Summary
このプロトコルは、ナノスケールの動的プロセスを観察するために使用されるような、水にAuNPsの透過型電子顕微鏡を走査するための液体流試料ホルダの動作を説明します。
Abstract
完全に液体中に埋め込まれたサンプルを透過型電子顕微鏡（TEM）およびSTEM用試料ホルダーに組み立てられたマイクロ流体チャンバーを用いて走査型透過電子顕微鏡（STEM）でナノスケールの空間分解能で調べることができます。マイクロ流体システムは、薄い窒化シリコン（SiN）からの膜ウィンドウをサポートする2つのシリコンマイクロチップで構成されています。この記事では、サンプルローディングとデータ収集の基本的な手順を説明します。すべての最も重要なのは、液体区画が正しく、したがって、薄い液体層と真空シールを提供し、組み立てられることを保証することです。このプロトコルは、正確な組み立てを確実にするために、サンプルローディング時実行するために必要なテストの数を含みます。試料を電子顕微鏡にロードされると、液体の厚さを測定する必要があります。あまりに薄い液体は、気泡が形成されている場合のように、液体が存在しないことを示すかもしれないが、誤ったアセンブリは、あまりにも厚い液体をもたらすことができます。最後に、プロトコル画像が取得され、どのように動的プロセスを研究することができる方法について説明します。 AuNPsを含む試料は、純水および生理食塩水の両方で画像化されます。
Introduction
従来の走査型透過電子顕微鏡（STEM）は、分析のための適切な標本、高真空中に配置するのに適し、特に乾燥した固体試料の範囲によって制限されます。しかし、多くの科学技術の質問は、液体環境中のナノスケール材料とプロセスに関するものです。完全に液体中に埋め込まれたサンプルは、現在透過型電子顕微鏡（TEM）およびSTEM 1用試料ホルダーに組み立てられたマイクロ流体チャンバを含む概念を用いてSTEMを用いて研究することができます。それが成長、溶解、およびナノ粒子が2、3、4、5の凝集プロセス、6を含む様々な研究トピックの重要なプロセス、に新たな洞察を提供し、この新たに開発された技術は、ますます人気となっています。のみならず、金属はなく、biominerals 7および生物学的システムは図8、 図9、図 10、 図11を検討することができます。液相STEM用のサンプル負荷と画像取得は、乾燥試料のSTEMよりも異なり、専用の訓練を必要とするプロトコルを伴います。
マイクロ流体システムは、（ 図1A参照）、エネルギー12の200 keVの時の電子ビームのための透明な窒化シリコン（SiN）からの膜ウィンドウをサポートする2つのシリコンマイクロチップで構成されています。寸法のこれらのマイクロチップの取り扱いの詳細については、他の場所で12、13見つけることができます。サンプルは、通常、ナノスケールのオブジェクトが含まれています。本稿では、金ナノ粒子（AuNPs）を観察しました。 AuNPsは、（下向きの電子ビーム走行に関して）トップウィンドウで、またはフロートliquに固定化されていますID。 STEMにおけるナノスケールの空間分解能はAuNPsにわたって電子ビームを走査し、環状暗視野（ADF）検出器9を用いて送信散乱電子を収集することによって得られます。 2マイクロチップは、液体流TEMホルダ1（ホルダSTEM及びTEMの両方のために動作するが、TEMホルダとも呼ばれる）の先端に小さなスロットに配置されています。液体区画は、マイクロチップとの間に形成されるように、マイクロチップの一つは、スペーサーが含まれています。 2マイクロチップの両側にOリング（ 図1B参照 ）、液体室13の真空シールを提供します。
この記事の目的は、興味のあるユーザーは、この新興の新しい技術への容易なアクセスを見つけることができるようにサンプルローディングとデータ収集の基本的な手順を示すことです。特定の会社から入手可能なシステムが使用されるが、このプロトコルは、他の企業のシステムに対して有効です。技術であります液体容器システム13を操作する場合より、従来のTEMとSTEMよりも複雑で、かつ実用的な側面の数が考慮されなければなりません。すべての最も重要なのは、液体区画が正しく、したがって、薄い液体層と真空シールを提供し、組み立てられることを保証することです。したがって、きれいに動作し、液体流TEMホルダの製造および組立中に粉塵の形成を防止するために極めて重要です。具体的には、Oリングと2つのシリコンマイクロチップは、すべての汚染がないことが必要です。マイクロチップの上のほこりの小さな粒子がひどく有用空間分解能の達成を防止することができる組電池の厚さを増加させることができます。何の汚れや損傷が実験後、電子顕微鏡に残されないように真空シールが重要です。このプロトコルは、ロード手順といくつかの必要なテストを説明しています。電子顕微鏡の操作は簡単であり、BUそれは固体試料の顕微鏡に比べていくつかの追加の手順が必要ですtは。液体の厚さの増加に伴って、より多くの電子が吸収され、液体により散乱します。液体の厚さの測定が不可欠です。最後に、プロトコルは、画像が取得され、どのように動的プロセスを研究することができる方法について説明します。
図1：走査型透過電子顕微鏡（STEM）のための液体フローセル。 （A）組み立てられた液晶セルの模式図。窒化ケイ素（SiN）から膜の窓を有する2つのシリコンマイクロチップは、2つのOリングとの間に配置されています。液体は、このSiN膜との間に封入されているので、電子顕微鏡の真空から分離されます。サンプルの上に集束電子ビームを走査します。コントラストが散乱電子から得られます。金ナノ粒子（AuNPs）は、このSiN膜で液体内に固定化されているだけでなく、中に移動することができます液体。 （B）のOリングを有する2つのマイクロチップのスタックの概略側面断面図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Protocol
図2：シリコンマイクロチップの清掃方法。 （A）2のビーカーを、アセトンとエタノールそれぞれの40~60 mLで充填されています。 （B）シリコンマイクロチップをアセトンで満たされたビーカー内に配置されます。このSiN膜を有する側が上向きに向くようにします。 2つのSiマイクロチップの反射は明らかに2マイクロチップの裏面に溝を示しています。 （C）2分後、シリコンマイクロチップは、エタノールを充填した第二のビーカーに移します。さらに2分後、シリコンマイクロチップは、乾燥のためにクリーンルーム組織に転送されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：液体の流れ透過電子マイクroscopy（TEM）ホルダー装備。 （A）プラスチック管および液体の流れのための注射器で液体流TEMホルダー。 （B）ホルダ軸から除去された液体流TEMホルダの先端に、液体細胞コンパートメント、Oリング、及び2つのシリコンマイクロチップの蓋。チューブは先端の左側から突出しています。 （C）1 Oリング、マイクロチップの配置のためのスロットを示す液体セルコンパートメント。 （D）ダストフリー表面上の異なるピンセット（アルミ箔）。 （E）は、その2つのOリング付き液晶セルコンパートメントの蓋。 （F）のSiN膜の窓を備えた2つのシリコンマイクロチップ。左：スペーサなしのサンプルマイクロチップ。右：200μmのスペーサーを有するカバーマイクロチップ。 （G）、マイクロ流体ポンプシステム。 このfiguの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。再。
マイクロチップの作製
マイクロチップの1クリーニング
- ダスト粒子フィルタと層流フード内で低ダストレベルでワークスペースを準備します。
- マイクロチップの配置および輸送のための無繊維組織と純粋なエタノールで光顕微鏡スライドガラスを清掃してください。シャーレ内のクリーンルーム組織上のスライドガラスを置きます。
注：すべての回での技術的なエタノールを使用しないでください。 - サンプルの配置とスペーサ厚さ200nmで5マイクロチップのための5ベースのマイクロチップ（スペーサなし）を選択します。
注：ウィンドウのサイズは20×400μm2であるとSiNの厚さは50nmです。寸法上のいくつかの許容範囲があるので、光学顕微鏡を使用して寸法をチェックすることをお勧めします。 - 収納ボックスからマイクロチップを削除し、スライドガラス上に配置する炭素でコーティングされたピンセットを使用してください。彼らのLOにしっかりと、かつ慎重にマイクロチップをつかみますngの側面。このSiN膜側が常に上を向くようにマイクロチップを処理します。
注：上側の脆弱なのSiN膜に触れないようにしてください。また、マイクロチップ上またはそれ以降の漏れに常駐しているシリコン粒子に起因する問題が発生する可能性があり、そのシャープなエッジを、割れ回避するために、マイクロチップの取り扱いに注意してください。
注：粘着性表面からマイクロチップを除去するための手続きのための訓練は（安い）ダミーマイクロチップ上で行うことができます。 - シャーレ内のクリーンルーム組織上にマイクロチップを置きます。皿を閉じ、ヒュームフードに転送します。
注：アセトンを伴う手順は、化学物質の安全性のためのヒュームフード内で行われています。 - 2 120 mLのガラスビーカーしてください。それらをきれいにするためにエタノールで1アセトンを入れたビーカーや他のを洗い流します。エタノールの40-60 mLでアセトンの40から60 mLを持つ最初の1および他を記入してください。
注：これは、プロトコルのこのステップのためにも、HPLCグレードの液体を使用することが重要です。 - 転送保護レジスト層を除去するためにアセトンを入れたビーカーにマイクロチップ。優しく効果的にマイクロチップを洗浄するために手でビーカーを移動するが、上下逆さまにマイクロチップをオンにしないように注意してください- 図2を参照してください。
- 2分後、マイクロチップを削除し、すぐにエタノールをビーカーに移します。ゆっくりレジスト層の任意の残留物を除去するために2分間エタノールで手でビーカーを移動します。アルミホイルでビーカーを覆い、層流ワークベンチに転送します。
注：マイクロチップは、デブリの堆積を回避するために、転送中に乾燥させないでください。 - ビーカーからマイクロチップを取り外し、新しいクリーンルーム組織上に配置します。数分のためにそれらが乾燥してみましょうとペトリ皿の光顕微鏡のスライドガラス上にマイクロチップを転送します。
注：湿ったマイクロチップは、簡単に、周りのフリップ逆さまに回す、または解放されたときにピンセットに固執することができます。これは、PRESによって回避することができます濾紙上にそっとマイクロチップを歌い、水平方向に離れてピンセットを引っ張ります。 - ペトリ皿を閉じ、プラズマクリーナーにマイクロチップを移します。
- プラズマクリーナーにマイクロチップを用いてガラススライドを置きます。親水性窒化シリコン膜の表面をレンダリングすると、炭化水素を除去するために5分間の洗浄プログラムを実行します。
注：私たちのプラズマクリーナーに適用される適当な設定は次のとおりです。70トル、O 2 11.5 SCCMとArのための35.0 SCCM、50 W前方無線周波数（RF）ターゲット、5 WのRF範囲のガス流量、およびmaxはRFを反映しています。表面電荷を誘導することができる任意のプラズマが好適です。 - 、ペトリ皿に戻ってマイクロチップにスライドガラスを入れて蓋を閉じ、光学顕微鏡に転送します。
- 可能な膜が破裂するか、残りの汚れ粒子のための光学顕微鏡下でマイクロチップを調べます。ウィンドウ領域で特別な注意を払ってくださいとARを示す小さなスポットをチェック膜のupture。損傷した膜を有するマイクロチップを閉じます。
- ペトリ皿を閉じて、層流ワークベンチに保管してください。
マイクロチップ上の試料の調製
- 〜3 Mの濃度で30nmの直径、クエン酸で安定化AuNPsを含むストック溶液の少量を混合することによって水性AuNP溶液（クエン酸安定化された）準備
- 液滴アプリケーション/サンプルの堆積のための輸送箱にきれいな、粘着性表面にマイクロチップを置きます。
- たてプラズマ洗浄マイクロチップののSiN膜側の試料溶液の液滴（1-2μL）を配置し（スペーサーなしでマイクロチップを使用）し、層流ワークベンチ内の溶液を乾燥させます。
注：この手順は、このSiN膜のAuNPsの濃度を増加させるために繰り返すことができます。 - 塩および/または界面活性剤を除去するためのマイクロチップに脱イオン水1μLを適用します。 30秒後、慎重にろ紙で水の液滴を除去します。マイクロチップは、層流ワークベンチで空気中で乾燥させます。
注：AuNPsの十分な数は、マイクロチップに付着しているだろうし、もう水で洗い流されることはありません。 - SiNからは、時間の経過とともにその親水性に表面特性を失うような液体が実験中に異なる動作をするおそれがある、4時間以内に調製した試料のマイクロチップを使用してください。注：詳細については、議論のセクションを参照してください。
- マイクロチップの保管と転送のために閉じた輸送ボックスを使用します。
液体フローTEMホルダーの調製
- 液体流TEMホルダーのクリーニング
- 超音波浴中のアセトンとエタノールを用いて真空部品と接触して、ワークベンチに置かれ、新しいアルミホイルの一片が提供する埃のない表面上に配置されますすべてのツール（ピンセット、スクリュードライバー）を清掃してください。手袋での作業液体流TEMホルダの汚染を回避します。
注：一つは、彼らが真空部品との仕事のためにきれいになっていることを確認している場合ツールは広範囲に洗浄する必要はありません。一つの真空部品に触れることなく機器を扱うことができる場合、手袋を回避することができます。 - 液室を含む保持具の先端を観察することができるように双眼光学顕微鏡下での液体の流れのTEMホルダーを置き。 図3を参照してください。
- ホルダー先端の蓋を外し、ダストフリーの上に置きます。
注：チタン蓋がピンセットのような硬い材料によって引き起こされる傷に敏感です。敏感な材料のためのポリマー被覆ピンセットを使用することをお勧めします。 - 純水の少なくとも1-2 mLの（HPLCグレード）を準備します。
注：1のHPLCグレードの液体を使用しない場合、使用される液体は、おそらくフローシステムの目詰まりにつながる可能性微粒子が含まれていないことを確認することをお勧めします。 FILTマイクロポアフィルターで、必要に応じて小胞体の液体。 - 純水0.5 mLで全体フローシステムをフラッシュするためにガラスシリンジ（1 ml）を使用してください。マイクロ流体シリンジポンプシステムを使用することをお勧めします。液体細胞区画に排出される液体を除去するために、ピペットおよび/またはろ紙を使用します。液体の流れのためのすべてのチューブをテストします。ろ紙および/またはピペットを用いて、その後ホルダーチップを乾燥させます。
- ホルダーの先端が清潔で乾燥していることを確認するために、光学顕微鏡を使用してください。必要に応じて、乾燥した溶液から取り残されている可能性があります任意の固体残留物を除去するために水またはエタノールでホルダーの先端を洗います。同様にほこりや繊維の残りの部分を削除します。慎重に、ピンセットでこれらの作品を削除することにより、チタン表面を傷つけ避けます。また、Oリング溝の内側にチェックして、クリーンルーム組織の小片と液体の残りを除去します。
注：所有者は、この手順できれいにならない場合、それは推奨されますホルダーからヒントを削除し、超音波浴を用いて2分間、別の2分間、エタノール、アセトン中、それをきれいにします。 - 光学顕微鏡下で先端部のさらなるすべての部品（Oリング、蓋、およびネジ）を点検し、ほこりを取り除き、繊維、 等 ...
注：時々、ネジやSiマイクロチップから発生する小片も同様に削除する必要があります。必要であれば、簡単にHPLCグレードのエタノールで真空部品を清掃してください。先端のために説明したように蓋とネジは、超音波を用いて洗浄することができます。それは彼らの真空気密性を減少させる、時間をかけてOリングが脆く行うことができるように、エタノールで頻繁にOリングを配置しないでください。システムは、真空グリースなしで操作されるが、密封問題が発生した場合、真空グリースを使用することができます。 - ホルダーのそれぞれの溝にOリングを挿入し、彼らがフィットし、溝のいずれかの側に突出していないことを確認してください。
- サンプルローディングまでほこりから自由液流TEMホルダーを保管してください（ 例：。）アルミホイルで覆うことにより。
- 超音波浴中のアセトンとエタノールを用いて真空部品と接触して、ワークベンチに置かれ、新しいアルミホイルの一片が提供する埃のない表面上に配置されますすべてのツール（ピンセット、スクリュードライバー）を清掃してください。手袋での作業液体流TEMホルダの汚染を回避します。
- 液体流TEMホルダを組み立てます
注：次の手順では、STEMのための最適な向きで試料ホルダーにマイクロチップのロード手順を説明します。この構成では、サンプルとベースのマイクロチップは、一度顕微鏡に移し、上部マイクロチップになります。 図4を参照してください。 TEMのために、最も高い空間分解能が下方走行電子ビームに対して液晶セルの底部で得られます。このように、マイクロチップは、他の方法で回避を搭載することになります。- 長辺上のサンプルマイクロチップをつかむと、液体流TEMホルダーの先端にスロット（ポケット）内に配置するために湾曲したピンセットを使用してください。上向きのSiN側にしてください。双眼光学顕微鏡を用いて、スロットにマイクロチップの正しい配置を確認してください。
注：マイクロチップ下のOリングが正しく配置されていない場合は、マイクロチップがfを突出してもよいですスロットをROM。 - マイクロピペットを用いて試料のマイクロチップ上の実験のために濾過された液体の0.3μLの液滴を配置します。必要であれば、液滴の毛細管力は、そのポケットからマイクロチップを引くことができるように、ピンセットで所定の位置にマイクロチップを固定します。
- 第二のマイクロチップ（スペーサ層との1）を取るために逆さまに曲がったピンセットを使用してください。慎重に逆さまにマイクロチップを回します。スロット内の基地マイクロチップ上にスペーサーマイクロチップを置きます。
注：この手順は、サンプルのマイクロチップ上での液滴の乾燥を避けるために十分に迅速に行われる必要があります。 - 試料ホルダーの先端下の光反射材の一部を移動させながら、両眼光学顕微鏡を使用して正しい配置を点検します。どちらのマイクロチップは、正確にSiN窓の最良の重複を達成するために平行に整列されなければなりません。
注：ウィンドウが重ならない場合には、マイクロチップは、先端に一側に押すことによって再配置することができますこのSiN膜は容易に損傷することができますようにピンセットは、しかし、あまりにも多くのマイクロチップを移動せずに済みます。いくつかのマイクロチップは、交差した構成（1マイクロチップのウィンドウは、他のマイクロチップの窓に垂直である）が付いています。この構成は2マイクロチップの位置合わせを容易にし、まだまた、電子顕微鏡で視野を減少させます。 - ピンセットで試料室の蓋の正面側を取り、逆さまにそれを回します。マイクロチップに触れることなく、先端に蓋の裏側に配置します。ゆっくりと蓋がもっぱらピンセットの下の枝にかかっているようにピンセットを開きます。それは2マイクロチップ上に載るまで、慎重に蓋を下げます。ピンセットを削除します。
- 両方のマイクロチップの窓の配置を再確認してください。必要に応じて、ふたを取り外しマイクロチップの位置を調整し、再び蓋を配置。
- ネジを配置し、それらの通常の場所でそれらを修正。二つのウィンドウの配置を確認してください。私F必要に応じて、再びネジを取り外し、マイクロチップを調整します。
注：これは損傷を与える可能性があるとして、きつくネジを固定しないでください。ネジだけ締め時の真空シールが達成されます。 - 4μL/分の流速を使用して、システムを通る液体の流れを開始することによってシールを確認します。全く漏れが先端の両側に観察されていない場合、これは、真空気密性の良い指標です。
- 真空ポンプステーションにホルダーを移し、真空気密性を確認してください。真空レベルは、ポンプの5分以内に少なくとも10 -5ミリバールに到達する必要があります。
注：これは、使用する前に、ダミーホルダーとポンプステーションをテストすることをお勧めします。 - 塵を集めることを防止するために、その筐体に電子顕微鏡にホルダーを転送します。
注：各商業ホルダーは、エンクロージャが付属しています。
- 長辺上のサンプルマイクロチップをつかむと、液体流TEMホルダーの先端にスロット（ポケット）内に配置するために湾曲したピンセットを使用してください。上向きのSiN側にしてください。双眼光学顕微鏡を用いて、スロットにマイクロチップの正しい配置を確認してください。
液体中の試料の3 STEM
- STEM用の電子顕微鏡を調整します 注：このプロトコルに記載の電子顕微鏡の操作は、ユーザーマニュアルに記載されています標準的な手順に基づいています。プロトコルは、液体標本上のデータ取得のための標準的な手順を超えて必要な詳細を説明しています。
- 整列STEMモードで顕微鏡を開始します。試料ホルダーで、AuNPsと炭素薄膜からなる試験サンプルを挿入します。次のようにSTEM顕微鏡の設定を調整します：4Cのスポットサイズと30μmの対物絞りを選択することにより、20 mrad以下に0.18 nAの電子ビームの収束半角度にプローブ電流を設定します。 8センチメートルカメラの長さを選択します。
- ADF検出器が挿入されている間、蛍光スクリーンで測定された示された電流密度をメモします。試料ホルダーを外します。
注：この電流値は液体の厚さを推定するために、後に必要とされています。 - 純水で液体の流れを開始します。 2の流れを超えないようにしてくださいμL/分。
- 電子顕微鏡で液体流TEMホルダーを挿入し、避難を開始します。予備真空室の真空指示や避難の期間の両方をチェックしてください。真空レベルが標準であり、ポンプ手順の持続時間が2倍（約1分）、通常の排気時間を超えていない場合は、ホルダーを挿入します。
- 主試料室の真空度は、その開口部を可能な範囲内にあるときにビームバルブを開きます。 ADFボタンを押して、ADF検出器を挿入します。
注：このプロトコルは、電子顕微鏡の蛍光面の上方に位置するADF検出器を指します。 - 512×512ピクセルの画像サイズ、2マイクロ秒の画素滞留時間、20,000の倍率を使用して、連続画像取得モードでの顕微鏡を設定します。 x、y方向にステージを翻訳することによりSiNからウィンドウを検索します。
注：マイクロチップは、検出に向けてサンプルを通過する任意の電子をブロックしますまたは;信号は罪の場所にのみ表示されます。 図5を参照してください。時には、蛍光画面を表示することにより、SiNからウィンドウを見つけることが容易です。 - ウィンドウが発見されると、ウィンドウのエッジが見えるようになるように（それぞれのノブを使用して）、コントラストと明るさ設定を調整します。試料ステージのx軸とy方向への平行移動のボタンを押すことによって、視野の中央に向かっエッジを移動します。対物レンズのリセットボタンを押してください。
注：明るさが液体で強い散乱のアカウントの真空試料と比較して大幅に低減されなければなりません。 - 粗試料ステージの垂直位置（Z-翻訳）を調節することにより、SiNからウィンドウの端に鋭い角を中心に進んでください。サンプル位置は5度ステージを回転させ、戻ってそれを回転させることにより、ユーセントリックの高さであることを確認します。サンプルとSiNウィンドウの隅の特長は、低倍率でシフトするべきではありません。
- 再度、表示領域の中央にウィンドウの端を配置するために、必要に応じて垂直方向の位置を設定し直してください。ソフトウェアの保存ボタンを使用して、ステージの位置を格納します。
- ゴミや高コントラスト（ 例えば、AuNPs）の他のオブジェクトの小片は、x、y方向にステージを変換することにより存在している位置に移動します。すべてのオブジェクトにフォーカスがシャープに表示されるように、対物レンズの焦点を調整します。
- 液体保持部を通って、ADF検出器の開口部を透過した電流を示すオペレーティングソフトウェアを介して可視蛍光面で測定した電流密度、をメモします。式1は、液体の厚さが決定されているとは3μmを超えない場合にのみ進んで使用して液晶セルの厚さを計算します。
14を使用して試料とし、なしで測定された電流密度の比率により決定することができます
式（1）
T のSiNアモルファスシリコン窒化膜およびt 水水層の厚さの厚さを有します。平均自由行程は、35ミリラジアン14の検出器開口半角をリットル罪 =のSiNの0.79ミクロン、=とリットルの 水の水= 3.0μmの量を長さ。 - 慎重に気泡が存在しないことを確実にするために低い倍率で液体を観察します。気泡は、連続的な液体の流れを使用して、現在よりも低い0.5 NAがプローブによって防止することができます。
- 少なくとも20 AuNPsヘクタールを含む領域までのx、y方向のステージを翻訳sが発見されて。 1,024×1024ピクセルまで画像サイズ、19マイクロ秒の画素滞留時間、及び400,000の倍率を設定します。取得ボタンを押して、このSiN膜に付着したAuNPsの画像を取得します。
注：画像は（ 図6を参照）AuNPsが強いコントラストとシャープなエッジを持つ表示されている得られた後は、1実験が正しく設定されていることを確認することができます。予期しない問題が発生した場合には、実験を進めたが、原因を解決することを確認していません。
- AuNPsの解散のSTEM
- 顕微鏡から液体流TEMホルダーを外し、液体の流れを止めます。
- ガラスシリンジ内のHPLCグレードの水に塩化ナトリウムの0.1 Mの溶液の少なくとも1ミリリットルを準備します。
- 20μL/分の速度にフローシステムを調整し、生理食塩水の0.3 mLで全体フローシステムをフラッシュします。上に排出される液体を収集するために、濾紙を使用チューブのもう一方の端。その後、2μL/ minにフローシステムを再調整します。
- 双眼光顕微鏡を用いたSiNウィンドウの整合性を確認してください。漏れが観察されない場合、顕微鏡に液体流TEMホルダを挿入。
- プレ真空チャンバーの真空指示や避難の期間を確認してください。真空レベルが標準であり、ポンプ手順の持続時間が2倍（約1分）、通常の排気時間を超えていない場合は、ホルダーを挿入します
- 保存されたステージの位置を使用してバックその前の位置に顕微鏡のステージの背面に移動します。 512×512ピクセルの画像サイズ、2マイクロ秒の画素滞留時間、および20,000の倍率を使用して、連続画像取得モードでの顕微鏡を設定します。ステップ3.1.7-3.1.9で説明したように、コントラスト、明るさ、フォーカス、ユーセントリック高さを調整します。
- x、y方向にステージを翻訳することにより、目的の場所を検索します。画像サイズを設定します。1,024×1024ピクセル、2マイクロ秒の画素滞留時間、及び500,000拡大します。以前の画像が記録された後、手動で取得ボタンを押すことによってSTEMの一連の画像を記録します。
注：AuNPsとすぐに、電子ビームを試料上で走査されるように溶解し始めます。照射領域外の粒子が影響を受けないため、直後に観察することができます。タイムスタンプは、画像ヘッダに格納されています。映画の中に一連の画像を自動的に収集するためのソフトウエアを使用することも可能です。
- 実験後TEMホルダーを分解して清掃
- 液相TEM実験が完了すると、ホルダは、電子顕微鏡から退避されると、将来の実験に影響を及ぼす可能性の固体粒子または残りの塩を除去するために、チューブ、液室、およびそのコンポーネントを掃除。
- それはまだ固定されているように、やや後方のネジを緩めそのスロットに蓋を容易に除去することができます。フロントネジを緩め、それを削除し、ほこりのない環境に配置します。
- 蓋を取り外し、保管のためホコリのない環境に配置します。
- ポケットから2マイクロチップを取り外します。慎重に水または実験の残りの溶液でそれらを浸漬することによって、それらを分離。上方のSiN膜側とティッシュペーパーにマイクロチップを置き、さらなる分析のために空気中でそれらを乾燥させてください。
- Oリングを取り外し、HPLCグレードの水を用いてそれぞれの溝を清掃してください。ほこりのない環境でOリングを保管してください。
- HPLCグレードの水5mLで全てのチューブ（入力および出力）、それぞれをフラッシュするガラスシリンジ（5 ml）を使用してください。 TEMホルダー先端の下方に配置された小さなビーカーに液体を収集します。フラッシュした後、液体区画から残りの液体を除去するために、ピペットおよび/またはろ紙を使用しています。
- TEMホルダーの先端を点検し、シリコンマイクロの壊れたエッジのような残留物を除去チップ、繊維、またはほこり。塩がまだ表示されている場合は、クリーニング手順を繰り返してください。その溝にOリングを返します。
- TEMホルダーやほこりのない環境でそのコンポーネントを保管してください。
- 3.2手順の代替：金ナノ粒子を移動させるSTEM
注：別の組立手順を液体中にAuNPsの動きを研究する必要があります。- ステップ1.2を省略します。すぐにステップ2.2でTEMホルダーに入れる前に、シリコンマイクロチップ上AuNPsをロードします。このSiN膜へのAuNPsの強い愛着を回避するために、すべての回での液体層で覆われたサンプルを保管してください。プロトコルの他の工程は同じです。 STEM像の一連のステップ3.2.6で得られます。
式（1） 
図4：液体フローTEMホルダーの組み立て。 （A）番目の液体細胞区画その溝に配置された電子小さいOリング。挿入図は上面図を示しています。 （B）ベースのマイクロチップは、それぞれのソケットに配置されています。挿入図は、マイクロチップは、光の反射から見えるような角度で側面図を示しています。 （CD）溶液の液滴は、マイクロチップに添加されます。カバーマイクロチップの（EG）の配置。液体セルコンパートメントの蓋の（HI）の配置。 2本のネジで蓋の（J）固定。 （K）液体流TEMホルダを組み立て。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：初期ポジショニングとSTEM顕微鏡写真を使用してフォーカシング。このSiNウィンドウを見つけるために（A）は 、ステージは明るいSIGに向かって移動しますNAL。シリコンマイクロチップは、一部の電子が窓の近くを通過するために十分に薄いです。 （B）暗い（以下散乱）のSiN膜窓に明るい現れるいくつかのAuNPsを示すフォーカスされたSiNからウィンドウの端。マイクロチップのエッジは過度の散乱に明るいです。 （C）フォーカシングはこのSiNウィンドウの隅で行われます。画像は下に焦点を当てた、焦点で、かつ過焦点を当てた状況を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Representative Results
液体流TEMホルダは、液体中にAuNPsの挙動を研究するために使用しました。 AuNPsを安定純水でのSiN膜上に固定化し、液相STEM（ 図6）を使用して、ナノスケールの分解能で画像化しました。優れたコントラストが強く散乱金で得られました。それが挿入された液体流TEMホルダーで8 PA / cm 2でに達しながら、乾燥試験サンプルについて測定し、蛍光体スクリーン上の電流密度は、20 PA / cm 2でした。 200nmのスペーサの厚さに基づいて予想されたものよりもはるかに大きい式1、T 水 = 2.4±0.5μmで、使用。それにもかかわらず、厚さがナノメートルの空間分解能でAuNPsのイメージングのための大きすぎません。液体厚さが原因でマイクロチップ上に存在するのSiN膜、マイクロチップの非平坦性、および破片の膨らみにスペーサーによって設定さ200nmよりも厚かったです。
- 水溶液 、H•、H +、•OH E）と電子ビームの相互作用から生じる反応性放射線分解生成物があるが、純水の場合= "1">ページをther.within、AuNPsは、16を撮像する時にその形状を維持します水はAuNPs 15の形状の変化につながる、単一の金原子を酸化することができます。しかし、液体のフローシステムは、第2の実験において、塩化物イオンを導入するために使用された場合、AuNPsの安定性が変化しました。 -塩化物イオンはtetrachloroaureatの形態のAuCl 4中の酸化金原子を安定化することが可能です。 図7は AuNPsがゆっくりと16以前に報告された結果と類似しSTEMイメージングタイムラプスシリーズ、中に溶解していることを示しています。使用される電子線量率のためには、30nmのサイズのAuNPsを溶解させ〜300秒を要しました。
ウォートでAuNPsの動き rは第三の実験（ 図8）で検討しました。実験の前に、液体流TEMホルダは、塩の痕跡を除去するために洗浄しました。最初の実験とは異なり、代替サンプル調製法は、このSiN膜14にAuNPsの弱い付着を達成するために使用しました。この実験では、AuNP溶液は、シリコンマイクロチップ上に配置し、溶液を乾燥させることなく、液体流TEMホルダに組み付け。このようにして、AuNPsは容易に使用する線量率での撮像時にSiN膜から剥離します。残りのAuNPsが罪のウィンドウに近接して、視野内のままAuNPsのいくつかは、バルク溶液に離れて視界から移動しました。これらAuNPsの動きが観察され、そして最終的にはそれらが凝集しました。しばらくして、これらの凝集物はまた、このSiN膜から剥離し、視野の外と溶液中に移動しました。
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図6：純水層の上部に直径AuNPs 30nmの走査型透過電子顕微鏡（STEM）顕微鏡写真。示す画像は、原画像の選択された領域です。画像サイズは、ピクセル滞留時間は19マイクロ秒であり、1,024×1024ピクセルであり、ピクセルサイズは0.73 nmであった、そして倍率400,000Xました。 /nm² -電子線量は、このように7.1×10 4電子ました。液体の厚さが2.4ミクロンに達するように計算したように、蛍光体スクリーン上の測定された電流密度は、8 PA / cm 2でした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7：タイムラプスシリーズ生理食塩水でAuNPsのSTEM顕微鏡写真の。 （AD）画像は30秒間隔でSTEM像のタイムラプスシリーズから抽出しました。 AuNPs徐々に塩化物イオンの存在の結果として、液体中に溶解します。ピクセル滞留時間は2マイクロ秒であったタイムラプスシリーズのフレーム時間は1.75秒であった、画素サイズが0.44 nmであった、と倍率は500,000Xました。 /nm² -画像あたりの電子線量は1.2×10 4電子ました。液体の厚さは2.4μmでした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図8：純水での移動AuNPsのSTEM顕微鏡写真。いくつかは、矢印で選択されるのAuNPs、と（A）のSiN膜。 （B）モーショントラック選択AuNPs（Aを参照）。一部のAuNPsは、撮影の時間の間に視界から離れます。残りのAuNPsは、このSiN膜に沿って横方向に移動し、凝集を開始します。フレーム時間は0.52秒であった、1マイクロ秒をされた重要なクラスタサイズに達すると、彼らは膜から派遣とview.The画素滞留時間のフィールドから離れる、画素サイズが1.8 nmであった、と倍率は120,000Xました。画像あたりの電子線量は3.5×10 2電子あった- /nm²と液体の厚さは2.4μmでした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
記載されているプロトコルは、動的プロセスの観察を含め、液体中にAuNPsのSTEMを可能にします。ホルダーの組み立てが容易に習得できる技術です。液体流TEMホルダーで作業する場合しかし、いくつかの側面を考慮しなければなりません。例えば、Oリング上のSiマイクロチップや大きな粒子の壊れたエッジは、液晶セルの漏れが生じることがあります。一方、大きな粒子（> 200nmで、 例えば、埃やSiの破片）のSiN膜上には、低イメージング造影または低空間分解能につながる、液晶セルの厚さが増加をもたらす可能性があっても発生することがありこのSiN窓が破壊します。重要なことには、塩または他の化学物質の残留物は、望ましくない方法での実験の結果に影響を及ぼし得ます。したがって、試料調製及びホルダアセンブリの異なるステップを慎重かつ清潔で埃のない環境で行われることが重要です。
液体CEの厚さllが達成可能な解像度だけでなく、得られる画像17のコントラストを決定します。この厚さは、2つのSiマイクロチップの上に配置さのスペーサーを介して調整することができます。試料の寸法に応じて、液晶セルの異なる厚さを実現することができます。全体の真核細胞は、最大5ミクロンの大きなスペーサを必要としながら、AuNPsの研究のために、小さいスペーサー（200-500 nm）を使用することが可能です。液晶セルの厚さは、さらに液晶セルと周囲の真空との圧力差から生じたSiN膜の窓の膨らみによって影響されます。この効果は大きいのSiN膜の窓でより顕著になります。したがって、液晶セルの厚さを最小限にするためには、小のSiN膜の窓を使用することが推奨されます。ケースでは、2つの小さな窓の間の重複を見つけることは困難であり、それらは、異なるベースのマイクロチップを用いて、交差した構成で組み立てることができます。代替構成のラーグエリー膨らみ防止し、試料ローディングに関する柱19が、これらの展示欠点でサポートされているモノリシックマイクロチップ18または膜の窓から構成されています。現在の技術の最も困難な側面の一つは、液体の厚さの正確な制御の欠如です。ここに示されたように、多くの場合、液体は、使用されるスペーサの寸法から予想されるものよりもはるかに厚いです。いくつかのグループは、閉じた液室4、20、21、22を用います。これらのシステムは、液体の厚さは、液体中に気泡を誘導することによって減少させることができるように、空間分解能に関するいくつかの利点を有します。また、このSiN窓は薄い液体層につながる、崩壊するように強制することができます。また、はるかに薄い液体が得られる第三に、他のシンナーのウィンドウの筐体が存在する（ 例えば、グラフェン）23、このプロトコルに記載されているシステムで可能なものより。しかし、これらのシステム内の液体を流すことができません。
任意の高解像度顕微鏡技術に関しては、実験的な側面の数が考慮されなければなりません。最も重要な側面は、液体又は試料と電子ビームとの相互作用です。多くの固体試料24のために達成可能空間分解能を制限する放射線損傷に加えて、液体試料も電子線発生放射線分解産物15、25によって影響されます。これらの製品は、実験に影響を与える可能性があるため、慎重なデータの解釈および実験設計は26不可欠です。顕微鏡の設定は、特定の研究の目的に応じて選択すべきです。 ADF STEMは、WHIの液体セルのより大きな厚さの高い原子番号（Z）のイメージングナノ粒子のためのより強力ですルTEMは、低Z材料に良好なコントラストを与え、典型的には高速ですが、薄い液体層3を必要とします 。代わりにADF検出器を使用するBFステムは厚い層27における低Z材料を画像化するのに有利であるため、明視野（BF）検出器は、時々 、画像を液晶セルに使用されます。液晶セルの厚さの増加に伴って、より多くの電流が必要です。しかし、これはまた、放射線分解生成物の濃度を増加させ、放射線損傷を増加させます。また、コントラストの反転は非常に厚い液体（水用> 10μm）のためのADF検出器で観測されることに留意すべきです。
液体の条件は、顕微鏡からホルダーを除去し、サンプルと液体の両方を交換することによって、私たちの実験の間で変更されました。塩濃度を変化させることに加えて、 例えば、一つは、（別の液体中を流れることにより、液体の他の特性を変更することが容易に可能です特定のpHは16を設定するために緩衝液を使用するか、または有機溶液または他の添加剤）を導入することができます。ホルダがまだマイクロ流体システムを通して液体を流すことによって、顕微鏡に挿入されている間に液体を変更することも可能です。しかしながら、この場合には、試料の変化で液体を指し、その時点では不明です。電極を支持するマイクロチップが使用可能であることにも注目すべきであるので、ナノスケールの電気化学実験は、28を行うことができます。
この研究の目的は、水にAuNPsに限定されず、試験片の多種多様なシリカ、酸化チタン、およびポリマーを含む、上述のプロトコルを使用して研究することができます。オブジェクトの動きは、取得中に画像に取り込むことが速すぎる場合には、粘度は、50％グリセロール及び50％水の混合物を使用して一桁低減することができます。
上記の点から、多くの利点は、可能性が、また欠点が明らかになる。 1）任意の実験は、試料全体（被測定物、液体、及びSiN膜）を用いて電子ビームの動的相互作用の影響を受けている;：液相STEMで作業する場合、考慮すべき最も重要な欠点があること2）試料の取り扱いが面倒であり、サンプルまたはマイクロチップは、いくつかのマイクロメートルサイズの粒子を含むため、薄い液体層を達成することはしばしば困難です。 3）液体の厚さは、通常、スペーサーによって設定された意図された厚さから大きく異なります。そして4）空間分解能とコントラストが強く、液体の厚さと観察し、液体中の物体の変化密度の違いに依存します。
現在、十分な方法は、ナノメートルの空間分解能で液体内のオブジェクトの顕微鏡検査のために存在します。アモルファス氷中の電子顕微鏡は、強力な技術で29ですしかし、関与する実験手順は、すべての実験は、氷のサンプルの調製を可能にし、時間分解実験は不可能であり、繊細です。 X線顕微鏡30、31は、原理的には使用することができるが、それは限られた空間分解能を有し、実験室で広く利用可能ではありません。液体中の原子間力顕微鏡は、確立されたが、表面技術、32、33、34、35であるれています。光学顕微鏡は、十分な空間分解能を示しません。現時点では、液体中の電子顕微鏡は、液体中のナノスケールのオブジェクトおよびプロセスの直接顕微鏡検査のための最も強力な技術です。
液相TEMとSTEMはまだルーチン分析技術ではありませんが、まだ開発されています。考慮すべきパラメータの数は相当であり、ofteあります実験結果を再現するn個難しいです。調査中の効果は、電子ビームの結果として生じるプロセスに絡み合っているため、また、定量的なデータを得ることが困難です。ここで説明するプロトコルは、それによって、実験のすべての関連するベース側面を占め、実験プロトコルを標準化することを目指しています。私たちは、このプロトコルは、この新興分野での実験作業のより良い再現性につながることを願っています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular light microscope | Leica | M60 CMO | |
| Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector | JEOL | ARM200F | |
| Liquid flow TEM specimen holder | DENS Solutions | Ocean | |
| Microfluidic syringe pump | Harvard Scientific | PicoPlus | |
| Plasma cleaner | Gatan | Solarus950 | |
| Chemicals | |||
| Acetone, Rotisolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
| Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
| Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
| Materials | |||
| Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Microfluidic peek tubing | Upchurch Scientific | 1570 | |
| Plastic Replaceable tips Tweezers | |||
| (Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips) | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
| Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
| Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
| Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR) | Hamilton | 81323 | |
| Clean room tissue Sontara Micropure AP (224 x 224mm) | DuPont | Sontara MicroPure |
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