Introduction
Defecten in gewrichtskraakbeen niet genezen natuurlijk. Bijgevolg stamcel is voorgesteld als een veelbelovende benadering voor het herstel van aangetast kraakbeen. Deze werkwijze vereist zowel het verkrijgen van een voldoende aantal stamcellen en de inductie van deze cellen chondrogene differentiatie ondergaan. Beenmerg (BM) is op grote schaal gebruikt als bron van stamcellen, maar celisolatie van BM heeft twee belangrijke nadelen: invasiviteit en onvoldoende opbrengst. Vanwege het gemak van verwerving, vetweefsel is een voorkeur bron van stamcellen. Eerdere studies toonden de haalbaarheid van het isoleren van stamcellen uit vetweefsel en het induceren van chondrogene differentiatie van deze cellen met behulp cytokines zoals TGF-β1 1, 2. Deze werkwijzen zijn effectief maar duur.
Als goedkopere alternatief voor cytokinen, kunnen mechanische belasting worden gebruiktchondrogene differentiatie induceren. Mechanische belasting speelt een cruciale rol bij het handhaven van de gezondheid van gewrichtskraakbeen 3, en kan chondrogene fenotypes in verschillende cellen. Bijvoorbeeld, hydrostatische druk veroorzaakt chondrogene fenotypen in synovium afgeleide progenitorcellen via de MAP kinase / JNK pathway 4 en mechanische compressie veroorzaakt chondrogenese van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) van genen opwaarts reguleren chondrocytische 5. Bovendien afschuifspanning bij tot de expressie van chondrogenese gerelateerde extracellulaire matrix (ECM) in humane MSC's 6. Centrifugale zwaartepunt (CG), een gemakkelijk worden gecontroleerd spanning gegenereerd door centrifugeren, kan differentiële genexpressie in cellen 7 induceren. Bijvoorbeeld, in longepitheelcellen carcinoomcellen, de expressie van interleukine (IL) -1 ter opgereguleerd door centrifugeren 8. Therefore, als experimenteel induceerbare spanning, CG kan worden gebruikt om chondrocyte genexpressie te induceren in stamcellen. Het blijft echter onduidelijk of CG het chondrogene differentiatie van stamcellen kunnen induceren.
In deze studie hebben we vastgesteld dat CG induceerde de opregulatie van SOX9, regulering van de chondrogenese in menselijk ASCs, wat resulteert in de overexpressie van chondrocyte genen. Verder vergeleken we de effecten van CG op chondrogenese met die van TGF-β1, de groeifactor meest gebruikte in vitro chondrogenese te induceren in stamcellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC16EAME0162) en uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen. Alle weefsels werden verkregen met schriftelijke informed consent.
1. Centrifugaal Zwaartekracht laden en Pellet Cultuur
- Celcultuur en oogst
- Cultuur ASC (P2-P3, zie Lijst van Materials) in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium-laag glucose (DMEM-LG) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S) bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Wanneer de cellen 80% confluentie bereikt, gooi het medium en spoelen van de cellen met 5 ml 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg 1 ml PBS met 1 mM EDTA en incubeer gedurende 2 minuten bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Tik op de cultuur plaat zachtjes, voeg 4 ml vers medium, de overdracht van de celleneen 15-ml conische buis en gecentrifugeerd cellen bij 250 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Centrifugale zwaartekracht loading
- Na centrifugeren (stap 1.1.4), de bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet in 10 ml DMEM-LG met 10% FBS. Tel de cellen met een hemocytometer.
- CG laden, overdragen 2,5 x 10 5 cellen in nieuw 15-ml conische buis en centrifugeer bij 2400 xg gedurende 15 min.
- pellet cultuur
- Onmiddellijk na centrifugatie, zuig de supernatant en voeg 500 ul van gedefinieerde chondrogene differentiatie medium (CDM, hoog-glucose DMEM aangevuld met 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM dexamethason, 1x MEM niet-essentiële aminozuren oplossing 50 ug / mL L-proline, en 1% penicilline / streptomycine). Voeg 50 ug / ml vers bereide L-ascorbinezuur 2-fosfaat bij elke mediumverversing. Als positieve controle induceren chondrogene differentiatide in uncentrifuged cellen door toevoeging CDM bevattende 10 ng / mL TGF-β1.
- Plaats de losjes afgedekte buizen met de pellets in een staande positie en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Verander het medium elke andere dag gedurende 3 weken.
- micromassakweek
- Direct na centrifugeren (stap 1.2.2; 2400 xg gedurende 15 min), zuig de supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ul CDM.
- Een Micromass vormen, plaatst de geresuspendeerde cellen in het midden van een putje van een 24-wells plaat.
- Na 2 uur, 1 ml CDM Voeg aan de bron, pipetteren tegen de wand van de plaat niet te verstoren de micromassa. Als een positieve controle, voeren een micromassakweek met uncentrifuged cellen door toevoeging CDM bevattende 10 ng / mL TGF-β1.
- Incubeer de micromassa bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2.
- Verander het medium every andere dag gedurende 3 weken.
2. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) te detecteren transcriptionele opregulatie van chondrogene differentiatie Markers
- Op dag 14 Gebruik een pipet om de bolvormige pellets naar een nieuwe 1,5 ml buis en wassen in 1 x PBS.
- Extraheer het totale RNA van de pellets met de guanidinium thiocyanaat-fenol- chloroform extractie methode 9.
- Synthetiseren cDNA van 2 ug totaal RNA met behulp van reverse transcriptase volgens het protocol van de fabrikant (incuberen bij 42 ° C gedurende 1 uur en vervolgens inactiveren van het enzym bij 70 ° C gedurende 5 min).
- Voer PCR met primers specifiek voor chondrogene differentiatie merkers 10.
3. Kleuring de overexpressie van chondrogene differentiatie merkereiwitten Detect
- Paraffine inbedding celpellets
- Op dag 21,Gebruik een pipet om de bolvormige pellets te oogsten en was ze met 1x PBS.
- Bevestig de bolvormige pellets door onderdompeling in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur.
Let op: Paraformaldehyde is zeer giftig. contact met de ogen, huid of slijmvliezen te voorkomen. Minimaliseer blootstelling aan en inademen te voorkomen tijdens de bereiding. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. - Gooi de fixatief en spoel de celpellets met gedemineraliseerd water (DW).
- Plaats een laag van gaas op de cassette en breng de vaste pellets met een pipet. Bedek de pellet door het vouwen van het gaas en sluit de cassette deksel.
- Dehydrateer de pellets.
- Dompel de pellets in 70% ethanol (EtOH) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Dompel de pellets in 80% EtOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Dompel de pellets in 95% EtOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Dompel de pellets in 100% EtOH gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit twee keer.
- Dompel de pellets 100% xyleen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal twice.
- Insluiten vaste celpellets in paraffine bij 56 ° C in een matrijs; de pellets kan worden ingebed in paraffine middels geautomatiseerde gespecialiseerde weefsel verwerkingssystemen.
- Cut 5 urn dikke secties van de paraffine ingebedde celpellet toepassing van een roterende microtoom.
- Float de secties in 50% EtOH en vervolgens overbrengen naar een 50 ° C waterbad met behulp van een glijbaan.
- Plaats de zwevende gedeelten op objectglaasjes.
- Safranine O en alcianblauwkleuring
- Hydrateren de paraffine secties.
- Dompel de objectglaasjes in xyleen gedurende 15 min. Herhaal dit twee keer.
- Dompel de objectglaasjes in 100% EtOH gedurende 5 min. Herhaal dit twee keer.
- Dompel de glaasjes in 90% EtOH gedurende 5 min.
- Dompel de glaasjes in 80% EtOH gedurende 5 min.
- Dompel de dia's in 70% EtOH gedurende 5 minuten, en daarna was ze in 1x PBS.
- Vlekken op de gerehydrateerd secties met 1% Safranin O-oplossing en 3% Alcian blauw voor30 minuten.
- Gooi de kleuroplossing en spoel de secties met DW.
- Vlekken op de secties met hematoxyline / eosine-oplossing (tegenkleuring) gedurende 1 min.
- Gooi de kleuroplossing en spoel de secties met DW.
- Breng een druppel montage medium op een dekglaasje na het verwijderen van het resterende water. Plaats de dia (cell-kant naar beneden) op het dekglaasje met de montage medium zorgvuldig.
- Laat de dia's drogen 2-3 uur bij kamertemperatuur.
- beelden vast te leggen met behulp van een bright-field microscoop (geautomatiseerde rechtopstaande microscoop, 50X en 200X).
- Hydrateren de paraffine secties.
- immunofluorescentietest
- Hydrateren de secties zoals beschreven in paragraaf 3.2.1.
- Dompel de objectglaasjes in natriumcitraat buffer (10 mM natriumcitraat, 0,05% Tween 20, pH 6,0), en vervolgens te handhaven op een sub kooktemperatuur gedurende 10 minuten in de magnetron.
- Koel de dia's voor 20 minuten bij kamertemperatuur en daarna was ze met kraanwater.
- Incubeer de glaasjes in 3%H 2 O 2 (in 1x PBS) gedurende 15 min, en vervolgens wassen met kraanwater gedurende 15 min 11.
- Blokkeer de dia's met blokkerende buffer (10% normaal geit serum in PBS) gedurende 1 uur.
- Zuig het blokkeren oplossing, en breng daarna een primair antilichaam verdund met 5% normaal geit serum op de dia's.
- Incubeer de glaasjes nacht bij 4 ° C.
- Was de glaasjes drie keer in 1x PBS gedurende 5 minuten elk.
- Incubeer de glaasjes in fluorochroom-geconjugeerd secundair antilichaam verdund met 5% normaal geit serum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de glaasjes drie keer in 1x PBS gedurende 5 min elk in het donker.
- Incubeer de glaasjes met DAPI (1 ug / ml) gedurende 10 min, en vervolgens twee keer wassen in 1 x PBS gedurende 5 minuten elk.
- Breng een druppel montage medium op een dekglaasje na het verwijderen van het resterende water. Plaats de dia (cell-kant naar beneden) op de montage medium zorgvuldig.
- Laat de dia's drogen 2-3h in het donker bij kamertemperatuur.
- Visualiseer de dia's met behulp van fluorescentie microscopie (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X en 200X vergroting) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Centrifugale zwaartekracht induceert de overexpressie van chondrogene differentiatie merkers in adipeus afgeleide stamcellen.
Om de mate van centrifugale zwaartekracht die geschikt is voor chondrogene differentiatie te induceren, werden ASC gestimuleerd met verschillende graden van CG (0, 300, 600, 1200 en 2400 x g) gedurende 15 min. Na stimulatie, het ASC werden opnieuw gezaaid in kweekplaten en gekweekt gedurende 24 uur. Zoals getoond in Figuur 1A werd SOX9 mRNA expressie significant verhoogd bij 2400 xg; was ongeveer 1,5-voudig hoger bij 2400 xg dan in de controlegroep (ASC niet geladen met CG). Om te bevestigen of CG induceert chondrogene differentiatie, we gestimuleerd ASC door CG laden of door TGF-β1 behandeling. Als negatieve controle, ASC gekweekt zonder stimulatie. Monsters werden geoogst op dag 14 en qRT-PCR werd uitgevoerd. Zoals getoond in FIGUUR 1, COL2A1 mRNA, een vertegenwoordiger chondrogene differentiatie marker, werd opgereguleerd in ASC gestimuleerd door CG ten opzichte van cellen (de gestimuleerde ASC) te controleren. De opwaartse regulatie niveau van mRNA door COL2A1 CG stimulatie was vergelijkbaar met die geïnduceerd door TGF-β1 behandeling. Anderzijds, COL10, een marker van hypertrofe chondrocyten, werd downgereguleerd door CG stimulatie. ACAN mRNA, dat een belangrijk structureel onderdeel van articulair kraakbeen codeert, werd opgereguleerd ongeveer 2-voudig door CG stimulatie, terwijl COL1 was niet detecteerbaar verhoogd ten opzichte van controles. Noch ACAN noch KOL1 werden opgereguleerd in ASCs behandeld met TGF-β1.
Centrifugale zwaartekracht induceert de expressie van een chondrogenese-gerelateerde extracellulaire matrix in korrelkweek van adipeus afgeleide stamcellen.
stortingion van ECM, zoals glycosaminoglycaan, is een kenmerk fenotype van chondrogene differentiatie. Dit materiaal is geconstateerd, gekleurd pellet gekweekt ASC met Safranin O en Alcian blauw op dag 21. Zoals getoond in figuur 2A, ASC gestimuleerd met CG afgezet meer glycosaminoglycan (rood voor Safranine O en blauw voor Alcian blauw) dan controles, op een niveau vergelijkbaar met die afgezet door ASC behandeld met TGF-β1. In deze experimenten positieve kleuring gaf de vorming van een kraakbeenmatrix. Voor nadere bevestiging, gevolgd we de expressie van COL2A1 eiwit met behulp van de PE-geconjugeerd anti-COL2A1 antilichaam. COL2A1 werd overexpressie in ASCs gestimuleerd met CG in iets meer dan in ASCs behandeld met TGF-β1 (figuur 2B).
Chondrogene aggregaatvorming wordt geïnduceerd door centrifugale zwaartekracht in micromassakweek van adipeus afgeleide stamcellen.
13. Daarom vergeleken we condensatie in de micromassaculturen tussen culturen controle ASC en ASC's gestimuleerd met CG of TGF-β1. Zoals getoond in figuur 3, zijn grotere en dichtere combinaties van ASC (witgekleurde in het gestippelde vierkant) waargenomen in micromassakweken van ASC gestimuleerd met CG of TGF-β1 dan in controlekweken.
SOX9 wordt opgereguleerd door centrifugale zwaartekracht in-vet-afgeleide stamcellen.
SOX9 is een meester regulator van chondrogene differentiatie 14, 15. Om te bepalen of CG induceert de opregulatie van SOX9 in ASC, gecontroleerd we de expressie van SOX9 mRNA in ASC blootgesteld aan verschillende duur van CG stimulatie (2400 × g). SOX9 expressie werd onderzocht in verschillende gradaties van CG, maar verschilde niet significant tussen de CG omstandigheden met krachten van meer dan 2.400 × g (gegevens niet getoond). Expressie van mRNA SOX9 gedaan werd na 15 min stimulatie CG en werd verzadigd na 30 minuten (figuur 4A). Vervolgens te bepalen hoe lang CG-geïnduceerde SOX9 overexpressie kan worden gehandhaafd, we geoogst CG-gestimuleerde ASC's op de aangegeven tijdstippen en bewaakt de expressie van SOX9. Zoals getoond in figuur 4B, de expressie van SOX9 eiwit verhoogd tot 3 uur na stimulatie CG en bleef op dit niveau gedurende ten minste 12 uur.
Figuur 1. Centrifugaal zwaartekracht induceert de opregulatie van chondrogene differentiatie merkers in adipeus afgeleide stamcellen. A) te bepalen alsuitable centrifugale zwaartekracht, ASC werden gecentrifugeerd bij verschillende CG (0, 300, 600, 1200, en 2400 x g) gedurende 15 min. SOX9 mRNA expressie werd geëvalueerd 24 uur na stimulatie CG. B) Om de expressie van chondrogenese gerelateerde genen te evalueren, werd totaal RNA geëxtraheerd uit ASC die gecentrifugeerd was, behandeld met TGF-β1 (10 ng / ml), of niet gestimuleerd (controle). Het RNA werd onderworpen aan omgekeerde transcriptie tot cDNA te synthetiseren, dat vervolgens werd geamplificeerd door RT-PCR. Alle experimenten werden ten minste driemaal uitgevoerd. Fout balken geven standaarddeviatie. ** P <0,01 voor ASC gestimuleerd met CG versus de controle (niet-gestimuleerde ASC).
Figuur 2. Centrifugaal zwaartekracht veroorzaakt een chondrogenese-gerelateerde extracellulaire matrix pellet kweken van adipeus afgeleide stamcellen. A) proteoglycan matrixvormion door CG laden. B) CG-geïnduceerde overexpressie van collageen type 2. CG laden werden ASC gecentrifugeerd bij 2400 xg gedurende 15 min. De overexpressie van chondrogenese gerelateerde ECM werd geëvalueerd in bolvormige korrels bestaande uit gecentrifugeerde ASC door het gebruik van Safranine O en Alcian blauw kleuring. Overexpressie van collageen type 2 werd bevestigd met immunofluorescentie onder toepassing van een antilichaam tegen collageen type 2 en een Alexa Fluor 594-geconjugeerd secundair antilichaam (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm). Om het effect van CG op chondrogenese gerelateerde ECM overexpressie te bepalen werden ASC behandeld met TGF-β1 (10 ng / ml) als positieve controle. De negatieve controle was een pellet cultuur niet onderworpen aan CG laden of TGF-β1 behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
![figuur 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
Figuur 3. Chondrogenische aggregaatvorming wordt geïnduceerd door centrifugale zwaartekracht in micromassakweken van adipeus afgeleide stamcellen. Om chondrogene differentiatie induceren ASC (2,5 x 10 5) werden gestimuleerd door centrifugatie bij 2400 xg of door behandeling met TGF-β1 (10 ng / ml). Ongestimuleerde ASC's werden gebruikt als controles. Micromassa te vormen, werden cellen (2,5 x 10 5/10 ui) in het middelpunt van putten in een 24-wells plaat. Na 2 uur incubatie, vers medium-CDM in controles en gecentrifugeerd ASCs en CDM met TGF-β1 (10 ng / ml) ASC behandeld met TGF-β1-werd aan de putjes toegevoegd en de monsters werden gedurende 14 dagen. Chondrocyte condensatie werd geëvalueerd door de grootte van de aggregaten.
Figuur 4. SOX9 is upregulated door centrifugale zwaartekracht in-vet-afgeleide stamcellen. A) opregulatie van SOX9 mRNA door CG stimulatie voor verschillende tijdsintervallen. B) SOX9 eiwitexpressie in CG-gestimuleerde ASC op verschillende tijdstippen. ASC mochten groeien als een monolaag gedurende 24 uur na het laden CG. mRNA opregulatie en de eiwitexpressie van SOX9 werden bevestigd door RT-PCR en Western blotting, respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stemness de toestand van cellen is zeer belangrijk voor CG-geïnduceerde overexpressie van SOX9. In onze studie konden SOX9 expressie worden geïnduceerd door CG in vroege passage ASC's (2-3), maar niet in latere doorgang ASC. Het is gerapporteerd dat, tijdens de teelt, ASC bevatten CD34 + -cellen tot 3 passages 16. ASC neiging om de expressie van CD34 verliezen de cellen gepasseerd, waardoor een lage respons CG.
Met centrifugale zwaartekracht, kan hydrostatische druk op de cellen worden geladen tijdens CG stimulatie. Derhalve kan het volume van medium een van de factoren die de inductie van SOX9 beïnvloeden. Om een nog hydrostatische druk omgeving voor elk experiment te handhaven, werd 1 ml medium dat per 1 x 10 5 cellen in een 15 ml buis. Daarnaast werd een schommeling-bucket rotor gebruikt gelijkmatig CG toepassing op de cellen (door vorming van een rechte hoek).
Vergeleken met TGF-β1, CG toonde een lagere mogelijkheid ominduceren SOX9 en chondrogene marker expressie in ASC. Dit kan een beperking van deze techniek. Een klinische toepassing, moet verder worden onderzocht of CG-gestimuleerde ASC verminderde kraakbeen tot het normale functioneren in een in vivo model te regenereren.
In vitro kweek met groeifactoren, met name TGF-β1, is de meest effectieve methode om chondrogene differentiatie van stamcellen 17 induceren. Deze methode staat bekend nuttig voor celverrijking en chondrogene differentiatie inductie van. Echter, vroegtijdige veroudering en onverwachte lineage differentiatie vaak optreden tijdens in vitro kweek 18, 19. Ernstiger is het hoge risico van contaminatie door in vitro kweken. Anderzijds gaat onze methode vereisen in vitro chondrogene differentiatie groeifactoren. Stamcellen kunnen worden getransplanteerd in een patient onmiddellijk na isolatie en na centrifugeren, met een laag risico besmetting en een kortere doorlooptijd kunnen garanderen. De micro rond stamcellen essentieel is voor chondrogene differentiatie inductie. Onverwacht lineage differentiatie veroorzaakt door een onjuiste in vitro omgeving. Zoals in onze werkwijze, omdat gecentrifugeerd stamcellen in het kraakbeen van de patiënt (de juiste omgeving voor chondrogene differentiatie) kan worden getransplanteerd zonder extra differentiatieproces, kunnen onverwachte lineage differentiatie verminderd.
Hier presenteren we een protocol dat CG gebruikt om de chondrogene differentiatie van ASC induceren. Onze resultaten tonen aan dat CG induceert SOX9 opregulatie en chondrogene differentiatie fenotypes in ASC, met inbegrip van COL2A1 overexpressie, meer uitgebreide ECM-depositie en chondrogene aggregaat vorming. Op basis van onze resultaten de ASC blootgesteld aan CG een goede vervanging voor the MSCs behandeld met TGF-β1 en kunnen daarom worden gebruikt in transplantaties voor kraakbeenregeneratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
- Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
- Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
- Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
- Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
- Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
- Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
- Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
- Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
- Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
- Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).
