Introduction
eklem kıkırdağında Kusur doğal iyileşmek yok. Sonuç olarak, hücre transplantasyonu bozulmuş kıkırdak tamiri için umut verici bir yaklaşım olarak önerilmiştir kaynaklanıyor. Bununla birlikte, bu yöntem, bir kök hücre, yeterli sayıda elde edilmesi ve kondrojenik farklılaşma geçmesi bu hücrelerin uyarılmasını gerektirir. Kemik iliği (BM), yaygın olarak, kök hücre kaynağı olarak kullanılmıştır, ancak BM hücre izolasyonu, iki önemli dezavantajı vardır: invaziv ve yetersiz verim. Çünkü satın kolaylığı nedeniyle, yağ dokusu, kök hücrelerin tercih edilen kaynağıdır. Daha önceki çalışmalar, adipoz dokusundan kök hücrelerin izole edilmesi ve TGF-ß1 1, 2 gibi sitokinler kullanılarak bu hücrelerde kondrojenik farklılaşmasını uyaran uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Bu yöntemler etkili ama pahalı.
sitokinler için daha düşük bir ekonomik alternatif olarak, mekanik strese kullanılabilirkondrojenik farklılaşmasını indükler. Mekanik yükleme eklem kıkırdağı 3 sağlığını korumada önemli bir rol oynar, ve çeşitli hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olabilir. Örneğin, hidrostatik basınç MAP kinaz / JNK yolunun 4 üzerinden sinovya kaynaklı progenitör hücrelerde kondrojenik fenotipleri neden olur ve mekanik sıkıştırma kondrositik genleri 5 regülasyonunda insan mezenkimal kök hücrelerin (MKH) 'de kondrojenezi neden olur. Buna ek olarak, kayma gerilmesi insan MSC 6 kondrogenezis ilgili ekstrasellüler matriks (ECM) ifadesi katkıda bulunur. Santrifüj ağırlığı (CG), santrifüj ile üretilen bir kolaylıkla uygulanabilen ve kontrollü mekanik stres, hücre 7 farklı gen ifadesini endükleyebilen. Örneğin, akciğer epitelyal karsinom hücrelerinde, interlökin (IL) -1b sentezlenmesi santrifüj 8 ile üst-düzenlenmektedir. Therefore, deneysel olarak uyanlabilir mekanik stres, CG kök hücrelerdeki kondrositik, gen ekspresyonunu başlatmak için kullanılabilir. Ancak, CG kök hücrelerin kondrojenik farklılaşmasını teşvik edip belirsizliğini koruyor.
Bu çalışmada, CG kondrositik genlerin tanımlanması sonuçlanan insan TSK olarak, SOX9 uyarılması, kondrojenez bir ana regülatör neden olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak, TGF-ß1 olanlar ile kondrojenez CG etkileri, büyüme faktörü en çok kök hücrelerin in vitro kondrojenezi indüklemek için kullanılan göre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma protokolü NIH kurallarına göre Kore Katolik Üniversitesi (KC16EAME0162) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmış ve gerçekleştirilmiştir. Bütün dokular yazılı bilgilendirilmiş rıza ile elde edilmiştir.
1. Santrifüj Yerçekimi Yükleme ve Pelet Kültür
- Hücre kültürü ve hasat
- Kültür TSK (P2-P3; Malzemelerin listesine bakınız), 37 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı düşük glikoz (DMEM-LG) 'de % 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde.
- Hücreler% 80 kaynaşmaya eriştikten sonra, orta atmak ve 1 x fosfat tamponlu tuz 5 mL (PBS) hücreleri yıkamak.
- PBS içeren 1 mM EDTA 1 ml ilave edilir ve% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de 2 dakika süreyle inkübe edin.
- hücreleri transferi, hafifçe kültürü plakası dokunun taze ortam 4 ml15 ml konik tüp, santrifüj, oda sıcaklığında 2 dakika boyunca (RT) 250 x g'de hücreleri.
- Santrifüj yerçekimi yükleme
- Santrifüj (aşama 1.1.4) sonra pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve% 10 FBS bulunan DMEM-LG 10 mL pelletini. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- CG yükleme için, 15 dakika için 2400 x g 'de, yeni bir 15 mL konik tüp ve santrifüj 2.5 x 10 5 hücre transfer edin.
- pelet kültürü
- Hemen Santrifüjlemeden sonra, süpernatan aspire ve belirlenen kondrojenik farklılaştırma ortamının 500 ul ekle (CDM, yüksek glukozlu DMEM,% 1 FBS,% 1 ITS + karışımlar, 100 nM deksametason, 1x MEM gerekli olmayan amino asit çözeltisi, 50 ug ile takviye / ml L-prolin, ve% 1 penisilin / streptomisin). Her bir değiştirilen ortam içinde taze hazırlanmış L-askorbik asit 2-fosfat 50 ug / ml. Bir pozitif kontrol olarak, kondrojenik differentiati sebepekleyerek santrifujlenmemiş hücrelerde ilgili CDM 10 ng / ml TGF-ß1 ihtiva etmektedir.
- Bir ayakta durma konumunda peletleri içeren gevşek kapatılmış tüp yerleştirilir ve% 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de inkübe edin.
- 3 hafta boyunca her gün orta değiştirin.
- Micromass kültürü
- Hemen santrifüj (aşama 1.2.2, 15 dakika boyunca 2400 x g) sonra, süpernatan aspire ve CDM 10 mcL pelletini.
- bir mikro oluşturmak üzere bir 24-çukurlu plaka iyi merkezinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler yerleştirin.
- 2 saat sonra, dikkatli bir şekilde mikrokütle bozmamak için plakanın duvara de, pipetleme CDM 1 ml. Bir pozitif kontrol olarak, 10 ng / ml TGF-ß1 ihtiva CDM eklenerek santrifujlenmemiş hücreleri ile bir Micromass kültürü yerine getirir.
- % 5 CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C 'de mikrokütle inkübe edin.
- orta EV değiştirme3 hafta boyunca gün ery.
2. Ters Transkriptaz-Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) kondrojenik Farklılaşma İşaretlerinin transkripsiyonel upregülasyonun Algılama için
- 14. günde, 1 x PBS içinde bunları yeni bir 1.5 ml tüp küremsi pelet aktarmak ve yıkama için bir pipet kullanın.
- Guanidinyum tiosianat-fenol-kloroform ekstraksiyon yöntemi 9 kullanarak pelet toplam RNA ekstrakte edin.
- üreticinin protokolüne uygun olarak, ters transkriptaz kullanılarak toplam RNA 2 ug cDNA sentez (1 saat boyunca 42 ° C'de inkübe ve daha sonra 5 dakika süreyle 70 ° C 'de enzimi inaktive).
- Kondrojenik farklılaşma markörünü 10 için özel primerler ile PCR gerçekleştirin.
3. Boyama kondrojenik Farklılaşma Marker proteinlerin aşırı ekspresyonu Algılama için
- Parafin gömme hücre topakları
- 21. günde,sfero pelet hasat ve 1x PBS ile onları yıkamak için bir pipet kullanın.
- 24 saat süreyle% 4 paraformaldehid içinde daldırma ile küremsi pelet sabitleyin.
Dikkat: Paraformaldehyde son derece toksiktir. Gözlere, cilde veya mukoza ile temasından kaçının. maruziyeti en aza indirmek ve hazırlanması sırasında solunması. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. - fiksatif atın ve deiyonize su (DW) ile hücre pelletleri durulayın.
- kasete gazlı bir katmanı yerleştirin ve bir pipet kullanarak sabit pelet aktarın. gazlı katlanarak pelet Kapak ve kaset kapağını kapatın.
- pelet dehydrate.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 70 etanol (EtOH) 'de pelet bırakın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 80 EtOH içinde peletler bırakın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 95 EtOH içinde peletler bırakın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 100 EtOH içinde peletler bırakın. İki kez tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 100 ksilen pelet bırakın. Tekrarlama twice.
- bir kalıba 56 ° C'de parafin sabit hücre pelletleri yerleştirme; pelet uzmanlaşmış otomatik doku işleme sistemlerini kullanarak parafin içine gömülü olabilir.
- bir döner mikrotom kullanılarak parafine gömülü hücre topağından 5 um kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir.
- % 50 EtOH bölümleri yüzer ve sonra bir slayt kullanarak bir 50 ° C su banyosunda aktarabilirsiniz.
- Slaytlarınıza yüzen bölümleri yerleştirin.
- Safranin O ve Alcian blue boyama
- Parafin bölümleri rehidrate.
- 15 dakika ksilen slaytlar daldırın. İki kez tekrarlayın.
- 5 dakika boyunca% 100 EtOH içinde slaytlar bırakın. İki kez tekrarlayın.
- 5 dakika boyunca% 90 EtOH slaytlar daldırın.
- 5 dakika boyunca% 80 EtOH slaytlar daldırın.
- 5 dakika boyunca% 70 EtOH slaytlar bırakın ve daha sonra 1 x PBS içinde yıkayın.
- % 1 Safranin O solüsyonu ve% 3 Alcian mavi için birlikte rehidrate bölümleri Leke30 dk.
- boyama çözüm atın ve DW ile bölümleri durulayın.
- 1 dakika boyunca Hematoksilen / Eosin çözeltisi (counterstain) ile bölümleri Leke.
- boyama çözüm atın ve DW ile bölümleri durulayın.
- herhangi bir artık suyun çıkarılmasından sonra bir lamel üzerine monte ortamının bir drop yerleştirin. Dikkatle montaj orta içeren lamel slayt (aşağı hücre tarafı) yerleştirin.
- slaytlar oda sıcaklığında 2-3 saat süreyle kurumaya bırakın.
- Parlak alan mikroskobu (otomatik dik bir mikroskop, 50X ve 200X) kullanarak görüntüleri yakalayabilir.
- Parafin bölümleri rehidrate.
- immünofloresan tahlil
- Bölüm 3.2.1'de tarif edildiği gibi bölümleri rehidrate.
- sodyum sitrat tampon maddesi içinde slaytlar (10 mM sodyum sitrat,% 0.05 Tween 20, pH 6.0) daldırın ve bir mikrodalga kullanılarak 10 dakika için bir alt-kaynama sıcaklığında onları korumak.
- Oda sıcaklığında 20 dakika için slaytlar soğutun ve daha sonra, musluk suyu ile yıkanır.
- % 3 slaytlar inkübeH 2, daha sonra O 15 dakika boyunca (1 x PBS içinde) 2 ve 15 dakika 11 musluk suyu ile yıkayın.
- 1 saat boyunca tampon (PBS içinde% 10 normal keçi serumu) ile slaytlar bloke.
- engelleme çözeltisi aspire ve slaytlar üzerine% 5 normal keçi serumu ile seyreltilmiş birincil antikor uygulayın.
- 4 ° C'de bir gece slaytlar inkübe edin.
- 5 dakika her biri için 1x PBS slaytlar üç kez yıkayın.
- karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 normal keçi serumu ile seyreltildi florokrom-konjuge sekonder antikor slaytlar inkübe edin.
- karanlıkta 5 dakika her biri için 1x PBS slaytlar üç kez yıkayın.
- 10 dakika için DAPI (1 ug / mL) ile slaytlar inkübe, ve daha sonra 5 dakika her biri için 1 x PBS içinde onları iki kez yıkayın.
- herhangi bir artık suyun çıkarılmasından sonra bir lamel üzerine monte ortamının bir drop yerleştirin. Dikkatle montaj ortamda slayt (aşağı hücre tarafı) yerleştirin.
- slaytlar 2-3 kurumasını bekleyinOda sıcaklığında, karanlıkta, H.
- Floresan mikroskobu kullanarak slaytlar gözünüzde canlandırın (: 594 nm, DAPI: Rhod 340 nm; 60X ve 200X büyütme) 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Santrifüj gravite adipoz elde edilen kök hücreleri kondrojenik farklılaşma markerlerinin aşırı ekspresyonunu indükler.
kondrojenik değişimi etkilemek için uygun olan, santrifüj yerçekimi kuvveti derecesini belirlemek için, TSK 15 dakika için farklı CG derece (0, 300, 600, 1200 ve 2400 x g) ile uyarıldı. stimülasyon sonrasında TSK kültür plakaları üzerine yeniden ekildi ve 24 saat süre ile kültüre edildi. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, SOX9 mRNA ifadesi önemli ölçüde 2400 xg'de arttırılmıştır; yaklaşık (TSK CG ile yüklü değil) kontrol grubuna göre 2.400 xg'de yüksek 1.5 kat oldu. CG kondrojenik farklılaşmasını uyarır olmadığını teyit etmek için, biz CG yükleme veya TGF-β1 tedavisi ile TSK uyarılmış. Bir negatif kontrol olarak, TSK herhangi bir uyarı olmaksızın kültürlenmiştir. Örnekler 14. günde toplandı ve QRT-PCR ile gerçekleştirilmiştir. F'de gösterildiği gibiŞEKIL 1, COL2A1 mRNA'nın bir Örnek kondrojenik farklılaşma işareti, hücreler (uyarılmamış TSK) kontrol etmek için CG nisbetle uyarılan TSK oranda yukarı regüle edilmiştir. CG uyarısıyla COL2A1 mRNA'nın artışı seviyesi, TGF-β1 muamele ile uyarılan edilene benzerdi. Öte yandan, COL10, hipertrofik kondrositler bir göstergesi, CG uyarımı ile aşağı regüle edilmiştir. Col1 kontrollere algılanabilir yükselen bağıl değildi, oysa eklem kıkırdağının en önemli yapısal bileşen kodlayan ACAN mRNA, CG stimülasyonu ile yaklaşık 2-kat arttı. Ne ACAN de Col1 TGF-ß1 ile muamele TSK yukarı regüle edilmiştir.
Santrifüj gravite adipoz elde edilen kök hücre peleti kültüründe bir kondrogenezis ilişkili hücre-dışı matris ekspresyonunu indükler.
mevduatBöyle glikozaminoglikan olarak ECM ion, kondrojenik farklılaşma damgasını fenotip olduğunu. Şekil 2A gösterildiği gibi bu malzemeyi tespit etmek amacıyla, biz Safranin O ve gün 21. Alcian mavi pelet-kültürlü TSK lekeli, CG ile uyarılan TSK bir de, kontrol grubuna göre daha fazla glikozaminoglikan (Safranin O için kırmızı ve Alcian blue mavi) yatırılan TGF-ß1 ile muamele TSK tarafından tevdi edilen işleme benzer düzeyi. Bu deneylerde, pozitif boyanma kıkırdak matris oluşumuna işaret etmiştir. Daha fazla doğrulama sağlamak için, PE-konjuge anti-COL2A1 antikoru kullanılarak COL2A1 proteininin ifadesini izlenir. COL2A1 TGF-ß1 (Şekil 2B) ile muamele TSK göre biraz daha yüksek bir oranda CG ile stimüle TSK aşırı eksprese edildi.
Kondrojenik agrega oluşumu yağ kaynaklı kök hücrelerin bir Micromass kültürü santrifüj yer çekimi ile indüklenir.
13 için bir ön koşuldur. Bu nedenle, CG ve TGF-ß1 ile uyarılmış kontrol TSK kültürler ve TSK arasındaki Micromass yoğuşmayı karşılaştırıldı. Şekil 3'te gösterildiği gibi, TSK (beyaz renkli noktalı bir kare inç) daha büyük ve daha yoğun toplamalardan kontrol kültürlerinde daha Cs ya da TGF-ß1 ile stimüle TSK imal Micromass kültürlerinde tespit edilmiştir.
SOX9 adipoz kaynaklı kök hücreler santrifüj yerçekimi tarafından yukarı regüle edilir.
SOX9 kondrojenik farklılaşma 14, 15 bir ana düzenleyicisidir. CG TSK bölgesindeki SOX9 upregülasyonunu teşvik edip etmediğinin saptanması için, CG stimula çeşitli süreler maruz TSK olarak SOX9 mRNA ekspresyonunu takiption (2400 x g). SOX9 ifade CG çeşitli derecelerde araştırıldı, ancak 2400 × g daha büyük kuvvetlerle CG koşullar arasında anlamlı bir fark yoktu (veriler gösterilmemiştir). SOX9 mRNA ekspresyonu CG stimülasyon 15 dakika sonra artmaya başladı ve 30 dakika (Şekil 4A) sonra, doyurulmuştur. Daha sonra, uzun bir CG-kaynaklı SOX9 aşırı korunabilir belirlemek için, belirtilen zaman noktalarında CG-uyarılmış TSK toplanmış ve SOX9 ekspresyonunu takip. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, SOX9 protein ekspresyon CG uyarıldıktan sonra 3 saat kadar artış ve en az 12 saat boyunca bu seviyede kalmıştır.
Şekil 1. Santrifüj yerçekimi adipoz kaynaklı kök hücreler kondrojenik farklılaşma belirteçlerin yükselişini neden olur. A) belirlemek için,dizayn edilmiş santrifüj çekim kuvveti, TSK 15 dakika için farklı CG (0, 300, 600, 1200 ve 2400 x g'de santrifüj) santrifüje edilmektedir. SOX9 mRNA ekspresyonu CG stimülasyon 24 saat sonra değerlendirildi. B) kondrogenezis ilişkili gen ekspresyonunu değerlendirmek), toplam RNA,), 10 ng / ml (TGF-ß1 ile muamele santrifüj edilmiş TSK, ekstrakte edildi, ve uyarılmamış (kontrol eder. RNA daha sonra, RT-PCR ile büyütüldü cDNA sentezlemek üzere ters transkripsiyon tabi tutulmuştur. Tüm deneyler en az üç kez gerçekleştirildi. Hata çubukları, standart sapmayı temsil ederler. ** P <kontrol (uyarılmamış TSK) genel CG ile uyarılan TSK 0.01.
Şekil 2. Santrifüj yerçekimi adipoz kaynaklı kök hücrelerin pelet kültürlerinde bir kondrogenezis ilgili hücre dışı matriks neden olur. A) Proteoglycan matris biçimiCG yüklenerek iyon. CG yükleme için kolajen tip 2 B) CG kaynaklı aşırı, TSK 15 dakika için 2400 x g 'de santrifüjlenmiştir. kondrogenezis İlgili ECM aşırı Safranin O ve Alsiyan mavisi boyaması kullanılarak santrifüj TSK oluşan sferoid peletler değerlendirilmiştir. (: 594 nm, DAPI: 340 nm Rhod) kollajen tip 2 aşırı ekspresyonu kollajen tip 2 karşı bir antikor ve Alexa Fluor 594-konjuge sekonder antikor kullanılarak immünoflüoresans ile teyit edilmiştir. kondrogenezis ilişkili ECM aşırı ekspresyonu CG etkisini belirlemek için, TSK bir pozitif kontrol olarak, TGF-ß1 (10 ng / ml) ile muamele edildi. Negatif kontrol CG yükleme veya TGF-β1 muamelesine tabi olmayan bir pelet kültür oldu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
![Şekil 3,]("/files/ftp_upload/54934/54934fig3.jpg")
Şekil 3. kondrojenik agregat oluşumu adipoz elde edilen kök hücre Micromass kültürleri santrifüj yer çekimi ile indüklenir. Kondrojenik farklılaşmasını teşvik etmek için, TSK (2.5 x 10 5) 2400 x g ya da TGF-ß1 (10 ng / ml) ile işleme tabi tutularak santrifüjle uyarıldı. Uyarılmamış TSK kontroller olarak kullanılmıştır. Micromasses oluşturmak için hücreler (2.5 x 10 5/10 uL), 24 oyuklu bir plaka içerisinde kuyu merkezinde yerleştirilmiştir. ile muamele TSK 2 kontrol inkübasyondan, taze ortam-CDM saat ve TGF-ß1 içeren TSK ve CDM santrifüjlenmiş (10 ng / ml) sonra, TGF-ß1-oldu oyuklara ilave edildi ve numuneler, 14 gün boyunca inkübe edilmiştir. Kondrosit kondansasyon agrega büyüklüğü ile değerlendirildi.
Şekil 4. SOX9 upreg olanadipoz kaynaklı kök hücreler santrifüj yerçekimi ile düzenlenmiştir. Çeşitli zaman aralıkları için CG uyarısıyla SOX9 mRNA) yukarı regülasyonu. Farklı zaman noktalarında CG ile uyarılan TSK B) SOX9 protein ekspresyonu. TSK CG yüklemeden sonra 24 st için bir tek tabaka olarak büyümeye bırakıldı. mRNA upregülasyonu ve SOX9 protein ekspresyonu ise, RT-PCR ve Western blotting ile teyit edilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
hücrelerin stemness durumu SOX9 CG indüklenen aşırı ekspresyonu için çok önemlidir. Bizim çalışmamızda, SOX9 sentezleme ancak sonraki geçiti TSK, erken geçit TSK (2-3) 'de CG neden olabilir. Yetiştirilmesi sırasında, TSK 3 pasajlar 16 kadar, CD34 + hücreleri içermektedir, bildirilmiştir. TSK hücreleri CG düşük bir yanıt elde geçişli olarak CD34 ifadesini kaybetmek eğilimindedir.
merkezkaç yerçekimi kuvveti ile, hidrostatik basınç CG uyarılması sırasında hücreler üzerine yüklenebilir. Bu nedenle, orta hacmi SOX9 indüksiyonunu etkileyen faktörlerden biri olabilir. Her bir deney için daha da hidrostatik basınç ortamı korumak için, ortamın 1 ml 15 ml bir tüp içinde 1 x 10 5 hücre başına kullanılmıştır. Buna ek olarak, bir salıncak kovalı rotor eşit (bir dik açı oluşturarak) hücrelere CG uygulamak için kullanıldı.
TGF-ß1 karşılaştırıldığında, CG daha düşük bir özelliği gösterdiTSK içinde SOX9 ve kondrojenik markör ifadesini teşvik eder. Bu, bu tekniğin bir sınırlama olabilir. CG ile uyarılmış TSK bir in vivo modeli normal fonksiyonun seviyesine kadar bozulmuş kıkırdak yeniden olup klinik uygulama için, daha da incelenmelidir.
Büyüme faktörleri, özellikle de TGF-ß1 ile in vitro kültüründe, kök hücrelerin 17 kondrojenik değişimi etkilemek için en etkili yöntemdir. Bu yöntem, hücre zenginleştirme ve kondrojenik farklılaşma indüksiyonu için faydalı olduğu bilinmektedir. Ancak, erken yaşlanma ve beklenmedik soy ayrımı genellikle in vitro kültür 18, 19 meydana gelir. Daha ciddi in vitro kültürlerde kontaminasyon riski yüksek olan. Diğer yandan, bir yöntem büyüme faktörleri in vitro kondrojenik ayrımında gerektirmez. Kök hücreler bir pa naklediliyor olabilirtient hemen izolasyon ve düşük kontaminasyon riski ve kısaltılmış işlem süresini garanti edebilir aşağıdaki santrifüj, sonra. kök hücre çevresindeki mikro-kondrojenik farklılaşma endüksiyonu için kritik durumdadır. Beklenmedik dizi farklılaşma in vitro ortamda uygun olmayan bir sonucu olabilir. santrifüj kök hücreler ilave bir farklılaşma olmadan bir hastaya (kondrojenik farklılaşması için uygun bir ortam) kıkırdağı içine transplante edilebilir, çünkü, Bu yöntemde belirtildiği gibi, beklenmedik bir dizi farklılaşma azaltılabilir.
Burada, TSK kondrojenik farklılaşmasını ikna etmek için CG kullanan bir protokol mevcut. Bizim sonuçları CG SOX9 regülasyonunu ve COL2A1 aşırı ekspresyonu, daha kapsamlı ECM birikimi ve kondrojenik agrega oluşumu da dahil olmak üzere TSK içinde kondrojenik farklılaşma fenotipleri, uyardığını göstermektedir. Bizim sonuçlara dayanarak, CG maruz kalan TSK inci için iyi bir alternatiftir vardırE MSC'ler, TGF-ß1 ile işlemden geçirildi ve bu yüzden, kıkırdak rejenerasyonu için nakillerinde kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasticware | |||
| 100 mm Dish | TPP | 93100 | |
| 60 mm Dish | TPP | 93060 | |
| 50 mL Cornical Tube | SPL | 50050 | |
| 15 mL Cornical Tube | SPL | 50015 | |
| 10 mL Disposable Pipette | Falcon | 7551 | |
| 5 mL Disposable Pipette | Falcon | 7543 | |
| ASC Culture Media Materials | |||
| DPBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| DMEM Low glucose | Life Technologies | 11885-084 | growth base media |
| Penicilin Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 10% |
| PBS/1 mM EDTA | Life Technologies | 12604-039 | |
| Chondrogenic Differentiation Media Materials | |||
| DMEM High glucose | Life Technologies | 11995 | chondrogenic differentiation base media |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D2915 | 100 nM |
| Penicilin Streptomycin | Life Technologies | P4333 | 1% |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000-044 | 1% |
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma Aldrich | A8960 | 50 μg/mL |
| L-proline | Sigma Aldrich | P5607 | 50 μg/mL |
| ITS | BD | 354352 | 1% |
| Human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL |
| Materials | |||
| 18 mm Cover Glass | Superior | HSU-0111580 | |
| 4% Paraformaldyhyde | Tech & Innovation | BPP-9004 | |
| Tween 20 | BIOSESANG | T1027 | |
| Bovine Serum Albumin | Vector Lab | SP-5050 | |
| Anti-Collagen II antibody | abcam | ab34712 | 1:100 |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probe | A-11037 | 1:200 |
| DAPI | Molecular Probe | D1306 | |
| Prolong gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | |
| Slide Glass, Coated | Hyun Il Lab-Mate | HMA-S9914 | |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 366919 | |
| Isoprypylalcohol | Millipore | 109634 | |
| Ethanol | Duksan | 64-17-5 | |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit | Thermo Scientfic | K1622 | |
| i-Taq DNA Polymerase | iNtRON BIOTECH | 25021 | |
| UltraPure 10x TBE Buffer | Life Technologies | 15581-044 | |
| loading star | Dyne Bio | A750 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 9012-36-6 | |
| 1 kb (+) DNA ladder marker | Enzynomics | DM003 | |
| Human adipose-derived stem cells (ASCs) | Catholic MASTER Cells | ||
References
- Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
- Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
- Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
- Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
- Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
- Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
- Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
- Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
- Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
- Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).
- Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
- Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
- Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
- Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
- Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
- Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
- Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).
