minimer eksponering og undgå indånding under forberedelse. Bær egnede personlige værnemidler. - Kassér fiksativ og skyl cellepellets med deioniseret vand (DW).
- Placer et lag af gaze på kassetten og overføre de faste pellets under anvendelse af en pipette. Dæk pelleten ved at folde gaze og luk kassettedækslet.
- Dehydrere pillerne.
- Fordybe pellets i 70% ethanol (EtOH) i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fordybe pellets i 80% EtOH i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fordybe pellets i 95% EtOH i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fordyb pillerne i 100% EtOH i 5 minutter ved stuetemperatur. Gentag to gange.
- Fordyb pillerne i 100% xylen i 15 min ved stuetemperatur. Gentag twice.
- Indlejre de faste cellepellets i paraffin ved 56 ° C i en form; pillerne kan blive indlejret i paraffin hjælp af specialiserede automatiske væv systemer.
- Skær 5 um-tykke snit fra paraffinindlejret cellepellet ved hjælp af en roterende mikrotom.
- Float afsnittene i 50% EtOH og derefter overføre dem til en 50 ° C vandbad ved hjælp af et dias.
- Placer de flydende sektioner på dias.
- Safranin O og Alcian Blue farvning
- Rehydrere paraffinsnit.
- Fordyb dias i xylen i 15 min. Gentag to gange.
- Fordyb dias i 100% EtOH i 5 min. Gentag to gange.
- Fordyb dias i 90% EtOH i 5 min.
- Fordyb dias i 80% EtOH i 5 min.
- Fordyb dias i 70% EtOH i 5 min, og derefter vaske dem i 1x PBS.
- Farv de rehydrerede sektioner med 1% Safranin O-opløsning og 3% Alcian blå for30 min.
- Kassér farvning løsning og skyl afsnittene med DW.
- Farv afsnittene med hematoxylin / eosin opløsning (kontrastfarve) i 1 min.
- Kassér farvning løsning og skyl afsnittene med DW.
- Placer en dråbe montering medium på et dækglas efter fjernelse eventuelt resterende vand. Placer forsigtigt slide (celle nedad) på dækglasset indeholder montering medium.
- Tillad objektglassene tørre i 2-3 timer ved stuetemperatur.
- Tag billeder ved hjælp af en lys-felt mikroskop (automatiseret opretstående mikroskop, 50X og 200X).
- Rehydrere paraffinsnit.
- immunofluorescensassay
- Rehydrere afsnittene som beskrevet i afsnit 3.2.1.
- Fordybe objektglassene i natriumcitratbuffer (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0), og derefter fastholde dem på en sub-kogetemperatur i 10 minutter under anvendelse af en mikrobølgeovn.
- Afkøle objektglassene i 20 minutter ved stuetemperatur og derefter vaske dem med vand fra hanen.
- Glassene inkuberes tildækket i 3%H 2 O 2 (i 1x PBS) i 15 minutter, og derefter vaske dem med ledningsvand i 15 minutter 11.
- Blokere objektglassene med blokerende buffer (10% normalt gedeserum i PBS) i 1 time.
- Aspirer blokeringsopløsningen, og derefter anvende et primært antistof fortyndet med 5% normalt gedeserum på objektglassene.
- Glassene inkuberes tildækket natten over ved 4 ° C.
- Vask præparatglassene tre gange i 1 x PBS i 5 minutter hver.
- Glassene inkuberes tildækket i fluorochrom-konjugeret sekundært antistof fortyndet med 5% normalt gedeserum i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
- Vask præparatglassene tre gange i 1 x PBS i 5 minutter hver i mørke.
- Glassene inkuberes tildækket med DAPI (1 ug / ml) i 10 minutter, og derefter vaske dem to gange i 1 x PBS i 5 minutter hver.
- Placer en dråbe montering medium på et dækglas efter fjernelse eventuelt resterende vand. Placer forsigtigt slide (celle nedad) på montering medium.
- Lad objektglassene tørre i 2-3h i mørke ved stuetemperatur.
- Visualiser dias ved hjælp af fluorescens mikroskopi (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm, 60X og 200X forstørrelse) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Centrifugal tyngdekraften inducerer overekspression af chondrogene differentieringsmarkører i adipøst afledte stamceller.
For at bestemme graden af centrifugalkraften tyngdekraften kraft, der er egnet til at inducere chondrogen differentiering, blev ASC'er stimuleret med forskellige grader af CG (0, 300, 600, 1.200 og 2.400 xg) i 15 min. Efter stimulering blev ASC'er re-podet på dyrkningsplader og dyrket i 24 timer. Som vist i figur 1A, blev Sox9 mRNA-ekspression betydeligt ved 2.400 xg; det var ca. 1,5 gange højere ved 2.400 xg end i kontrolgruppen (ASC'er ikke indlæst med CG). For at bekræfte, om CG inducerer chondrogen differentiering, vi stimulerede ASC'er af CG lastning eller af TGF-β1 behandling. Som en negativ kontrol, ASC'er blev dyrket uden nogen stimulering. Prøver blev høstet på dag 14 og QRT-PCR blev udført. Som vist i Figur 1, COL2A1 mRNA, en repræsentant chondrogen differentiering markør, blev opreguleret i ASC stimuleret af CG i forhold til at styre celler (de stimulerede ASC). Opreguleringen niveau af COL2A1 mRNA ved CG stimulering svarede til den induceret af TGF-β1 behandling. På den anden side, COL10, en markør for hypertrofe chondrocytter, blev nedreguleret af CG-stimulering. AKAN mRNA, der koder for en væsentlig strukturel komponent af ledbrusk, blev opreguleret ca. 2 gange af CG-stimulering, hvorimod Col1 ikke var påviseligt forhøjet i forhold til kontroller. Hverken AKAN eller col1 blev opreguleret i ASC behandlet med TGF-β1.
Centrifugal tyngdekraften inducerer ekspressionen af et chondrogenese-relateret ekstracellulære matrix i pelletkultur af adipøst afledte stamceller.
Depositumion af ECM, såsom glycosaminoglycan, er kendetegnende fænotype af chondrogen differentiering. For at detektere dette materiale farvede vi pellet-dyrkede ASC'er med Safranin O og Alcian Blue på dag 21. Som vist i figur 2A, ASC'er stimuleret med CG deponeret mere glycosaminoglycan (rød for Safranin O og blå for Alcian blå) end kontroller, ved en niveau svarende til det, der deponeres af ASC'er behandlet med TGF-β1. I disse eksperimenter positiv farvning indikerede dannelsen af et brusk-matrix. For yderligere bekræftelse, overvåget vi udtryk for COL2A1 protein ved hjælp af PE-konjugeret anti-COL2A1 antistof. COL2A1 blev overudtrykt i ASC'er stimuleret med CG til en lidt højere grad end i ASC'er behandlet med TGF-β1 (figur 2B).
Chondrogen aggregatdannelse induceres ved centrifugal tyngdekraft i en mikromassekultur af adipøst afledte stamceller.
13. Derfor har vi sammenlignet kondens i mikromasse mellem kulturer af kontrol ASC'er og ASC'er stimuleret med CG eller TGF-β1. Som vist i figur 3, blev påvist større og tættere aggregeringer af ASC'er (hvide-farvet i den stiplede firkant) i mikromassekulturer fremstillet af ASC'er stimuleret med CG eller TGF-β1 end i kontrolkulturer.
Sox9 opreguleres ved centrifugal tyngdekraft i adipøst afledte stamceller.
Sox9 er en mester regulator af chondrogen differentiering 14, 15. For at bestemme, om CG inducerer opregulering af Sox9 i ASC, overvåget vi udtryk for Sox9 mRNA i ASC udsat for forskellige varigheder af CG stimulation (2400 x g). Sox9 udtryk blev undersøgt ved forskellige grader af CG, men det gjorde ikke adskiller sig væsentligt blandt CG betingelser med kræfter større end 2400 × g (data ikke vist). Ekspression af Sox9 mRNA begyndte at stige efter 15 min af CG-stimulering, og det blev mættet efter 30 minutter (figur 4A). Dernæst at bestemme hvor længe CG-induceret Sox9 overekspression kan opretholdes, vi høstede CG-stimuleret ASC'er ved de angivne tidspunkter og overvåges ekspressionen af Sox9. Som vist i figur 4B, ekspressionen af Sox9 protein steg indtil 3 timer efter CG stimulering og forblev på dette niveau i mindst 12 timer.
Figur 1. Centrifugal tyngdekraften inducerer opregulering af chondrogene differentieringsmarkører i adipøst afledte stamceller. A) For at bestemme somuitable centrifugal tyngdekraft, blev ASC'er centrifugeret ved forskellige CG (0, 300, 600, 1.200 og 2.400 xg) i 15 min. Sox9 mRNA-ekspression blev vurderet ved 24 timer efter CG-stimulering. B) At evaluere ekspressionen af chondrogenese-relaterede gener, blev totalt RNA ekstraheret fra ASC'er, der var blevet centrifugeret, behandlet med TGF-β1 (10 ng / ml), eller ustimulerede (kontroller). RNA'et blev underkastet revers transkription til at syntetisere cDNA, som derefter blev amplificeret ved RT-PCR. Alle forsøg blev udført mindst tre gange. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse. ** P <0,01 for ASC'er stimuleret med CG vs. kontrol (ikke-stimulerede ASC'er).
Figur 2. Centrifugal tyngdekraften inducerer en chondrogenese-relateret ekstracellulær matrix i pellets kulturer af adipøst afledte stamceller. A) proteoglycanmatrix formation af CG belastning. B) CG-induceret overekspression af collagen type 2. For CG loading blev ASC'er centrifugeret ved 2.400 x g i 15 minutter. Overekspressionen af chondrogenese-relaterede ECM blev evalueret i kugleformede pellets bestående af centrifugerede ASC'er gennem anvendelse af Safranin O og Alcian Blue farvning. Overekspression af collagen type 2 blev bekræftet ved immunofluorescens ved anvendelse af et antistof mod collagen type 2 og en Alexa Fluor 594-konjugeret sekundært antistof (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm). For at bestemme virkningen af CG på chondrogenese-relateret ECM overekspression blev ASC'er behandlet med TGF-β1 (10 ng / ml) som en positiv kontrol. Den negative kontrol var en pellet kultur ikke underkastet CG lastning eller TGF-β1 behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
Figur 3. chondrogensupplering aggregatdannelse induceres ved centrifugal tyngdekraft i mikromassekulturer af adipøst afledte stamceller. For at inducere chondrogen differentiering, blev ASC'er (2,5 x 10 5) stimuleres ved centrifugering ved 2.400 x g eller ved behandling med TGF-β1 (10 ng / ml). Ustimulerede ASC'er blev anvendt som kontroller. Til dannelse mikromasser blev celler (2,5 x 10 5/10 pi) anbragt i centrum af brønde i en plade med 24 brønde. Efter 2 timers inkubation frisk medium-CDM for kontrol og centrifugeret ASC'er og CDM indeholdende TGF-β1 (10 ng / ml) i ASC'er behandlet med TGF-β1-blev tilsat til brøndene, og prøverne blev inkuberet i 14 dage. Chondrocyt kondensation blev bedømt ved størrelsen af aggregaterne.
Figur 4. Sox9 er upregulated ved centrifugal tyngdekraft i adipøst afledte stamceller. A) opregulering af Sox9 mRNA ved CG stimulation til forskellige tidsintervaller. B) Sox9 proteinekspression i CG-stimulerede ASC'er på forskellige tidspunkter. ASC'er fik lov til at vokse som et monolag i 24 timer efter CG loading. mRNA-opregulering og proteinet ekspression af Sox9 blev bekræftet ved RT-PCR og Western blotting hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den stemness tilstand af celler er meget vigtigt for CG-induceret overekspression af Sox9. I vores undersøgelse kunne Sox9 ekspression induceres af CG i tidlig passage ASC'er (2-3), men ikke i senere passage ASC'er. Det er blevet rapporteret, at under dyrkning, ASC'er indeholder CD34 + celler indtil 3 passager 16. ASC'er tendens til at miste ekspressionen af CD34 som cellerne passeres, hvilket resulterer i en lav reaktion på CG.
Med centrifugal tyngdekraft, kan hydrostatisk tryk indlæses på celler under CG stimulering. Derfor kan mængden af mediet være en af de faktorer, der påvirker induktion af Sox9. For at opretholde en jævn hydrostatisk tryk miljø for hvert eksperiment blev 1 ml medium anvendes pr 1 × 10 5-celler i en 15-ml rør. Desuden blev en swing-bucket rotor anvendes til jævnt anvende CG til cellerne (ved at danne en ret vinkel).
Sammenlignet med TGF-β1, viste CG en lavere kapacitet til atfremkalde Sox9 og chondrogen markør udtryk i ASC'er. Dette kan være en begrænsning af denne teknik. For en klinisk anvendelse, bør det yderligere undersøgt, om CG-stimuleret ASC'er regenerere svækket brusk op til det normale funktion i en in vivo-model.
In vitro-dyrkning med vækstfaktorer, især TGF-β1, er den mest effektive metode til at inducere chondrogen differentiering af stamceller 17. Denne fremgangsmåde er kendt for at være anvendelige til celle berigelse og chondrogen differentiering induktion. Men tidlig ældning og uventede afstamning differentiering forekommer ofte under in vitro-dyrkning 18, 19. Mere alvorlig er den høje risiko for forurening fra in vitro kulturer. På den anden side indeholder vores metode ikke kræver in vitro chondrogen differentiering med vækstfaktorer. Stamceller kan transplanteres ind i en patient straks efter isolering og efter centrifugering, som kan garantere en lav risiko for forurening og en forkortet behandlingstid. Mikromiljøet omkring stamceller er kritisk for chondrogen differentiering induktion. Uventet afstamning differentiering kan skyldes en forkert in vitro miljø. Som nævnt i vores fremgangsmåde, fordi centrifugerede stamceller kan transplanteres ind i brusk af en patient (korrekt miljø for chondrogen differentiering) uden en yderligere differentiering proces, kan uventede afstamning differentiering reduceres.
Her præsenterer vi en protokol, der bruger CG at inducere chondrogene differentiering af ASC'er. Vores resultater viser, at CG inducerer Sox9 opregulering og chondrogene differentieringsfaktorer fænotyper i ASC'er, herunder COL2A1 overekspression, mere omfattende ECM deposition, og chondrogen aggregatdannelse. Baseret på vores resultater, de ASC'er udsat for CG er en god erstatning for the MSC'er behandlet med TGF-β1 og kan derfor anvendes i transplantationer til bruskregenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
- Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
- Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
- Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
- Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
- Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
- Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
- Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
- Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
- Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
- Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).
