Introduction
Defeitos na cartilagem articular não curam naturalmente. Consequentemente, transplante de células estaminais tem sido proposto como uma abordagem promissora para a reparação de cartilagem deficiente. No entanto, este método requer a aquisição de um número suficiente de células estaminais e a indução destas células para sofrerem diferenciação condrogénica. medula óssea (MO) tem sido amplamente utilizado como uma fonte de células estaminais, mas o isolamento de células a partir de BM tem duas grandes desvantagens: a invasividade e rendimento insuficiente. Devido à sua facilidade de aquisição, o tecido adiposo é uma fonte preferida de células estaminais. Estudos anteriores demonstraram a possibilidade de isolar as células estaminais a partir de tecido adiposo e indução da diferenciação condrogénica nestas células utilizando citoquinas, tais como TGF-β1 1, 2. Esses métodos são eficazes, mas caro.
Como uma alternativa de baixo custo para as citocinas, a tensão mecânica pode ser usado parainduzir a diferenciação condrogênica. Carga mecânica desempenha um papel crítico na manutenção da saúde da cartilagem articular 3, e pode induzir fenótipos condrogênicos em várias células. Por exemplo, a pressão hidrostática induz fenótipos condrogênicos em células progenitoras derivadas de sinóvia por meio da via da MAP-cinase / JNK 4, e a compressão mecânica induz condrogénese em células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) por regulação positiva de genes condrocítico 5. Além disso, a tensão de cisalhamento contribui para a expressão de matriz extracelular relacionada com a condrogénese (ECM) em 6 MSCs humanas. Centrífuga gravidade (CG), um stress mecânico controlado facilmente aplicada e gerado por centrifugação, pode induzir a expressão diferencial de genes em células de 7. Por exemplo, em células de carcinoma epitelial de pulmão, a expressão de interleucina (IL) -1-B é regulado positivamente por centrifugação 8. Tor conseguinte, como um stress mecânico experimentalmente indutível, CG pode ser utilizado para induzir a expressão de genes em células estaminais condrocítico. No entanto, não fica claro se CG pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco.
Neste estudo, descobrimos que CG induziu a regulação positiva de SOX9, um regulador mestre da chondrogenesis, no ASC humanos, resultando na superexpressão de genes condrocítico. Além disso, comparou-se os efeitos de CG em condrogénese com aqueles de TGF-β1, o factor de crescimento mais comumente usado para induzir a condrogénese in vitro em células estaminais.
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Protocol
Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC16EAME0162) e realizada de acordo com as diretrizes do NIH. Todos os tecidos foram obtidas com consentimento informado por escrito.
1. centrífugas Gravidade carregar e Cultura Pellet
- Cultura de células e colheita
- ASC Culture (P2-P3; ver Lista de Materiais) em modificação Médio-baixo teor de glucose de Eagle da Dulbecco (DMEM-LG) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2.
- Quando as células atingem a confluência de 80%, descartar o meio e lava-se as células com 5 ml de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).
- Adicionar 1 ml de PBS contendo EDTA 1 mM e incuba-se durante 2 min a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2.
- Toque da placa de cultura suavemente, adicionar 4 ml de meio fresco e transferir para as célulasum tubo de 15 mL cónico, e centrifugar as células a 250 x g durante 2 minutos à temperatura ambiente (TA).
- Carregando gravidade centrífuga
- Após centrifugação (passo 1.1.4), remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento e ressuspender o sedimento em 10 mL de DMEM-LG com FBS a 10%. Contar as células usando um hemocitômetro.
- Por CG carga, transferir 2,5 x 10 5 células para um novo tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 2400 x g durante 15 min.
- cultura pellet
- Imediatamente após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e adicionar 500 mL de meio de diferenciação condrogénica definido (CDM, DMEM-elevado teor de glucose suplementado com FBS a 1%, com 100 nM de dexametasona, 1x MEM não essenciais solução de aminoácidos 1% ITS + Premix, 50 ug / ml de L-prolina, e 1% de penicilina / estreptomicina). Adicionar 50? G / ml de ácido L-ascórbico 2-fosfato preparada de fresco a cada mudança de meio. Como um controlo positivo, induzir differentiati condrogênicasem células não centrifugada por adição de MDL contendo 10 ng / mL de TGF-β1.
- Colocar os tubos tapados frouxamente contendo os peletes numa posição de pé e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2.
- Alterar o meio em dias alternados durante 3 semanas.
- cultura Micromass
- Imediatamente após a centrifugação (passo 1.2.2; 2400 × g durante 15 min), aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 mL de MDL.
- Para formar um Micromass, colocar as células ressuspensas no centro de um poço de uma placa de 24 poços.
- Após 2 h, adicionar cuidadosamente 1 mL de MDL para o poço, pipetando contra a parede da placa para evitar perturbar o Micromass. Como um controlo positivo, realizar uma cultura de micromassa com células não centrifugada por adição de MDL contendo 10 ng / mL de TGF-β1.
- Incubar a Micromass a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO 2.
- Alterar o ev médioery outro dia durante 3 semanas.
2. Transcriptase Reversa-Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) para detectar transcricional A sobre-regulação de marcadores condrogénica Diferenciação
- No dia 14, utilizar uma pipeta para transferir os peletes esferoidais para um novo tubo de 1,5 mL e lavá-las em PBS 1x.
- Extrai-se a ARN total a partir dos peletes utilizando o tiocianato de guanidina-fenol-clorofórmio método de extracção 9.
- Sintetizar ADNc a partir de 2 ug de ARN total utilizando a transcriptase reversa de acordo com o protocolo do fabricante (incubar a 42 ° C durante 1 h e, em seguida, desactivar a enzima a 70 ° C durante 5 min).
- Executar PCR com primers específicos para os marcadores de diferenciação condrogênicas 10.
3. Coloração para detectar a sobre-expressão de condrogênica Diferenciação marcador Proteínas
- peletes de células-parafina
- No dia 21,usar uma pipeta para colher os granulados esferóides e lavá-los com PBS 1x.
- Fixar os peletes esferoidais por imersão em paraformaldeído a 4% durante 24 h.
Cuidado: O paraformaldeído é altamente tóxico. Evitar o contacto com os olhos, pele ou membranas mucosas. Minimizar a exposição e evitar a inalação durante a preparação. Use equipamento de proteção pessoal apropriado. - Descartar o fixador e lavar os sedimentos celulares com água desionizada (DW).
- Coloque uma camada de gaze para a cassete e transferir os peletes fixos utilizando uma pipeta. Cobrir o sedimento por dobragem a gaze e fechar a tampa do estojo.
- Desidratar os peletes.
- Mergulhar as pelotas em 70% de etanol (EtOH) durante 5 min à TA.
- Mergulhar as pelotas em 80% de EtOH durante 5 min à TA.
- Mergulhar os peletes em EtOH a 95% durante 5 min à TA.
- Mergulhar os peletes em EtOH a 100% durante 5 min à TA. Repita duas vezes.
- Mergulhar as pelotas em 100% de xileno durante 15 min à TA. Repita twice.
- Incorporar as pelotas de células fixadas em parafina a 56 ° C num molde; as pelotas podem ser embutidos em parafina utilizando sistemas de processamento de tecido automatizados especializados.
- Cortar secções de 5 um de espessura a partir do sedimento de células embebidas em parafina utilizando um micrótomo rotativo.
- Flutuar as seções em 50% EtOH e depois transferi-los para um banho de água a 50 ° C usando um slide.
- Coloque as seções flutuantes em lâminas.
- Safranina O e coloração azul Alcian
- Reidratar os cortes de parafina.
- Imergir as lâminas em xileno durante 15 min. Repita duas vezes.
- Imergir as lâminas em EtOH a 100% durante 5 min. Repita duas vezes.
- Imergir as lâminas em 90% EtOH durante 5 min.
- Imergir as lâminas em 80% EtOH durante 5 min.
- Imergir as lâminas em etanol 70% para 5 min, e em seguida lavá-los em 1x PBS.
- Manchar as seções reidratadas com solução de safranina O 1% e 3% de azul Alcian para30 minutos.
- Descartar a solução de coloração e enxaguar as seções com DW.
- Corar as secções com solução Hematoxilina / Eosina (counterstain) durante 1 min.
- Descartar a solução de coloração e enxaguar as seções com DW.
- Colocar uma gota de meio de montagem sobre uma lamela após a remoção de qualquer água residual. Com cuidado, coloque o slide (celular voltado para baixo) sobre a lamela contendo o meio de montagem.
- Permitir que as lâminas secar durante 2-3 h à TA.
- Capturar imagens usando um microscópio de campo brilhante (microscópio vertical automatizado, 50X e 200X).
- Reidratar os cortes de parafina.
- imunofluorescência
- Reidratar as seções como descrito no ponto 3.2.1.
- Mergulhar as lâminas em tampão de citrato de sódio (citrato de sódio 10 mM, 0,05% de Tween 20, pH 6,0) e, em seguida, mantê-los a uma temperatura sub-ebulição durante 10 min, utilizando um microondas.
- Arrefecer as lâminas durante 20 minutos a TA e, em seguida, lavá-las com água da torneira.
- Incubar as lâminas em 3%H 2 O 2 (em 1x PBS) durante 15 min, e em seguida, lavá-las com água da torneira durante 15 min, 11.
- Bloquear as lâminas com tampão (soro de cabra normal a 10% em PBS) de bloqueio, durante 1 h.
- Aspirar a solução de bloqueio, e, em seguida, aplicar um anticorpo primário diluído com soro de cabra normal a 5% para as lâminas.
- Incubar as lâminas durante a noite a 4 ° C.
- Lavam-se as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 minutos cada.
- Incubar as lâminas em anticorpo secundário conjugado com fluorocromo diluiu-se com soro de cabra normal a 5% durante 1 h à TA no escuro.
- Lavam-se as lâminas três vezes em 1X PBS durante 5 min cada, no escuro.
- Incubar as lâminas com DAPI (1 ug / ml) durante 10 min, e em seguida, lavá-los duas vezes em 1X PBS durante 5 minutos cada.
- Colocar uma gota de meio de montagem sobre uma lamela após a remoção de qualquer água residual. Com cuidado, coloque o slide (celular voltado para baixo) no meio de montagem.
- Permitir que os slides para secar por 2-3h no escuro à temperatura ambiente.
- Visualizar os slides usando microscopia de fluorescência (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X e ampliação de 200X) 12.
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Representative Results
gravidade centrífuga induz a superexpressão de marcadores de diferenciação condrogênicas em células-tronco derivadas de tecido adiposo.
Para determinar o grau de força da gravidade centrífuga que é adequado para induzir a diferenciação condrogénica, ASC foram estimuladas com diferentes graus de CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) durante 15 min. Após a estimulação, as ASC foram re-semeadas em placas de cultura e cultivadas durante 24 h. Como mostrado na Figura 1A, a expressão de ARNm SOX9 foi significativamente aumentado a 2.400 xg; era cerca de 1,5 vezes superior a 2.400 xg do que no controle (ASC não carregado com CG). Para confirmar se CG induz a diferenciação condrogênica, que estimulou ASC por CG carregamento ou por tratamento TGF-β1. Como controlo negativo, as ASC foram cultivadas sem estimulação. As amostras foram colhidas no dia 14 e qRT-PCR foi realizado. Tal como mostrado na Figura 1, COL2A1 mRNA, um marcador de diferenciação condrogênica representante, foi regulada na ASC estimuladas pela CG em relação às células de controlo (as ASC não estimuladas). O nível de sobre-regulação de ARNm COL2A1 estimulação por CG era semelhante ao induzido pelo tratamento com TGF-β1. Por outro lado, COL10, um marcador de condrócitos hipertróf icos, foi regulada negativamente por estimulação CG. ACAN mRNA, que codifica uma componente estrutural principal da cartilagem articular, foi regulado positivamente de aproximadamente 2 vezes por estimulação CG, enquanto que não foi detectável COL1 elevado em relação aos controlos. Nem ACAN nem COL1 foram upregulated na ASC tratados com TGF-β1.
gravidade centrífuga induz a expressão de uma matriz extracelular relacionada com a condrogénese na cultura sedimento de células estaminais derivadas de tecido adiposo.
Depósitoião de ECM, tais como glicosaminoglicano, é uma marca registrada fenótipo de diferenciação condrogénica. Para detectar este material, que coradas ASC pelete-cultivadas com safranina O e azul Alcian no dia 21. Como se mostra na Figura 2A, ASC estimuladas com CG depositado mais glicosaminoglicano (vermelho para safranina O e azul de Alcian blue) do que os controlos, a uma nível semelhante ao depositado por ASC tratados com TGF-β1. Nestas experiências, a coloração positiva indicou a formação de uma matriz de cartilagem. Para posterior confirmação, que monitorizou a expressão da proteína COL2A1 utilizando o anticorpo anti-COL2A1 conjugado com PE. COL2A1 foi sobre-expresso em ASC estimuladas com CG para um ligeiramente maior extensão do que em ASC tratados com TGF-β1 (Figura 2B).
a formação de agregados condrogénica é induzido pela gravidade centrífuga num Micromass cultura de células estaminais derivadas de tecido adiposo.
13. Portanto, nós comparamos a condensação nas Micromass entre as culturas de ASC controle e ASC estimulados com CG ou TGF-β1. Como mostrado na Figura 3, maiores e mais densas agregações de ASC (de cor branca no quadrado a tracejado) foram detectados em culturas de mi cromas sa feitas de ASC estimuladas com CG ou TGF-β1 do que nas culturas de controlo.
SOX9 é regulada positivamente pela gravidade centrífuga em células estaminais derivadas de tecido adiposo.
Sox9 é um regulador mestre de diferenciação condrogênica 14, 15. Para determinar se CG induz a regulação positiva de Sox9 no ASC, acompanhámos a expressão de mRNA SOX9 na ASC expostos a várias durações de CG estimulaçãoção (2400 x g). SOX9 expressão foi investigado em vários graus de GC, mas não diferiram significativamente entre as condições de GC com forças superiores a 2400 × g (dados não mostrados). Expressão de ARNm SOX9 começou a aumentar depois de 15 minutos de estimulação CG, e foi saturado após 30 min (Figura 4A). Em seguida, para determinar o tempo que a sobre-expressão induzida por Sox9 CG pode ser mantida, eu colhi ASC CG-estimuladas nos pontos de tempo indicados e monitorizada a expressão de Sox9. Como mostrado na Figura 4B, a expressão da proteína Sox9 aumentada até 3 horas após a estimulação CG e permaneceu a este nível durante, pelo menos, 12 h.
Figura 1. gravidade centrífugas induz a regulação positiva de marcadores de diferenciação condrogênicas em células-tronco derivadas de tecido adiposo. A) Para determinar comoforça da gravidade centrífuga uitable, ASC foram centrifugadas a CG diferente (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) durante 15 min. a expressão de ARNm SOX9 foi avaliada às 24 h após a estimulação CG. B) Para avaliar a expressão de genes associados à condrogénese, o RNA total foi extraído a partir de ASC que tinha sido centrifugadas, tratadas com TGF-β1 (10 ng / ml), ou não estimuladas (controlos). O ARN foi submetido a transcrição reversa para sintetizar ADNc que foi depois amplificado por RT-PCR. Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes. As barras de erro representam o desvio padrão. ** P <0,01 para ASC estimulados com CG em relação ao controle (ASC não estimulada).
Figura 2. gravidade centrífuga induz uma matriz extracelular relacionada com a condrogénese em culturas de pelotas de células estaminais derivadas de tecido adiposo. A) formato de matriz de proteoglicanoião por CG carregamento. B) a sobre-expressão induzida por CG de colagénio de tipo 2. Para CG carregamento, as ASC foram centrifugadas a 2400 x g durante 15 min. A sobre-expressão de ECM condrogénese-relacionada foi avaliada em peletes esferóides que consistem de ASC centrifugadas através do uso de safranina O e coloração com azul Alcian. A sobre-expressão de colagénio do tipo 2 foi confirmada por imunof luorescência utilizando um anticorpo contra o colagénio tipo 2 e um 594-conjugado anticorpo secundário Alexa Fluor (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm). Para determinar o efeito dos GC na sobreexpressão ECM relacionados com a condrogénese, ASC foram tratados com TGF-β1 (10 ng / mL) como um controlo positivo. O controlo negativo foi uma cultura de sedimento não submetido a CG carregamento ou o tratamento de TGF-β1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
![Figura 3]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
Figura 3. formação de agregados condrogénica é induzido pela gravidade centrífuga em culturas de mi cromas sa de células estaminais derivadas de tecido adiposo. Para induzir a diferenciação condrogénica, ASC (2,5 x 10 5) foram estimuladas por centrifugação a 2400 × g ou por tratamento com TGF-β1 (10 ng / mL). ASC não estimuladas foram utilizados como controle. Para formar micromasses, células (2,5 x 10 5/10 uL) foram colocadas no centro de poços numa placa de 24 poços. Após 2 h de incubação, meio fresco-CDM para os controlos e centrifugado ASC e MDL contendo TGF-β1 (10 ng / mL) durante ASC tratados com TGF-β1-foi adicionada aos poços, e as amostras foram incubadas durante 14 dias. condensação de condrócitos foi avaliada através do tamanho dos agregados.
Figura 4. SOX9 é upregpovoadas por gravidade centrífuga em células estaminais derivadas de tecido adiposo. A) A sobre-regulação de ARNm SOX9 por CG estimulação para vários intervalos de tempo. B) a expressão de proteínas em Sox9 ASC CG-estimuladas em diferentes pontos de tempo. ASC foram deixadas crescer como uma monocamada durante 24 h após CG carregamento. ARNm sobre-regulação e a expressão da proteína de Sox9 foram confirmadas por RT-PCR e Western blotting, respectivamente.
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Discussion
O estado stemness de células é muito importante para a superexpressão induzida por CG de SOX9. Em nosso estudo, a expressão SOX9 poderia ser induzida por CG na ASC cedo-passagem (2-3), mas não no ASC depois-passagem. Tem sido relatado que, durante o cultivo, ASC conter células CD34 + 3 até 16 passagens. ASC tendem a perder a expressão de CD34 como as células são passadas, resultando em uma baixa resposta de CG.
Com força da gravidade centrífugo, a pressão hidrostática pode ser carregado em células durante a estimulação CG. Por conseguinte, o volume do meio pode ser um dos factores que afectam a indução de SOX9. Para manter um ambiente de pressão hidrostática mesmo para cada experiência, 1 ml de meio foi utilizado por um x 10 5 células em um tubo de 15 mL. Além disso, um rotor de balde oscilante foi usado para aplicar uniformemente CG para as células (através da formação de um ângulo recto).
Em comparação com TGF-β1, CG mostrou uma capacidade inferior ainduzir SOX9 e expressão do marcador condrogênica na ASC. Esta pode ser uma limitação desta técnica. Para aplicação clínica, que devem ser investigados se ASC CG-estimuladas regenerar a cartilagem danificada até ao nível da função normal num modelo in vivo.
A cultura in vitro com factores de crescimento, especialmente TGF-β1, é o método mais eficaz para induzir a diferenciação de células estaminais condrogénica 17. Este método é conhecido como sendo útil para o enriquecimento de células e indução de diferenciação condrogénica. No entanto, a senescência precoce e diferenciação da linhagem inesperada ocorrem frequentemente durante o cultivo in vitro 18, 19. Mais grave é o alto risco de contaminação a partir de culturas in vitro. Por outro lado, o nosso método não necessita de diferenciação condrogénica in vitro com factores de crescimento. As células estaminais podem ser transplantadas para um patient imediatamente após o seu isolamento e após a centrifugação, o qual pode garantir um baixo risco de contaminação e um tempo de processamento reduzido. O microambiente em torno de células-tronco é fundamental para a indução de diferenciação condrogênica. Diferenciação da linhagem inesperada pode resultar de uma inadequada em ambiente vitro. Como mencionado no nosso método, porque as células estaminais podem ser transplantadas centrifugadas para a cartilagem de um paciente (o ambiente apropriado para a diferenciação condrogénica) sem um processo adicional de diferenciação, diferenciação linhagem inesperado pode ser diminuída.
Aqui, apresentamos um protocolo que utiliza CG para induzir a diferenciação condrogênica da ASC. Nossos resultados mostram que CG induz upregulation Sox9 e fenótipos de diferenciação condrogênicas em ASC, incluindo a superexpressão COL2A1, a deposição de ECM mais extensa, e formação de agregados condrogênica. Com base em nossos resultados, as ASC expostos a CG é um bom substituto para o the MSC tratadas com TGF-β1 e podem, portanto, ser utilizados em transplantes de regeneração da cartilagem.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
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