Introduction
관절 연골의 결함은 자연적으로 치유되지 않습니다. 따라서, 세포 이식이 손상 연골의 수리를 위해 유망한 방법으로 제안 된 줄기. 그러나,이 방법은 줄기 세포의 충분한 수의 취득 및 연골 분화를 받아야하는 이러한 세포의 유도를 모두 요구한다. 골수 (BM)은 널리 줄기 세포의 공급원으로서 사용되었지만, BM 세포의 분리는 두 가지 단점이있다 : 침입 불충분 수율. 때문에 취득 용이성, 지방 조직에서 줄기 세포의 바람직한 소스이다. 이전의 연구는 지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리 및 TGF-β1 (1, 2)과 같은 사이토 카인을 사용하여 이들 세포의 연골 분화를 유도하는 가능성을 입증 하였다. 이러한 방법은 효과가 있지만 비싸다.
사이토킨에 대한 저비용 대안으로서, 기계적 응력에 사용될 수있다연골 분화를 유도한다. 기계적 부하는 관절 연골 (3)의 상태를 유지하는데 중요한 역할을하고, 여러 가지 세포의 연골 세포 표현형을 유도 할 수있다. 예를 들어, 수압은 MAP 키나아제 / JNK 경로 4를 통해 활막 유래 전구 세포의 연골 세포 표현형을 유도하고, 기계 압축비는 연골 세포의 유전자 5 상승 조절하여 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)에서 연골을 유도한다. 또한, 전단 응력은 인간 중간 엽 줄기 세포의 연골 6 관련된 세포 외 기질 (ECM)의 발현에 기여한다. 원심 중력 (CG)를 원심 분리에 의해 용이하게 생성 된인가 제어 기계적 응력은 셀 7에서 차등 유전자 발현을 유도 할 수있다. 예를 들어, 폐 상피 암종 세포에서 인터루킨 (IL) -1b의 발현을 원심 분리 (8)에 의해 상향 조절된다. 티herefore, 실험적으로 유도 기계적 응력으로서, CG는 줄기 세포의 연골 세포에서 유전자 발현을 유도 할 수있다. 그러나, CG는 줄기 세포의 연골 분화를 유도 할 수 있는지 불분명.
본 연구에서는 CG가 연골 세포 유전자의 과발현의 결과로, 인간의 ASC에서, SOX9의 상향 조절, 연골의 마스터 레귤레이터를 유도 한 것으로 나타났습니다. 또, TGF-β1의 것과 연골에 CG의 효과, 성장 인자는 가장 일반적으로 줄기 세포에서 시험 관내 연골을 유도하는 데 비해.
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Protocol
이 연구 프로토콜은 NIH 지침에 따라 가톨릭 대학교 (KC16EAME0162)의 기관 검토위원회의 승인을 수행 하였다. 모든 조직은 서면 통보 동의를 얻었다.
1. 원심 중력로드 및 펠렛 문화
- 세포 배양 및 수확
- 배양의 ASC (P2-P3, 자재 목록 참조), 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 배지 낮은 글루코즈 (DMEM-LG)에서 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터있다.
- 세포가 80 % 합류에 도달했을 때, 배지를 버리고 1X 인산 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)으로 세포를 세척 하였다.
- PBS 함유 1mM의 EDTA 1 ㎖를 첨가하고, 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 분간 배양한다.
- 에 세포를 전송, 부드럽게 문화 판을 눌러 새로운 배지 4 mL를 넣고15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 실온에서 2 분 (RT) 250 × g에서 세포.
- 원심 중력 하중
- 원심 분리 (단계 1.1.4) 후, 펠렛을 교란시키지 않고 상층 액을 제거하고, 10 % FBS와 DMEM-LG 10ml에 펠렛을 재현 탁. 혈구 세포를 사용하여 계산.
- CG로드를 들어, 15 분 동안 2,400 × g에서 새로운 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 2.5 × 10 5 세포를 전송합니다.
- 펠렛의 문화
- 즉시 원심 분리 후, 상등액을 흡인하고 정의 연골 분화 배지 500 μL를 추가 (CDM은 고 글루코스 DMEM는 1 % FBS, 1 % ITS + 프리믹스, 100 나노 덱사메타손, 1X MEM 비 필수 아미노산 용액, 50 μg의 보충 / ㎖ L - 프롤린, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신). 모든 매체 변화에 새로 제조 된 L- 아스 코르 빈산 2- 인산의 50 μg의 / ML을 추가합니다. 양성 대조군으로, 연골 유도 differentiati추가하여 원심 분리하지 않은 세포에 CDM은 10 NG / mL의 TGF-β1을 포함.
- 서 위치 펠렛을 함유하는 튜브를 캡핑 느슨하게 삽입하고, 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ℃에서 배양한다.
- 삼주 위해 매일 매체를 변경합니다.
- Micromass 문화
- 즉시 원심 분리 (단계 1.2.2 15 분 동안 2,400 ×의 g) 후, 뜨는을 대기음 및 CDM의 10 μL에 펠렛을 재현 탁.
- micromass을 형성하기 위해, 24- 웰 플레이트의 웰의 중앙에 재현 탁하고 세포를 배치했다.
- 2 시간 후, 조심스럽게 micromass을 방해하지 않도록 접시의 벽에 잘 피펫에 CDM 1 mL를 넣어. 양성 대조군으로, 10 NG / ㎖ TGF-β1을 포함하는 CDM을 첨가하여 원심 분리하지 않은 세포와 micromass 배양을 수행한다.
- 5 % CO 2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양 한 micromass.
- 매체 EV 변경삼주에 대한 다른 일 ERY.
2. 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 연골 세포 분화 마커 전사 상향 조절을 검출하도록
- 14 일에, 1X PBS에서 그들을 새로운 1.5 ML의 튜브에 회전 타원체 펠렛을 전송하고 씻어 피펫을 사용합니다.
- 구 아니 디늄 티오 시아 네이트 페놀 - 클로로포름 추출 방법 (9)를 사용하여 펠렛에서 총 RNA를 추출합니다.
- 제조사의 프로토콜에 따라 역전사 효소를 이용하여 총 RNA로부터 2 μg의 cDNA의 합성 (1 시간 동안 42 ° C에서 부화 한 다음 5 분 동안 70 ℃에서 효소를 실활).
- 연골 분화 마커 (10)에 대한 특정 프라이머로 PCR을 수행합니다.
3. 염색은 연골 분화 마커 단백질의 과발현을 감지하는
- 파라핀 포함 세포 펠렛
- 21 일에,회전 타원체 펠렛을 수확하고 1X PBS로 씻어 피펫을 사용합니다.
- 24 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 침수에 의한 회전 타원체의 알약을 수정합니다.
주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성이다. 눈, 피부 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. 노출을 최소화하고 준비하는 동안 흡입을 피하십시오. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. - 정착액을 취소하고 탈 이온수 (DW)와 세포 펠렛을 씻어.
- 카세트에 거즈의 한 층을 삽입하고 피펫을 사용하여 고정 된 펠렛을 전송합니다. 거즈를 접어 펠렛을 덮고 카세트 뚜껑을 닫습니다.
- 펠렛을 탈수.
- RT에서 5 분 동안 70 % 에탄올 (EtOH 중)의 펠릿을 담근다.
- RT에서 5 분 동안 80 % EtOH로의 알약을 담가.
- RT에서 5 분 동안 95 % EtOH로의 알약을 담가.
- RT에서 5 분 동안 100 %의 EtOH의 알약을 담가. 두 번 반복합니다.
- 실온에서 15 분 동안 100 % 크실렌의 알약을 담가. 반복 트위어가전.
- 금형에 56 ° C에서 파라핀에 고정 된 세포 펠렛을 포함; 펠릿 전문 자동화 조직 처리 시스템을 사용하여 파라핀에 매립 될 수있다.
- 회전 마이크로톰을 이용하여 파라핀 세포 펠릿으로부터 두께 5㎛의 부분을 잘라.
- 50 %의 EtOH의 섹션 플로트 다음 슬라이드를 사용하여 50 ℃의 수조로 옮긴다.
- 슬라이드에 떠있는 섹션을 배치합니다.
- Safranin O 및 알 시안 블루 염색
- 파라핀 섹션 재수.
- 15 분 동안 크실렌의 슬라이드를 담가. 두 번 반복합니다.
- 5 분 동안 100 % EtOH 중 슬라이드를 담근다. 두 번 반복합니다.
- 5 분 동안 90 %의 EtOH에 슬라이드를 담근다.
- 5 분 동안 80 %의 EtOH에 슬라이드를 담근다.
- 5 분 동안 70 % EtOH로의 슬라이드를 담가하고 1X PBS에서 그들을 씻는다.
- 1 % Safranin O 솔루션 3 % 알 시안 블루 용으로 재수 섹션을 얼룩30 분.
- 염색 솔루션을 취소하고 DW와 섹션을 씻어.
- 1 분 동안 헤 마톡 실린 / 에오신 용액 (Counterstain과)와 섹션을 얼룩.
- 염색 솔루션을 취소하고 DW와 섹션을 씻어.
- 잔여 물을 제거 한 후 커버 슬립에 장착 매체의 드롭을 놓습니다. 조심스럽게 장착 매체를 포함하는 커버 슬립에 슬라이드 (아래 셀 측)을 배치합니다.
- 슬라이드는 실온에서 2 ~ 3 시간 동안 건조하도록 허용합니다.
- 밝은 필드 현미경 (자동화 직립 현미경, 50X 및 200X)를 사용하여 이미지를 캡쳐.
- 파라핀 섹션 재수.
- 면역 형광 분석
- 섹션 3.2.1에 설명 된대로 섹션을 재수.
- 시트르산 나트륨 완충액에서 슬라이드 (10 mM의 시트르산 나트륨, 0.05 % 트윈 20, pH를 6.0)에 담가하고, 마이크로파를 이용하여 10 분 동안 서브 끓는 온도들을 유지한다.
- 실온에서 20 분 동안 슬라이드를 냉각 한 후 수돗물로 씻어.
- 3 %에서 슬라이드를 부화H 2 O 다음 15 분 동안 (1X PBS)에 2, 15 분 11 수돗물로 씻는다.
- 1 시간 동안 완충액 (PBS 중 10 % 정상 염소 혈청)을 차단와 슬라이드 블록.
- 블로킹 용액을 흡인하고 슬라이드 상 5 % 정상 염소 혈청으로 희석 차 항체를 적용한다.
- 4 ℃에서 밤새 슬라이드를 품어.
- 5 분마다 1X PBS에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
- 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 5 % 정상 염소 혈청으로 희석하고, 형광 접합 된 이차 항체의 슬라이드를 부화.
- 어둠 속에서 5 분마다 1X PBS에서 슬라이드를 세 번 씻으십시오.
- 10 분 동안 DAPI (1 μg의 / mL)으로 슬라이드를 품어하고 5 분마다 1X PBS에서 그들에게 두 번 씻는다.
- 잔여 물을 제거 한 후 커버 슬립에 장착 매체의 드롭을 놓습니다. 조심스럽게 설치 매체에 슬라이드 (아래 셀 측)을 배치합니다.
- 슬라이드 2-3에 대한 건조하도록 허용실온에서 어둠 속에서 시간.
- 형광 현미경을 사용하여 슬라이드를 시각화 (594 nm의 DAPI : 루비로드 340 nm의, 60X 및 200X 배율) 12.
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Representative Results
원심 중력 지방 유래 줄기 세포의 연골 세포 분화 마커의 과다 발현을 유도한다.
연골 분화를 유도하기에 적합한 원심 중력의 정도를 결정하기 위해,의 ASC는 15 분 동안 다른 CG의도 (0, 300, 600, 1,200, 2,400 XG)로 자극 하였다. 자극 후, ASC를 배양 플레이트에 다시 접종하고 24 시간 동안 배양 하였다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, SOX9 mRNA 발현은 현저히 2400 XG 증가시켰다 이 약 (의 ASC는 CG로드되지 않음) 제어에 비해 2,400 XG에서 높은 1.5 배이었다. CG는 연골 분화를 유도 여부를 확인하기 위해, 우리는 CG로드 또는 TGF-β1 처리에 의해의 ASC를 자극. 음성 대조군으로는 ASC를 자극하지 않고 배양 하였다. 샘플은 14 일에 수확하고, QRT-PCR을 실시 하였다. F에 도시 한 바와 같이,igure 1, COL2A1 mRNA의 대표적인 연골 분화 마커, 세포합니다 (비자극의 ASC)를 제어하는 CG 상대적인 자극의 ASC에서 상향 조절되었다. CG의 자극 COL2A1 mRNA가 상향 조절 수준은 TGF-β1의 치료에 의해 유도되는 것과 유사 하였다. 한편, COL10, 비후성 연골 세포의 마커는 CG 자극으로 하향 조절되었다. COL1 컨트롤에 검출 가능하게 높은 상대가 아니었다 반면 관절 연골의 주요 구성 요소를 인코딩 ACAN의 mRNA는, CG 자극에 의해 약 2 배 상향 조절했다. 나도 ACAN도 COL1은 TGF-β1 치료의 ASC에서 상향 조절되지 않았다.
원심 중력 지방 유래 줄기 세포의 펠렛 배양에 관련된 연골 세포 외 기질의 발현을 유도한다.
예금이러한 글리코 사 미노 글리 칸 등의 ECM의 이온, 연골 분화의 특징 표현형이다. 도 2a에 도시 된 바와 같이,이 물질을 감지하기 위해, 우리는 Safranin O와 하루 (21)에 알 시안 블루 펠렛 배양의 ASC를 염색, CG로 자극의 ASC는에서 대조군보다 더 글리코 사 미노 글리 칸 (Safranin O 빨간색과 알 시안 블루 파란색)를 기탁 TGF-β1 치료의 ASC에 의해 퇴적 된 것과 비슷한 수준. 이러한 실험에서 양성 염색은 연골 매트릭스의 형성을 나타내었다. 추가 확인을 위해, 우리는 PE - 공액 안티 COL2A1 항체를 사용 COL2A1 단백질의 발현을 모니터링. COL2A1는 TGF-β1 (그림 2B)로 처리의 ASC에서보다 약간 더 큰 정도 CG로 자극의 ASC에서 과발현되었다.
연골 형성은 골재 지방 유래 줄기 세포의 배양 micromass 원심 중력에 의해 유도된다.
(13)의 전제 조건입니다. 따라서, 우리는 CG 나 TGF-β1 자극 제어의 ASC의 문화와의 ASC의 micromass의 응축을 비교했다. 도 3에 도시 된 바와 같이,의 ASC (화이트 색 점선 사각형으로) 더 큰 밀도 및 집계 관리 배양보다 CG 나 TGF-β1의 ASC로 자극 이루어지는 micromass 배양에서 검출되었다.
SOX9는 지방 유래 줄기 세포에서 원심 중력에 의해 상향 조절된다.
Sox9는 연골 분화 14, 15의 마스터 레귤레이터이다. CG가의 ASC에서 Sox9의 상향 조절을 유도 여부를 확인하려면, 우리는 CG의 stimula의 다양한 기간에 노출의 ASC에서 SOX9의 mRNA의 발현을 모니터링기 (2400 ×의 g). SOX9 발현 CG 다양한 수준에서 연구 되었으나, 2,400 × g에서보다 큰 힘으로 CG 조건간에 유의 한 차이가 없었다 (데이터는 보이지 않음). SOX9의 mRNA의 발현은 CG 자극의 15 분 이후에 증가하기 시작하고, 30 분 (그림 4A) 후 포화되었다. 다음에, 긴 CG 유도 Sox9 과발현이 유지 될 수 있는지 결정하기 위해, 우리는 지정된 시점에서 CG 자극의 ASC를 수확 Sox9의 발현을 모니터링. 도 4b에 도시 된 바와 같이, Sox9 단백질의 발현 CG 자극 후 3 시간까지 증가하고, 적어도 12 시간 동안 그 수준에서 유지되었다.
그림 1. 원심 중력 지방 유래 줄기 세포의 연골 분화 마커의 상향 조절을 유도한다. A)으로 확인하려면uitable 원심 중력은 ASC를 15 분 동안 다른 CG (0, 300, 600, 1200 및 2400 XG)에서 원심 분리 하였다. SOX9 mRNA 발현은 CG 자극 후 24 시간 째에 평가 하였다. B) 연골 관련 유전자의 발현을 평가하기 위해) 총 RNA)가 10 NG / ㎖ (TGF-β1 처리 원심 분리되었다의 ASC로부터 추출하고, 또는 비자극 (제어한다. RNA를 다음 RT-PCR로 증폭 된 cDNA를 합성하도록 역전사 하였다. 모든 실험은 3 회 이상 수행 하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. ** p <제어 (비 자극의 ASC) 대 CG로 자극의 ASC 0.01.
도 2 원심 중력 지방 유래 줄기 세포의 펠렛 배양에 관련된 연골 세포 외 매트릭스를 유도한다. A) 프로테오글리칸 매트릭스 형식CG 로딩으로 이온. CG 로딩 형 콜라겐 (2)의 B) CG 유도 과발현은 ASC를 15 분 동안 2,400 × g에서 원심 분리 하였다. 연골 관련 ECM의 과발현 Safranin O 및 시안 블루 (Alcian Blue) 염색을 이용하여 원심 분리의 ASC로 이루어진 구형 펠릿으로 평가 하였다. (: 594 nm의, DAPI : 340 nm의 루비로드) 콜라겐 타입 2의 과발현은 콜라겐 2 형에 대한 항체와 알렉사 플 루어 594 - 복합 이차 항체를 이용하여 면역 형광에 의해 확인되었다. 연골 관련 ECM 과발현에 CG의 효과를 결정하기의 ASC는 양성 대조군으로 TGF-β1 (10 NG / ㎖)로 처리 하였다. 음성 대조군은 CG로드 또는 TGF-β1 처리를 실시하지 펠릿 문화였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
![그림 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg"/>)
도 3 연골 응집체 형성은 지방 유래 줄기 세포의 배양 micromass 원심 중력에 의해 유도된다. 연골 분화를 유도하기의 ASC (2.5 × 105)은 2400 × g에서 또는 TGF-β1 (10 NG / ㎖)로 처리하여 원심 분리에 의해 자극 하였다. 비자극의 ASC는 대조군으로 사용 하였다. micromasses을 형성하기 위해, 세포 (2.5 × 10 10분의 5 μL)를 24 웰 플레이트에서 웰의 중앙에 배치했다. 처리의 ASC 2 컨트롤 배양 신선한 배지-CDM의 H 및 TGF-β1을 포함의 ASC 및 CDM을 원심 분리 (10 NG / ㎖) 후, TGF-β1-된 웰에 첨가하고, 샘플을 14 일 동안 배양 하였다. 연골 축합 응집체의 크기에 의해 평가 하였다.
그림 4. SOX9는 upreg입니다지방 유래 줄기 세포에서 원심 중력 ulated. 다양한 시간 간격에 대한 CG 자극에 의해 SOX9의 mRNA의 A) 상향 조절. 상이한 시점에서 CG 자극의 ASC에서 B) Sox9 단백질 발현. 의 ASC는 CG 로딩 후 24 시간 동안 단층으로 성장시켰다. mRNA의 상향 조절 및 Sox9의 단백질 발현은 각각 RT-PCR 및 웨스턴 블로 팅에 의해 확인되었다.
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Discussion
세포의 stemness 상태는 SOX9의 CG에 의한 과잉 발현에 매우 중요합니다. 우리의 연구에서, SOX9 표현은 아니지만 나중에-통로의 ASC에서, 초기 통로의 ASC (2-3)에서 CG에 의해 유도 될 수있다. 배양 동안의 ASC 3 통로 (16)까지 CD34 + 세포를 포함하는 것으로보고되었다. 의 ASC는 세포가 CG로 낮은 반응의 결과로 계대 CD34의 발현을 상실하는 경향이있다.
원심 중력으로, 수압은 CG 자극하는 동안 세포에로드 할 수 있습니다. 따라서, 매질의 부피 SOX9의 유도에 영향을 미치는 하나의 요인 일 수있다. 각 실험에 대한 짝수 정수압 환경을 유지하기 위해, 배지 1 ㎖를 15 ㎖의 튜브에 1 × 105 세포 당 사용 하였다. 또한, 스윙 버킷 로터가 균일 (직각을 형성함으로써) 세포에 CG를 적용 하였다.
TGF-β1에 비해 CG 낮은 능력을 위해 보여의 ASC에서 SOX9 및 연골 세포 마커의 발현을 유도. 이것은이 기술의 한계 일 수있다. CG 자극의 ASC는 생체 내 모델에서 정상적인 기능의 레벨까지 손상된 연골을 재생할지 여부를 임상 응용의 경우, 추가로 조사한다.
성장 인자, 특히 TGF-β1과 시험 관내 배양에서 간세포 (17)의 연골 분화를 유도하는 가장 효과적인 방법이다. 이 방법은 세포 농축 및 연골 분화 유도에 유용한 것으로 알려져있다. 그러나, 초기 노화 예상치 못한 혈통 차별화는 종종 체외 배양 (18, 19) 중 발생합니다. 더 심각한 체외 배양에서 오염의 위험이다. 반면에, 우리의 방법은 성장 인자와 시험 관내 연골 세포 분화에 필요로하지 않는다. 줄기 세포는 PA에 이식 할 수있다tient 즉시 격리 및 저 오염 위험 및 단축 된 처리 시간을 보증 할 수있다 다음 원심 분리 한 후. 줄기 세포 주변의 미세 환경은 연골 분화 유도 중요합니다. 예기치 않은 혈통 분화는 생체 외 환경에서 부적절한 발생할 수 있습니다. 원심 줄기 세포가 추가로 분화 과정없이 환자 (연골 분화에 적합한 환경)의 연골에 이식 할 수 있기 때문에, 우리의 방법에서 설명한 바와 같이, 예기치 계통 분화는 감소 될 수있다.
여기서는의 ASC의 연골 분화를 유도하는 CG를 사용하는 프로토콜을 제시한다. 우리의 결과는 CG가 Sox9의 상향 조절 및 COL2A1 과발현, 더 광범위한 ECM 증착 및 연골 집계 형성 포함의 ASC의 연골 분화의 표현형을 유도하는 것으로 나타났다. 이러한 결과에 기초하여, CG에 노출의 ASC는 제위한 좋은 대체물이다전자 엽 줄기 세포는 TGF-β1으로 처리하고 따라서 연골 재생 용 이식에 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
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