Introduction
Defekter i leddbrusk ikke gro naturlig. Derfor stamcelletransplantasjon har blitt foreslått som en lovende metode for reparasjon av svekket brusk. Imidlertid krever denne metoden både oppkjøp av et tilstrekkelig antall stamceller og induksjon av disse cellene til å gjennomgå chondrogenic differensiering. Benmarg (BM) har blitt mye brukt som en kilde av stamceller, men celleisolasjon fra BM har to store ulemper: invasivitet og utilstrekkelig kapasitet. På grunn av sin enkle oppkjøpet, er fettvev en foret kilde til stamceller. Tidligere studier demonstrert muligheten for å isolere stamceller fra fettvev og indusere differensiering chondrogenic i disse cellene ved anvendelse av cytokiner, slik som TGF-β1 1, 2. Disse fremgangsmåtene er effektive, men kostbare.
Som et rimeligere alternativ til cytokiner, kan mekanisk stress brukes til åindusere chondrogenic differensiering. Mekanisk belastning spiller en avgjørende rolle i å opprettholde helsen til leddbrusk tre, og det kan indusere chondrogenic fenotyper i forskjellige celler. For eksempel, hydrostatiske trykket induserer chondrogenic fenotyper i synovialhinne-avledet stamceller via MAP kinase / JNK vei 4, og mekanisk kompresjon induserer chondrogenesis i humane stamceller (MSC) ved oppregulering chondrocytic gener 5. I tillegg bidrar skjærspenning til ekspresjon av chondrogenesis relaterte ekstracellulære matriks (ECM) i humane MSC 6. Sentrifugal gravitasjon (CG), en lett brukt og kontrollert mekanisk stress generert ved sentrifugering, kan indusere differensial genuttrykk i celler 7. For eksempel, i lunge epiteliale karcinomceller, blir ekspresjon av interleukin (IL) -1b oppregulert ved sentrifugering 8. Therefore, som et eksperimentelt induserbar mekaniske påkjenninger, cg kan anvendes for å indusere chondrocytic genekspresjon i stamceller. Imidlertid er det fortsatt uklart om CG kan indusere chondrogenic differensiering av stamceller.
I denne studien fant vi at CG indusert oppregulering av SOX9, en mester regulator av chondrogenesis, i menneskelige ASCs, noe som resulterer i overekspresjon av chondrocytic gener. I tillegg, sammenlignet vi effektene av CG på chondrogenesis med de til TGF-β1, vekstfaktor som oftest anvendt for å indusere in vitro chondrogenesis i stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien protokollen ble godkjent av Institutional Review Board of The Catholic University of Korea (KC16EAME0162) og utført i henhold til NIH retningslinjer. Alle vev ble oppnådd med skriftlig informert samtykke.
1. Syklon Gravity Lasting og Pellet Kultur
- Cellekultur og høsting
- Kultur ASCer (P2-P3, se liste over materialer) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium-lav glukose (DMEM-LG) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S) ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2.
- Når cellene når 80% konfluens, kast mediet og vask cellene med 5 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS).
- Tilsett 1 ml PBS inneholdende 1 mM EDTA og inkuberes i 2 minutter ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2.
- Trykk på kultur plate forsiktig, tilsett 4 ml frisk medium, overføre cellene til15 ml konisk rør, og sentrifuger cellene ved 250 x g i 2 minutter ved romtemperatur (RT).
- Sentrifugal gravitasjon lasting
- Etter sentrifugering (trinn 1.1.4), fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten og resuspender pelleten i 10 ml DMEM-LG med 10% FBS. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- For CG lasting, overfører 2,5 x 10 5 celler i et nytt 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 2400 x g i 15 min.
- pellet kultur
- Umiddelbart etter sentrifugering, Aspirer supernatanten og tilsett 500 ul definert chondrogenic differensieringsmedium (CDM, høy-glucose DMEM supplementert med 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM deksametason, 1 x MEM ikke-essensiell aminosyre-løsning, 50 ug / ml L-prolin og 1% penicillin / streptomycin). Tilsett 50 ug / ml av nyfremstilt L-askorbinsyre 2-fosfat ved hvert medium forandring. Som en positiv kontroll, indusere chondrogenic differentiatipå i usentrifugert cellene ved tilsetning av CDM som inneholdt 10 ng / ml TGF-β1.
- Plasser løst avkortet rør inneholdende pelletene i en stående stilling, og inkuber ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2.
- Endre medium annenhver dag i 3 uker.
- Micro kultur
- Umiddelbart etter sentrifugering (trinn 1.2.2; 2400 x g i 15 min), Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 10 mL av CDM.
- For å danne et Micromass, plasserer de resuspenderte cellene i sentrum av en brønn i en 24-brønns plate.
- Etter 2 timer, tilsett forsiktig 1 ml av CDM til brønnen, pipettering mot veggen av platen for å unngå å forstyrre Micromass. Som en positiv kontroll, utføre et Micromass kultur med usentrifugert celler ved tilsetning av CDM som inneholdt 10 ng / ml TGF-β1.
- Inkuber Micromass ved 37 ° C i en fuktet inkubator inneholdende 5% CO2.
- Endre medium everi annen dag i 3 uker.
2. revers transkriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) for å oppdage Transkripsjonell oppregulering av Chondrogenic Differensiering Markers
- På dag 14, bruke en pipette for å overføre sfæroide pellets i et nytt 1,5-ml rør og vaske dem i 1 x PBS.
- Ekstraher det totale RNA fra pelletene ved hjelp av guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjon metode 9.
- Syntetisere cDNA fra 2 ug av total-RNA ved hjelp av revers transkriptase i henhold til produsentens protokoll (Inkuber ved 42 ° C i 1 time og deretter inaktivere enzymet ved 70 ° C i 5 minutter).
- Utfør PCR med primere spesifikke for chondrogenic differensieringsmarkører 10.
3. Farging å detektere Overuttrykte Chondrogenic Differensieringsmarkørproteiner
- Parafin-embedding celle pellets
- På dag 21,bruk en pipette til å høste sfæroide pellets og vask dem med 1x PBS.
- Fest sfæroide pellets ved nedsenking i 4% paraformaldehyde i 24 timer.
Forsiktig: Paraformaldehyde er svært giftig. Unngå kontakt med øyne, hud eller slimhinner. Minimer eksponering og unngå innånding under forberedelse. Bruk egnet personlig verneutstyr. - Kast fiksativ og skyll cellen pellets med avionisert vann (DW).
- Plasser ett lag av gasbind på kassetten og overføre de faste pellets ved hjelp av en pipette. Dekk pellet ved å brette gasbind og lukke kassettlokket.
- Dehydrerer pelletene.
- Dyppe pelletene i 70% etanol (EtOH) i 5 min ved RT.
- Fordyp pellets i 80% EtOH i 5 min ved RT.
- Dyppe pelletene i 95% EtOH i 5 min ved RT.
- Fordyp pellets i 100% EtOH i 5 min ved RT. Gjenta to ganger.
- Dyppe pelletene i 100% xylen i 15 min ved RT. Gjenta TWIce.
- Bygge inn faste cellepelletene i paraffin ved 56 ° C i en støpeform; pellets kan bygges inn i parafin ved hjelp av spesialiserte automatiserte vev behandlingssystemer.
- Skjær 5 mikrometer tykke seksjoner fra parafin-embedded celle pellet ved hjelp av en rotasjonsmikrotom.
- Float seksjonene i 50% EtOH og deretter overføre dem til en 50 ° C vannbad ved hjelp av et lysbilde.
- Plasser de flytende seksjoner på lysbilder.
- Safranin O og Alcian blå flekker
- Rehydrere parafinsnitt.
- Fordype lysbildene i xylen i 15 min. Gjenta to ganger.
- Fordype lysbildene i 100% EtOH i 5 min. Gjenta to ganger.
- Fordype lysbildene i 90% EtOH i 5 min.
- Fordype lysbildene i 80% EtOH i 5 min.
- Fordype lysbildene i 70% EtOH i 5 min, og deretter vaske dem i 1x PBS.
- Flekk rehydrated seksjoner med 1% safranin O-løsning og 3% Alcian blått for30 min.
- Kast flekker og skyll delene med DW.
- Flekk seksjoner med Hematoxylin / Eosin løsning (counterstain) i 1 min.
- Kast flekker og skyll delene med DW.
- Plasser en dråpe montering medium på en dekkglass etter fjerning vannrester. Plasser forsiktig lysbilde (celle-side ned) på dekkglass som inneholder monteringsmedium.
- Tillat lysbildene tørke i 2-3 timer ved romtemperatur.
- Ta bilder ved hjelp av en lys-feltet mikroskop (automatisert oppreist mikroskop, 50X og 200X).
- Rehydrere parafinsnitt.
- immunfluorescens analyse
- Rehydrere seksjonene som beskrevet i avsnitt 3.2.1.
- Dyppe objektglassene i natriumcitratbuffer (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0), og deretter opprettholde dem i en underkoketemperatur i 10 minutter ved bruk av en mikrobølgeovn.
- Kule lysbildene i 20 min ved RT og deretter vaske dem med vann fra springen.
- Inkuber lysbilder i 3%H 2 O 2 (i 1x PBS) i 15 minutter, og deretter vaske dem med vann fra springen i 15 min 11.
- Blokkere lysbilder med blokkeringsbuffer (10% normalt geiteserum i PBS) i 1 time.
- Aspirer blokkering løsning, og deretter bruke et primært antistoff fortynnet med 5% normalt geiteserum på lysbildene.
- Inkuber lysbildene natten ved 4 ° C.
- Vask objektglassene tre ganger i 1 x PBS i 5 min hver.
- Inkuber glir i fluorokromkonjugerte-konjugert sekundært antistoff fortynnet med 5% normalt geiteserum i 1 time ved romtemperatur i mørket.
- Vask objektglassene tre ganger i 1 x PBS i 5 minutter hver i mørket.
- Inkuber objektglassene med DAPI (1 pg / ml) i 10 min, og deretter vaske dem to ganger i 1 x PBS i 5 min hver.
- Plasser en dråpe montering medium på en dekkglass etter fjerning vannrester. Plasser forsiktig lysbilde (celle-side ned) på monteringsmedium.
- La lysbilder tørke i 2-3time i mørke ved RT.
- Visualisere lysbilder ved hjelp av fluorescens mikroskopi (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X og 200X forstørrelse) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sentrifugale gravitasjon induserer overekspresjon av chondrogenic differensieringsmarkører i adipose-avledet stamceller.
For å bestemme graden av sentrifugalkraften tyngdekraften som er egnet til å indusere differensiering chondrogenic, ble ASCer stimulert med forskjellige grader av CG (0, 300, 600, 1200, og 2400 x g) i 15 min. Etter stimulering, at ASCer ble gjen sådd ut på kulturplater og dyrket i 24 timer. Som vist i figur 1A, ble SOX9 mRNA-ekspresjon betydelig øket ved 2400 xg; det var omtrent 1,5 ganger høyere i 2400 xg enn i kontrollgruppen (ASCs ikke lastet med CG). For å bekrefte om CG induserer chondrogenic differensiering, stimulert vi ASCs av CG lasting eller TGF-β1 behandling. Som en negativ kontroll, ASCer ble dyrket uten stimulering. Prøvene ble høstet på dag 14 og QRT-PCR ble utført. Som vist i Figur 1, COL2A1 mRNA, en representant chondrogenic differensiering markør, ble oppregulert i ASCs stimulert av CG forhold til kontrollceller (unstimulated ASCs). Oppregulering nivået av COL2A1 mRNA ved CG stimulering var lik den som er indusert av TGF-β1 behandling. På den annen side, COL10, en markør for hypertrofisk kondrocytter, ble nedregulert ved CG stimulering. ACAN mRNA, som koder for en vesentlig strukturell komponent av leddbrusk, ble oppregulert ca. 2 ganger med CG stimulering, mens COL1 ikke var påvisbart forhøyet sammenlignet med kontrollene. Hverken ACAN eller COL1 ble oppregulert i ASCer behandlet med TGF-β1.
Sentrifugal tyngdekraften induserer ekspresjon av et chondrogenesis relatert ekstracellulær matriks i pelleten kultur av adipose-avledede stamceller.
Innskuddion av ECM, som glycosaminoglycan, er et kjennetegn fenotype av chondrogenic differensiering. For å påvise dette materialet, vi farget pellet-dyrkede ASCer med safranin O og Alcian blått på dag 21. Som vist i figur 2A, ASCer stimulert med CG avsatt mer glykosaminoglykan (red for safranin O og blå for Alcian blått) enn kontrollene, ved en nivå lik den som er avsatt av ASCer behandlet med TGF-β1. I disse eksperimentene, positiv farging viste dannelsen av en bruskmatrise. For ytterligere bekreftelse, overvåket vi uttrykk for COL2A1 protein ved hjelp av PE-konjugert anti-COL2A1 antistoff. COL2A1 ble overuttrykt i ASCer stimulert med CG til en noe større grad enn i ASCer behandlet med TGF-β1 (figur 2B).
Chondrogenic aggregatdannelse induseres ved sentrifugal tyngdekraften i et Micromass kultur av adipose-avledede stamceller.
13. Derfor sammenlignet vi kondens i Micro mellom kulturer av kontroll ASCs og ASCs stimulert med CG eller TGF-β1. Som vist i figur 3, ble større og tettere samlinger av ASCer (hvit-farget i den stiplede firkanten) detektert i kulturer Micromass laget av ASCer stimulert med CG eller TGF-β1 enn i kontrollkulturer.
SOX9 blir oppregulert ved sentrifugal tyngdekraft i adipose-avledet stamceller.
Sox9 er en mester regulator av chondrogenic differensiering 14, 15. For å avgjøre om CG induserer oppregulering av Sox9 i ASCs, overvåket vi uttrykk for SOX9 mRNA i ASCs eksponert for ulike varigheter av CG Stimulasjon (2400 x g). SOX9 uttrykk ble undersøkt ved ulike grader av CG, men det var ikke signifikant forskjellig mellom CG forhold med krefter som er større enn 2400 x g (data ikke vist). Ekspresjon av mRNA SOX9 begynte å øke etter 15 minutter av CG stimulering, og det ble mettet etter 30 min (figur 4A). Neste, for å finne ut hvor lenge CG-indusert Sox9 overekspresjon kan opprettholdes, høstet vi CG-stimulerte ASCs på de angitte tidspunkter og overvåkes uttrykk for Sox9. Som vist i figur 4B, ekspresjon av Sox9 protein økes inntil 3 timer etter stimulering CG og holdt seg på dette nivå i minst 12 timer.
Figur 1. Sentrifugalpumper gravitasjon induserer oppregulering av chondrogenic differensieringsmarkører i adipose-avledet stamceller. A) For å bestemme somuitable sentrifugal tyngdekraften, ASCer ble sentrifugert ved forskjellig CG (0, 300, 600, 1200, og 2400 x g) i 15 min. SOX9 mRNA-ekspresjon ble bedømt ved 24 timer etter stimulering CG. B) For å vurdere ekspresjon av chondrogenesis-relaterte gener, ble total RNA ekstrahert fra ASC som var blitt sentrifugert, behandlet med TGF-β1 (10 ng / ml), eller ikke-stimulerte (kontroller). RNA ble underkastet revers transkripsjon for å syntetisere cDNA som så ble amplifisert ved RT-PCR. Alle forsøkene ble utført minst tre ganger. Feilfelt representerer standardavvik. ** P <0,01 for ASCer stimulert med CG vs kontroll (ikke-stimulerte ASCer).
Figur 2. Syklon gravitasjon induserer en chondrogenesis relaterte ekstracellulære matrise i pellets kulturer av adipose-avledet stamceller. A) proteoglykan matrise formation av CG lasting. B) CG-indusert overekspresjon av kollagen type 2. For CG lasting, ble ASCs sentrifugert ved 2400 × g for 15 min. Overekspresjon av chondrogenesis relatert ECM ble evaluert i sfæroide pellets som består av sentrifugert ASC gjennom bruk av safranin O og Alcian blå farging. Overekspresjon av kollagen type 2 ble bekreftet ved immunfluorescens ved å bruke et antistoff mot kollagen type 2 og en Alexa Fluor 594-konjugert sekundært antistoff (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm). For å bestemme effekten av CG på chondrogenesis relaterte ECM overekspresjon, ble ASCer behandlet med TGF-β1 (10 ng / ml) som en positiv kontroll. Den negative kontrollen var en pellet kultur ikke utsettes for CG lasting eller TGF-β1 behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
![Figur 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
Figur 3. Chondrogenic aggregatdannelse induseres ved sentrifugal tyngdekraft i Micromass kulturer av adipose-avledede stamceller. For å indusere differensiering chondrogenic, ble ASCer (2,5 x 10 5) stimulert ved sentrifugering ved 2400 x g eller ved behandling med TGF-β1 (10 ng / ml). Ustimulerte ASCer ble anvendt som kontroller. For å danne micromasses, ble celler (2,5 x 10 5/10 ul) plassert i sentrum av brønner i en 24-brønns plate. Etter 2 timers inkubering, friske medium-CDM for kontroller og sentrifugert ASCer og CDM inneholdende TGF-β1 (10 ng / ml) i ASCer behandlet med TGF-β1-ble tilsatt til brønnene, og prøvene ble inkubert i 14 dager. Kondrocytt kondensasjonen ble evaluert ved størrelsen av aggregatene.
Figur 4. SOX9 er upregulated ved sentrifugal tyngdekraft i adipose-avledet stamceller. A) Oppregulering av SOX9 mRNA ved CG stimulering av forskjellige tidsintervaller. B) Sox9 protein uttrykk i CG-stimulerte ASCs på ulike tidspunkter. ASCs fikk lov til å vokse som et monolag i 24 timer etter at CG lasting. mRNA oppregulering og protein ekspresjon av Sox9 ble bekreftet ved RT-PCR og Western blotting, respektivt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den stemness tilstand av celler er svært viktig for CG-indusert overekspresjon av SOX9. I vår studie kunne SOX9 uttrykk induseres av CG tidlig-passasjen ASCs (2-3), men ikke i senere-passasjen ASCs. Det har blitt rapportert at, under dyrking, ASCer inneholde CD34 + celler til 3 passasjer 16. ASC har en tendens til å miste ekspresjon av CD34 som cellene er passert, noe som resulterer i en lav respons til CG.
Med sentrifugal tyngdekraften, kan det hydrostatiske trykk bli lastet på cellene under CG stimulering. Derfor kan volumet av mediet være en av faktorene som påvirker induksjon av SOX9. For å opprettholde et jevnt hydrostatisk trykk miljø for hvert eksperiment, ble 1 ml medium pr 1 x 10 5 celler i en 15-ml tube. I tillegg ble en sving-spannrotor som brukes til å søke jevnt CG til cellene (ved å danne en rett vinkel).
Sammenlignet med TGF-β1, CG viste en lavere evne til åindusere SOX9 og chondrogenic markør uttrykk i ASCs. Dette kan være en begrensning av denne teknikk. For en klinisk anvendelse, må det bli ytterligere undersøkt hvorvidt CG-stimulerte ASCer regenerere svekket brusk opp til nivået for normal funksjon i en in vivo modell.
In vitro kultur med vekstfaktorer, spesielt TGF-β1, er den mest effektive metoden for å indusere chondrogenic differensiering av stamceller 17. Denne metoden er kjent for å være nyttig for celle oppformering og differensiering chondrogenic induksjon. Men tidlig alderdom og uventet avstamning differensiering oppstår ofte under in vitro kultur 18 19. Mer alvorlig er høy risiko for forurensning fra in vitro kulturer. På den annen side, ikke vår metode ikke krever in vitro chondrogenic differensiering med vekstfaktorer. Stamceller kan bli transplantert inn et patient umiddelbart etter isolering og etter sentrifugering, noe som kan sikre en lav forurensningsrisiko og en kortere behandlingstid. Mikromiljøet rundt stamceller er avgjørende for chondrogenic differensiering induksjon. Uventet avstamning differensiering kan skyldes en feil in vitro miljø. Som nevnt i vår fremgangsmåte, fordi sentrifugert stamceller kan transplanteres inn i brusken en pasient (riktig miljø for chondrogenic differensiering) uten en ytterligere differensiering prosess, kan uventet avstamning differensiering reduseres.
Her presenterer vi en protokoll som bruker CG å indusere chondrogenic differensiering av ASCs. Våre resultater viser at CG induserer Sox9 oppregulering og chondrogenic differensiering fenotyper i ASCs, inkludert COL2A1 overekspresjon, mer omfattende ECM avsetning, og chondrogenic aggregatdannelse. Basert på våre resultater, de ASCs utsatt for CG er en god erstatning for the MSC behandlet med TGF-β1 og kan derfor brukes i transplantasjoner for brusk regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
- Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
- Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
- Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
- Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
- Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
- Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
- Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
- Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
- Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
- Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).
