Introduction
関節軟骨の欠損は、自然治癒しません。したがって、幹細胞移植は、障害、軟骨の修復のための有望なアプローチとして提案されています。しかし、この方法は、幹細胞の十分な数の取得および軟骨形成分化を受けるため、これらの細胞の誘導の両方を必要とします。骨髄（BM）が広く、幹細胞の供給源として使用されているが、BMからの細胞の単離は、2つの主要な欠点があります侵襲性および不十分な収率。なぜなら取得が容易で、脂肪組織は、幹細胞の好ましい供給源です。以前の研究は、脂肪組織から幹細胞を単離し、例えば、TGF-β11、2のようなサイトカインを用いたこれらの細胞における軟骨形成分化を誘導することの実現可能性を実証しました。これらの方法は有効であるが、高価です。
サイトカインに対する低コストの代替手段として、機械的応力をするために使用することができます軟骨形成分化を誘導します。機械的荷重は、関節軟骨3の健康を維持する上で重要な役割を果たし、それが種々の細胞における軟骨形成の表現型を誘導することができます。例えば、静水圧は、MAPキナーゼ/ JNK経路4を介して滑膜由来前駆細胞における軟骨形成の表現型を誘導し、そして機械的圧縮は軟骨細胞の遺伝子5をアップレギュレートすることによって、ヒト間葉系幹細胞（MSC）で軟骨形成を誘導します。また、せん断応力は、ヒトMSC 6における軟骨形成に関連した細胞外マトリックス（ECM）の発現に寄与する。遠心重心（CG）、遠心分離によって生成さ容易に適用され、制御機械的応力は、セル7で異なる遺伝子発現を誘導することができます。例えば、肺上皮癌細胞において、インターロイキン（IL）-1bの発現を遠心分離8によってアップレギュレートされます。 Therefore、実験的に誘導機械的応力として、CGは、幹細胞における軟骨の遺伝子発現を誘導するために使用することができます。しかし、CGは、幹細胞の軟骨形成分化を誘導することができるかどうかは不明のままです。
本研究では、CGは軟骨細胞の遺伝子の過剰発現の結果、人間のASCで、SOX9、軟骨形成のマスターレギュレータのアップレギュレーションを誘導したことがわかりました。また、我々は、TGF-β1のものと軟骨のCGの効果は、成長因子は、最も一般的には、幹細胞にインビトロ軟骨形成を誘導するために使用される比較しました。
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Protocol
この研究プロトコルは、カトリック大学校（KC16EAME0162）の施設内倫理委員会によって承認され、NIHガイドラインに従って実施しました。すべての組織は、書面によるインフォームドコンセントが得られました。
1.遠心重力ロードとペレット文化
- 細胞培養および収穫
- 培養のASC（P2-P3、材料のリストを参照）を37℃で10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充したダルベッコ変法イーグル培地 - 低グルコース（DMEM-LG）に5％CO 2を含む加湿インキュベーターです。
- 細胞が80％コンフルエンスに達したとき、培地を廃棄し、1×リン酸緩衝生理食塩水5mLの（PBS）で細胞を洗浄します。
- 1mMのEDTAを含有するPBSを1ml加え、5％CO 2を含む加湿インキュベーター中、37℃で2分間インキュベートします。
- 静かに培養プレートをタップして、新鮮な培地の4 mLを加え、に細胞を移します15-mLコニカルチューブ、および室温（RT）で2分間、250×gで細胞を遠心します。
- 遠心重力荷重
- 遠心分離（ステップ1.1.4）の後、ペレットを乱すことなく、上清を除去し、10％FBSを含むDMEM-LGの10 mL中にペレットを再懸濁。血球計数器を用いて細胞を数えます。
- CGのロードについては、15分間、2400×gで新しい15 mLコニカルチューブと遠心分離機に2.5×10 5個の細胞を移します。
- ペレット培養
- 直ちに遠心分離後、上清を吸引し、定義された軟骨形成分化培地500μL（CDM、1％FBSを補充した高グルコースDMEM、1％ITS +プレミックス、100nMのデキサメタゾン、1×MEM非必須アミノ酸溶液を追加し、50μgの/ mLのL-プロリン、および1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。すべての培地交換で新たに調製したL-アスコルビン酸を50μg/ mLの2リン酸を追加します。ポジティブコントロールとして、軟骨形成differentiatiを誘導追加することにより、遠心分離していない細胞内にCDMは、10ng / mLのTGF-β1を含みます。
- 立った姿勢でペレットを含むゆるくキャップチューブを置き、5％CO 2を含む加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートします。
- 3週間一日おきに培地を変更します。
- マイクロマス培養
- 直ちに遠心分離（ステップ1.2.2; 15分間、2400×gで）後、上清を吸引し、CDMの10μLにペレットを再懸濁。
- マイクロマスを形成するために、24ウェルプレートのウェルの中央に再懸濁した細胞を配置します。
- 2時間後、慎重にマイクロマスの中断を避けるために、プレートの壁にも、ピペッティングにCDMの1 mLを加え。ポジティブコントロールとして、10ng / mLのTGF-β1を含むCDMを追加することにより、遠心分離していない細胞とマイクロマス培養を行います。
- 5％CO 2を含む加湿インキュベーター中で37℃でマイクロマス培養します。
- メディアEVを変更3週間先日ERY。
2.逆転写酵素 - ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）は、軟骨細胞分化マーカーの転写アップレギュレーションを検出します
- 14日目に、新しい1.5 mLチューブに回転楕円体ペレットを転送し、1×PBSでそれらを洗浄するためのピペットを使用しています。
- グアニジンチオシアネート-フェノール-クロロホルム抽出法9を使用して、ペレットから全RNAを抽出します。
- 製造業者のプロトコルに従って逆転写酵素を用いて全RNAの2μgのからcDNAを合成し（1時間、42℃でインキュベートし、次いで5分間70℃で酵素を不活性化します）。
- 軟骨形成分化マーカー10に特異的なプライマーを用いてPCRを行います。
3.染色は、軟骨形成分化マーカータンパク質の過剰発現を検出するために、
- パラフィン包埋細胞ペレット
- 21日目に、回転楕円体ペレットを収穫し、1×PBSでそれらを洗浄するためのピペットを使用しています。
- 24時間、4％パラホルムアルデヒド中に浸漬することによりスフェロイドペレットを修正しました。
注意：パラホルムアルデヒドは、非常に有毒です。眼、皮膚、または粘膜との接触を避けます。露出を最小限に抑え、準備中に吸入を避けます。適切な個人保護具を着用します。 - 固定液を捨て、脱イオン水（DW）で細胞ペレットをすすぎます。
- カセット上にガーゼの一つの層を配置し、ピペットを用いて固定されたペレットを転送します。ガーゼを折り曲げることによってペレットを覆い、カセットのふたを閉じます。
- ペレットを脱水。
- 室温で5分間、70％エタノール（EtOH）中でペレットを浸し。
- 室温で5分間、80％エタノールでペレットを浸し。
- RTで5分間、95％エタノールでペレットを浸します。
- 室温で5分間、100％エタノールでペレットを浸します。二回繰り返します。
- RTで15分間、100％キシレン中でペレットを浸します。繰り返しTWICE。
- 金型内で56℃のパラフィンで固定細胞ペレットを埋め込みます。ペレットは、特殊な自動化組織処理システムを使用してパラフィンに埋め込むことができます。
- ロータリーミクロトームを用いてパラフィン包埋細胞ペレットから厚さ5μmのセクションをカット。
- 50％EtOH中でセクションをフロートした後、スライドを使用して、50℃の水浴に転送します。
- スライド上にフローティングのセクションを配置します。
- サフラニンOおよびアルシアンブルー染色
- パラフィン切片を再水和します。
- 15分間キシレンにスライドを浸し。二回繰り返します。
- 5分間100％エタノールでスライドを浸し。二回繰り返します。
- 5分間90％エタノールでスライドを浸し。
- 5分間80％エタノールでスライドを浸し。
- 5分間70％エタノールでスライドを浸し、その後、1×PBSでそれらを洗ってください。
- 1％サフラニンO溶液および3％アルシアンブルーのための再水和のセクションを染色30分。
- 染色液を捨て、DWでセクションをすすぎます。
- 1分間ヘマトキシリン/エオシン溶液（対比）を持つセクションを染色。
- 染色液を捨て、DWでセクションをすすぎます。
- 任意の残留水を除去した後、カバーガラスの取り付け培地のドロップを置きます。慎重にマウンティング培地を含むカバーガラスのスライド（セルサイドダウン）を配置。
- スライドを室温で2〜3時間乾燥することができます。
- 明視野顕微鏡（自動正立顕微鏡、50Xおよび200X）を使用して画像をキャプチャします。
- パラフィン切片を再水和します。
- 免疫蛍光測定法
- セクション3.2.1で説明したようにセクションを再水和。
- クエン酸ナトリウム緩衝液（10mMクエン酸ナトリウム、0.05％のTween 20、pH6.0）でのスライドを浸漬し、その後、マイクロ波を用いて10分間、サブ沸騰温度でそれらを維持します。
- RTで20分間スライドを冷却した後、水道水で洗っ。
- 3％のスライドをインキュベート15分間（1×PBS中の）H 2 O 2、その後15分間11水道水で洗っ。
- 1時間、緩衝液（PBS中10％正常ヤギ血清）でブロッキングしてスライドを阻止します。
- ブロッキング溶液を吸引し、次いでスライド上に5％正常ヤギ血清で希釈した一次抗体を適用します。
- 4℃で一晩スライドをインキュベートします。
- 5分ごとに、1×PBS中でスライドを3回洗浄します。
- 暗所で室温で1時間、5％正常ヤギ血清で希釈した蛍光標識二次抗体中でスライドをインキュベートします。
- 暗所で5分間ずつ、1×PBS中でスライドを3回洗浄します。
- 10分間DAPI（1μg/ ml）でスライドをインキュベートし、その後5分間毎に1×PBSでそれらを2回洗浄します。
- 任意の残留水を除去した後、カバーガラスの取り付け培地のドロップを置きます。慎重に取り付け媒体上にスライド（セルサイドダウン）を配置。
- スライドは2-3のために乾燥することができます室温で暗所で時間。
- 12;蛍光顕微鏡（：594 nmで、DAPI 60Xおよび200X倍率340 nmのRhod）を使用してスライドを可視化します。
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Representative Results
遠心重力は、脂肪由来幹細胞における軟骨形成分化マーカーの過剰発現を誘導します。
軟骨形成分化を誘導するのに適している遠心重力の程度を決定するために、ASCを15分間CG（0、300、600、1,200及び2,400 XG）の異なる程度で刺激しました。刺激後、ASCを培養プレート上に再播種し、24時間培養しました。 図1Aに示すように、SOX9 mRNA発現は有意に2,400×gで増加しました。それは、（ASCにはCGでロードされていない）対照に比べて2,400×gで約1.5倍高かったです。 CGは軟骨細胞分化を誘導するか否かを確認するために、我々は、CGの負荷によって、またはTGF-β1処理によってのASCを刺激しました。陰性対照として、ASCを、任意の刺激なしで培養しました。サンプルは、14日目に採取し、定量RT-PCRを行いました。 Fに示すように1 igure、COL2A1 mRNAを、代表的な軟骨形成分化マーカーは、細胞（非刺激のASC）を制御するためのCG相対によって刺激されたASCにおいてアップレギュレートされました。 CG刺激によるCOL2A1 mRNAのアップレギュレーションレベルは、TGF-β1の処理によって誘導されたものと同様でした。一方、COL10、肥大軟骨細胞のマーカーは、CG刺激によってダウンレギュレートされました。 COL1は対照に検出可能に上昇した相対的ではなかったのに対し、関節軟骨の主要な構造成分をコードしACAN mRNAは、、CG刺激によって約2倍アップレギュレートされました。 ACANもCOL1どちらも、TGF-β1で処理されたASCにおいてアップレギュレートされました。
遠心重力は、脂肪由来幹細胞のペレット培養における軟骨形成に関連した細胞外マトリックスの発現を誘導します。
保証金このようなグリコサミノグリカンなどのECMのイオンは、軟骨細胞分化の特徴の表現型です。 図2（a）に示すように 、この物質を検出するために、我々はサフラニンOおよび21日目にアルシアンブルーでペレット培養のASCを染色し、CGで刺激したASCはで、コントロールよりもより多くのグリコサミノグリカン（サフラニンO用の赤とアルシアンブルー青）を堆積しましたTGF-β1で処理されたASCをすることによって堆積したものと同様のレベル。これらの実験において、陽性染色は、軟骨マトリックスの形成を示しました。さらなる確認のために、我々は、PE結合抗COL2A1抗体を用いCOL2A1タンパク質の発現をモニターしました。 COL2A1は、TGF-β1（ 図2B）で処理したASCよりも僅かに大きい程度にCGで刺激したASCに過剰発現させました。
軟骨凝集体形成は、脂肪由来幹細胞のマイクロマス培養で遠心重力によって誘導されます。
13のための前提条件です。したがって、我々はCGまたはTGF-β1で刺激制御のASCとのASCの文化の間のマイクロマスに結露を比較しました。 図3に示すように 、ASCを（白色点線の四角形内）の大きい方と密集計は、コントロール培養よりもCGまたはTGF-β1で刺激したASC製のマイクロマス培養で検出されました。
SOX9は、脂肪由来幹細胞において、遠心重力によってアップレギュレートされます。
Sox9をは軟骨形成分化14、15のマスターレギュレータです。 CGはASCをでのSox9のアップレギュレーションを誘導するか否かを決定するために、我々はCG stimulaの様々な持続時間に暴露されたASCにSOX9 mRNAの発現をモニターしましたション（グラム×2400）。 SOX9発現がCGの様々な程度で調べたが、それは2,400×gよりも大きい力でCG条件間で有意差はなかった（データは示さず）。 SOX9のmRNAの発現は、CG刺激の15分後に増加し始め、それが30分（ 図4A）の後に飽和させました。次に、CG誘発性のSox9過剰発現を維持することができる時間を決定するために、我々は、指示された時点でCG-刺激したASCを採取し、Sox9をの発現をモニターしました。 図4Bに示すように、Sox9をタンパク質の発現は、CGの刺激後3時間まで増加し、少なくとも12時間、そのレベルのままでした。
図1の 遠心重力は、脂肪由来幹細胞における軟骨形成分化マーカーのアップレギュレーションを誘導します。 A）のように決定するために、uitableの遠心重力、ASCを15分間異なるCG（0、300、600、1,200及び2,400×gで）遠心分離しました。 SOX9 mRNA発現は、CG刺激後24時間で評価しました。 B）軟骨形成に関連する遺伝子の発現を評価するために、全RNAをTGF-β1（10ng / mLの）、または非刺激（対照）で処理し、遠心分離していたのASCから抽出しました。次いで、RNAをRT-PCRにより増幅したcDNAを合成するために逆転写を行いました。全ての実験を少なくとも3回行いました。エラーバーは標準偏差を表します。 **はp <コントロール（非刺激のASC）対CGで刺激したASCのための0.01。
図2. 遠心重力は、脂肪由来幹細胞のペレット培養において軟骨形成に関連する細胞外マトリックスを誘導します。 A）プロテオグリカン行列形式CGローディングによりイオン。 CGのロードについてはコラーゲンタイプ2のB）CG誘発性過剰発現は、ASCを15分間2400×gで遠心分離しました。軟骨形成に関連ECMの過剰発現は、サフラニンOおよびアルシアンブルー染色を使用することによって遠心分離のASCからなるスフェロイド、ペレットにして評価しました。 （：594 nmのDAPI：340nmでRhod）コラーゲンタイプ2の過剰発現は、コラーゲン2型に対する抗体およびAlexaフルーア594結合二次抗体を用いて免疫蛍光法によって確認しました。軟骨形成に関連したECMの過剰発現に対するCGの効果を決定するために、ASCを、陽性対照としてのTGF-β1（10ng / ml）で処理しました。陰性対照は、CGのロードまたはTGF-β1の処理が施されていないペレット培養しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3 軟骨凝集体形成は、脂肪由来幹細胞のマイクロマス培養における遠心重力によって誘導されます。軟骨形成分化を誘導するために、ASCを（2.5×10 5）を 2,400×gで、またはTGF-β1（10ng / ml）で処理することにより、遠心分離によって刺激しました。非刺激のASCを対照として使用しました。 micromassesを形成するために、細胞（2.5×10 5/10μL）を24ウェルプレートのウェルの中央に置きました。コントロールのインキュベーションの2時間、新鮮な培地-CDM後のASCを遠心分離し、CDMを用いて処理したASCのためにTGF-β1（10ng / mLの）を含有するウェルに添加したTGF-β1を-し、そしてサンプルを14日間インキュベートしました。軟骨細胞の縮合は、凝集体の大きさを評価しました。
図4. SOX9はupregです脂肪由来幹細胞において、遠心重力によってulated。種々の時間間隔でCG刺激によってSOX9 mRNAのA）アップレギュレーション。異なる時点でCG-刺激したASCでB）のSox9タンパク質発現。 ASCをはCG負荷後24時間単層として増殖させました。 mRNAのアップレギュレーションとのSox9のタンパク質の発現は、それぞれ、RT-PCRおよびウェスタンブロッティングによって確認しました。
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Discussion
細胞の幹細胞性の状態は、SOX9のCG誘発性過剰発現のために非常に重要です。我々の研究では、SOX9の発現はなく、後述する通路のASCで、初期継代のASC（2-3）でCGによって誘発される可能性があります。培養中、ASCを3継代16までCD34 +細胞を含む、ことが報告されています。 ASCは、細胞がCGに低応答特性が得られ、継代されているとして、CD34の発現を失う傾向があります。
遠心重力と、静水圧は、CGの刺激の間に細胞にロードすることができます。従って、媒体の体積は、SOX9の誘導に影響を与える要因の一つであってもよいです。各実験についても静水圧環境を維持するために、培地の1 mLを15 mLチューブ中の1×10 5個の細胞ごとに使用しました。また、スイングバケットローターを均等に（直角を形成することによって）セルCGを適用するために使用しました。
TGF-β1と比較すると、CGがに低い能力を示しましたSOX9とのASCでの軟骨形成マーカーの発現を誘導します。これは、この技術の限界かもしれません。臨床応用のためには、さらにCG-刺激したASCかどうかを検討すべきであるin vivoモデルでの正常な機能のレベルまで損なわれた軟骨を再生します。
増殖因子、特にTGF-β1とのインビトロ培養において 、幹細胞17の軟骨形成分化を誘導するための最も効果的な方法です。この方法は、細胞濃縮および軟骨形成分化を誘導するのに有用であることが知られています。しかし、早期老化や予期せぬ系列分化は、多くの場合、in vitro培養18、19の間に発生します。より深刻なインビトロ培養におけるからの汚染の危険性が高いです。一方、我々の方法は、増殖因子を用いたin vitro軟骨形成分化には必要ありません。幹細胞は、PAに移植することができますtientすぐに分離し、低汚染リスクおよび短縮処理時間を保証することができる遠心分離後、後。幹細胞の周囲の微小環境は、軟骨形成分化誘導のために重要です。予期しない系列分化は、 インビトロ環境で不適切に起因する可能性があります。遠心分離した幹細胞は、追加の分化過程なしに患者（軟骨細胞分化のための適切な環境）の軟骨に移植することができるので、我々の方法で述べたように、予想外の系統の分化を減少させることができます。
ここでは、ASCをの軟骨形成分化を誘導するためにCGを使用するプロトコルを提示します。我々の結果は、CGがCOL2A1の過剰発現、より広範なECM沈着、および軟骨凝集体形成を含め、ASCをにSox9をアップレギュレーションおよび軟骨形成分化表現型を誘導することを示しています。我々の結果に基づいて、CGに暴露されたASCは、番目に良い代替されていますEのMSCは、TGF-β1で処理し、従って、軟骨再生のための移植に使用されてもよいです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
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