Summary
Denne protokollen beskriver drift av en væskestrøm prøveholder for skanning av transmisjonselektronmikroskopi av AuNPs i vann, som anvendes for observasjon av nanoskala dynamiske prosesser.
Abstract
Prøver fullt innebygd i væske kan studeres på et nanonivå romlig oppløsning med Scanning transmisjonselektronmikroskopi (STEM) ved hjelp av en mikrofluidkammer montert i prøveholder for transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og STEM. Den microfluidic systemet består av to silisiummikrobrikker som støtter tynne silisiumnitrid (SiN) membran vinduer. Denne artikkelen beskriver de grunnleggende trinnene for utvalg lasting og datainnsamling. Viktigst av alt er å sikre at væskerommet er korrekt montert, og dermed gi et tynt væskesjikt, og en vakuumtetning. Denne protokollen innbefatter også en rekke tester som er nødvendige for å utføre under prøve lasting for å sikre riktig montering. Når prøven er lastet i elektronmikroskop, må væsken tykkelse skal måles. Uriktig montering kan resultere i en altfor tykk væske, mens en altfor tynn væske kan indikere fravær av væske, for eksempel når en boble blir dannet. Til slutt, protokollenforklarer hvordan bildene er tatt og hvordan dynamiske prosesser kan studeres. En prøve inneholdende AuNPs avbildes både i rent vann og i saltvann.
Introduction
Konvensjonell Scanning transmisjonselektronmikroskopi (STEM) er begrenset av omfanget av prøver som er egnet for analyse, spesielt de tørre og faste stoffer som er egnet for plassering i et høyvakuum. Men mange vitenskapelige og tekniske spørsmålene gjelder nanoskala materialer og prosesser i flytende miljø. Prøver fullt innebygd i væske kan nå bli studert med STEM bruker et begrep som innebærer en mikrofluidkammer montert i prøveholder for transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og STEM en. Denne nyutviklede teknikken har blitt stadig mer populært, da det gir ny innsikt i viktige prosesser i ulike forskningstema, blant annet vekst, oppløsning, og aggregering prosesser av nanopartikler 2, 3, 4, 5, 6. Ikke bare metaller, men også biominerals 7 og biologiske systemer kan studeres 8, 9, 10, 11. Prøven lasting og bildeopptak for væskefase STEM er annerledes enn for STEM av tørre prøver og innebærer en protokoll som krever dedikert trening.
Den mikrofluidsystem består av to silisiummikrobrikker bære silisiumnitrid (SiN) membran vinduer transparente for elektronstrålen ved 200 keV energi 12 (se figur 1A). Detaljer om dimensjonene og i håndteringen av disse mikrobrikker kan finnes andre steder 12, 13. Prøven inneholder vanligvis nanoskala stedene. I denne artikkelen observerte vi gull nanopartikler (AuNPs). De AuNPs er immobilisert på toppen vinduet (med hensyn til en nedover tur elektronstråler) eller flyte i væskerid. Nanoskala romlig oppløsning i STEM oppnås ved å skanne elektronstråle over AuNPs og samle overfør spredte elektroner som bruker Ring Mørk Field (ADF) detektor 9. De to mikrobrikker er plassert i en liten spalte i spissen av væskestrømmen TEM holder en (holderen kan brukes i både STEM og TEM, men er henvist til som den TEM holderen). En av de mikrobrikker inneholder et avstandsstykke, slik at et flytende kammer dannes mellom mikrobrikker. O-ringer på begge sider av de to mikrobrikker tilveiebringe vakuum forsegling av væskerommet 13 (se figur 1B).
Målet med denne artikkelen er å demonstrere grunnleggende trinnene for utvalg lasting og datainnsamling, slik at interesserte brukere kan finne enkel tilgang til denne nye nye teknikken. Et system er tilgjengelig fra et bestemt selskap benyttes, men protokollen er også gyldig for systemer av andre selskaper. Teknikken ermer kompleks enn konvensjonell TEM og STEM, og en rekke praktiske aspekter må vurderes når du arbeider med en væske holder system 13. Viktigst av alt er å sikre at væskerommet er korrekt montert, og dermed gi et tynt væskesjikt, og en vakuumtetning. Derfor er det meget viktig å arbeide en ren, og for å hindre dannelsen av støv under fremstillingen og sammenstillingen av væskestrømmen TEM holderen. Spesielt O-ringene og de to silisiummicrochips må være fri for urenheter. Selv små partikler av støv på den ene av de mikrobrikker kan forårsake alvorlig øke tykkelsen av den sammenstilte cellen, noe som kan hindre oppnåelsen av en nyttig romlig oppløsning. Et vakuum segl er viktig slik at ingen forurensning eller skade vil bli liggende i elektronmikroskop etter forsøket. Denne protokollen beskriver lasting fremgangsmåten og flere nødvendige tester. Driften av elektronmikroskopet er grei, but det krever noen ekstra skritt i forhold til mikroskopi av faste prøver. Med økende væske tykkelser, er flere elektroner absorberes og spres av væsken; en måling av væske tykkelse er viktig. Til slutt, forklarer den protokoll hvor bildene blir tatt og hvordan dynamisk prosesser kan studeres.
Figur 1: Liquid Flow Cell for Scanning transmisjonselektronmikroskopi (STEM). (A) Skjematisk illustrasjon av den sammenstilte væske cellen. To silisium mikrobrikker med silisiumnitrid (SiN) membran vinduer er plassert mellom to O-ringer. Væsken er innelukket mellom de SiN membranen, og blir således skilt fra vakuumet i elektronmikroskop. En fokusert elektronstråle skanner over prøven. Kontrast oppnås fra spredte elektroner. Gull nanopartikler (AuNPs) er immobilisert inne i væsken på SiN membranen, men kan også bevege seg ivæske. (B) Skjematisk sideriss tverrsnitt av stabelen av to mikrobrikker med O-ringer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Figur 2: Prosedyre for rengjøring av SI Microchips. (A) To begre er fylt med 40-60 ml aceton og etanol hver. (B) Si mikrobrikker er plassert i begerglasset fylt med aceton. Den siden med SiN membranen skal vende oppover. Refleksjonen av de to Si microchips tydelig viser sporet på baksiden av to microchips. (C) Etter 2 minutter blir de Si mikrobrikker overført til den andre begerglass fylt med etanol. Etter nok en 2 min, blir Si microchips overført til et renrom vev for tørking. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Liquid Flow Transmission Electron Microscopy (TEM) Holder utstyr. (A) Væskestrømmen TEM holder med plastrør og en sprøyte for væskestrøm. (B) Den spissen av væskestrømmen TEM holderen tas ut av holderen aksel, lokket av det flytende cellerommet, O-ringer, og to silisiummikrobrikker. Slangen stikker fra venstre side av spissen. (C) Den flytende celledelen som viser en O-ring, i sporet for den mikrobrikke plassering. (D) Forskjellige pinsett på en støvfri overflate (aluminiumsfolie). (E) Et lokk av den flytende cellerommet med sine to O-ringer. (F) To silisium mikrobrikker med SiN membran vinduer. Venstre: prøven mikrobrikke uten spacer; høyre: dekselet mikrobrikke med en 200 um spacer. (G) Et mikrofluidpumpesystem. Klikk her for å se en større versjon av denne Figure.
1. Utarbeidelse av Microchips
1. Rengjøring av mikrobrikker
- Forbered en arbeidsplass med et lavt støvnivå i en laminær luftstrøm hette med en støvpartikkelfilter.
- Rengjør en lysmikroskopi glass lysbilde med en fiberfritt vev og ren etanol for plassering og transport av mikrobrikker. Plasser glass-slide på et renrom vev i en petriskål.
MERK: Unngå å bruke teknisk etanol til alle tider. - Velg 5 basismicrochips (uten mellomrom) for prøveplassering og 5 mikrobrikker med en spacer 200 nm tykk.
MERK: Vinduet dimensjoner er 20 x 400 mikrometer 2 og SiN tykkelse er 50 nm. Siden det ikke er noen toleranse på dimensjonene, er det anbefalt å kontrollere dimensjonene ved hjelp av et lysmikroskop. - Bruk karbon-belagt pinsett for å fjerne mikrobrikker fra oppbevaringsboks og plassere dem på glasset lysbildet. Ta tak i microchips bestemt, men forsiktig på deres long sider. Håndter microchip slik at SiN membranen side er alltid vendt oppover.
MERK: Unngå å berøre den skjøre SiN membran på oversiden. Vær også forsiktig med håndtering av mikrobrikker for å unngå sprekker sine skarpe kanter, noe som kan føre til problemer på grunn av silisiumpartikler bosatt på microchip eller senere lekkasjer.
MERK: Trening for prosedyren for å fjerne mikrobrikker fra den klebrige overflaten kan utføres på (billig) dummy microchips. - Plasser mikrobrikker på et renrom vev i en petriskål. Lukk fatet og overføre den til avtrekkshette.
MERK: Trinnene som involverer aceton er utført i en avtrekkshette for kjemikaliesikkerhet. - Ta to 120 ml begerglass. Skyll ett beger med aceton, og den andre med etanol for å rense dem. Fylle den første med 40-60 ml aceton og den andre med 40-60 ml etanol.
MERK: Det er viktig å bruke HPLC-grade væsker også for dette trinnet i protokollen. - Overførede mikrobrikker i begerglasset med aceton for å fjerne det beskyttende lag motstå. Forsiktig flytte begeret for hånd for å effektivt skylle mikrobrikker, men vær forsiktig så du ikke slå microchips opp ned - se figur 2.
- Etter to minutter, fjerne mikrobrikker og raskt overføre dem til begeret med etanol. Forsiktig bevege begeret for hånd med etanol i 2 min for å fjerne eventuelle rester av resisten lag. Dekk begerglasset med aluminiumsfolie og overføre den til laminær luftstrøm benken.
MERK: Ikke la microchips tørke ut under overføring for å unngå deponering av avfall. - Fjern microchips fra begeret og legg dem på en ny renrom vev. La dem tørke i noen minutter og overføre microchips på lysmikroskop glass lysbilde i petriskål.
MERK: De våte mikrobrikker kan enkelt bla rundt, snu opp ned, eller holde seg til de pinsett når blir utgitt. Dette kan unngås ved å pressynge microchips mykt på filterpapiret og trekke pinsett bort i horisontal retning. - Lukk petriskål og overføre mikrobrikker til plasma renere.
- Plasser glass-slide med microchips inn i plasma renere. Kjøre en 5 min rengjøringsprogram for å gjøre overflaten av silisiumnitrid membranen hydrofil og for å fjerne hydrokarboner.
MERK: Egnet innstillingene som brukes for vår plasma renere er: 70 mTorr, gasstrøm på 11,5 SCCM for O 2 og 35,0 SCCM for Ar, 50 W frem radiofrekvens (RF) mål, 5 W RF-området, og maks reflektert RF. Enhver plasma stand til å indusere en overflateladning er egnet. - Sett glass-slide med microchip tilbake i petriskål, lukker lokket, og overføre den til lysmikroskop.
- Undersøk microchips i henhold til et lysmikroskop for mulige membran brudd eller gjenværende smuss partikler. Vis forsiktighet ved bruk av vindusflater og se etter små flekker indikerer arupture av membranen. Avvis microchips med ødelagte membraner.
- Lukk petriskål og lagre den i laminær luftstrøm benken.
2. Tilberedning av prøven på mikrobrikker
- Fremstille en vandig oppløsning AuNP (citrat stabilisert) ved å blande små mengder av stamløsninger inneholdende 30 nm diameter, citrat-stabilisert AuNPs ved en konsentrasjon på ~ 3 M.
- Plasser mikrobrikker på et rent, klebrig overflate i en transportkasse for dråpe application / sample deponering.
- Plassere en dråpe (1-2 ul) av prøveløsningen på SiN membranen siden av fersk plasma-renset mikrobrikke (bruke en mikrobrikke uten et avstandsstykke) og la oppløsningen tørke i den laminære luftstrømmen arbeidsbenken.
MERK: Denne prosedyren kan gjentas for å øke konsentrasjonen av AuNPs på SiN membran. - Anvende 1 mL deionisert vann til mikrobrikke for fjerning av salt og / eller overflateaktive midler. Etter 30 s, nøyefjerne dråpen vann med filterpapir. La microchips tørke i luft i laminær luftstrøm benken.
MERK: En tilstrekkelig stort antall AuNPs vil ha levd opp til microchip, og vil ikke bli vasket bort i vann lenger. - Bruk de forberedte prøven microchips innen fire timer, som SiN mister sine hydrofile utførte overflateegenskaper over tid, noe som kan føre til at væske til å oppføre seg annerledes under et eksperiment. Merk: Se diskusjonen seksjon for flere detaljer.
- Bruk en lukket transport boks for lagring og overføring av mikrobrikker.
2. Utarbeidelse av LFC TEM Holder
- Rengjøring av væskestrømmen TEM Holder
- Rengjør alle verktøy (pinsett og en skrutrekker) som vil være i kontakt med vakuum deler ved hjelp av aceton og etanol i et ultralydbad og plassere dem på støvfri overflate levert av et stykke av ny aluminiumsfolie plassert på arbeidsbenken. Arbeid med hanskerfor å unngå forurensning av væskestrømmen TEM holderen.
MERK: Verktøyene trenger ikke å være omfattende renses hvis man er sikker på at de er rene for arbeid med vakuumdeler. Hansker kan unngås hvis man er i stand til å håndtere utstyret uten å berøre vakuum deler. - Plasser væskestrømmen TEM holder under kikkerten lysmikroskop på en slik måte at spissen av holderen som inneholder væskekammeret kan observeres. Se figur 3.
- Ta av lokket på holderen tips og plassere den på støvfri overflate.
MERK: titan lokket er følsom for riper forårsaket av hardere materialer som pinsett. Det anbefales å bruke polymer-belagt pinsett for sensitivt materiale. - Tilberede minst 1-2 ml av rent vann (HPLC-kvalitet).
MERK: Hvis man ikke bruker HPLC-grade væske, så det anbefales å sjekke at de væsker som brukes ikke inneholder mikropartikler som kan muligens føre til tresko av flyten system; filter væsken som nødvendig med en mikro-pore filter. - Bruke en glassprøyte (1 ml) for å spyle hele strømningssystemet med 0,5 ml av rent vann. Det anbefales å bruke en mikrofluidsprøytepumpe system. Bruke en pipette og / eller filterpapir for å fjerne den væske som utstøtes i væskecellerommet. Test alle rør for væskestrøm. Tørk holder tuppen etterpå ved hjelp av filterpapir og / eller en pipette.
- Bruk lyset mikroskop for å se at tuppen av holderen er ren og tørr. Om nødvendig, vaskes spissen av holderen med vann eller etanol for å fjerne eventuelle faste rester som kan ha blitt etterlatt av den tørkede løsning. Fjerne biter av støv eller rester av fibre i tillegg. Fjern forsiktig disse brikkene med pinsett, og dermed unngå å skrape titan overflaten. Sjekk også inne i O-ringspor og fjerne rester av væske med en liten bit av renrom vev.
MERK: Dersom innehaveren ikke blir rent med denne prosedyren, så det anbefalesfor å fjerne spissen fra holderen og vaskes i aceton i 2 minutter og i etanol i ytterligere 2 min ved anvendelse av et ultralydbad. - Inspisere alle de videre deler av spissen (o-ringer, lokk, og skruer) under lysmikroskop og fjerne støv, fibre, etc ...
MERK: Av og til må små biter som stammer fra skruene eller Si microchips også fjernes. Hvis det er nødvendig, kort rengjøre vakuum deler med HPLC-grade etanol. Lokket og skruer kan rengjøres ved hjelp av ultralyd, som forklart for tipset. Unngå å plassere O-ringene ofte i etanol, som det kan gjøre O-ringene sprø over tid, minkende deres vakuum tetthet. Systemet blir drevet uten vakuum, fett, men hvis tette problemer oppstår, kan vakuumfett anvendes. - Sett O-ringene i de respektive sporene i holderen, og kontroller at de passer og ikke stikker frem på noen side av sporet.
- Hold væskestrømmen TEM holder fri for støv før prøven lasting (f.eks., Ved å dekke den med aluminiumsfolie).
- Rengjør alle verktøy (pinsett og en skrutrekker) som vil være i kontakt med vakuum deler ved hjelp av aceton og etanol i et ultralydbad og plassere dem på støvfri overflate levert av et stykke av ny aluminiumsfolie plassert på arbeidsbenken. Arbeid med hanskerfor å unngå forurensning av væskestrømmen TEM holderen.
- Montering av væskestrømmen TEM Holder
MERK: Følgende prosedyre beskriver lasting prosedyren av microchips i en prøveholder med optimal orientering for STEM. I denne konfigurasjonen vil basemikrobrikke med prøven være den øvre mikrobrikke en gang overført til mikroskopet. Se figur 4. For TEM, er den høyeste romlig oppløsning erholdt ved bunnen av den flytende celle med hensyn til et nedad-traveelektronstråle. Dermed vil de mikrobrikker monteres den andre veien rundt.- Bruk buet pinsett til å ta prøven microchip på langsiden og legg den i sporet (pocket) i spissen av væskestrømmen TEM holderen. Hold SiN siden vendt oppover. Sjekk riktig plassering av mikrochip i sporet ved hjelp av en kikkert lysmikroskop.
MERK: Hvis O-ringen under mikrobrikke ikke er riktig plassert, kan microchip stikke fROM sporet. - Plassere en dråpe av 0,3 mL av den filtrerte væske for forsøket på prøven mikrobrikke ved hjelp av en mikropipette. Om nødvendig, fikse microchip på plass med pinsett, som de kapillære kreftene i dråpe kan trekke microchip ut av lommen sin.
- Bruk opp ned buet pinsett til å ta den andre mikrobrikke (den med avstandslaget). snu microchip forsiktig opp ned. Plasser avstandsstykket mikrobrikke på basen mikrobrikke i sporet.
Merk: Denne prosedyren må gjøres tilstrekkelig raskt for å unngå tørking av dråpene på prøven mikrobrikke. - Kontroller riktig plassering ved hjelp av en kikkert lysmikroskop mens du flytter et stykke refleksmidler under tuppen av prøveholderen. Begge microchips må rettes nøyaktig parallell for å oppnå best overlapping av synden vinduer.
MERK: I tilfelle vinduene ikke overlapper, microchips kan flyttes ved å trykke på en side med en spiss avpinsett, men unngå å flytte mikrobrikker for mye, så det SiN membranen kan lett bli skadet. Noen microchips kommer med en krysset konfigurasjon (vinduet i en mikrochip er vinkelrett på vinduet i andre microchip); denne konfigurasjonen forenkler innretting av de to mikrobrikker, men også reduserer synsfeltet i elektronmikroskop. - Ta forsiden av prøven kammeret lokk med pinsett og snu den opp ned. Uten å berøre mikrobrikker, plasserer baksiden av lokket på spissen. Sakte åpner pinsetten på en slik måte at lokket utelukkende hviler på den nedre gren av pinsett. Senk lokket til den hviler på de to microchips. Fjern pinsett.
- Kontroller justeringen av vinduene i begge microchips. Om nødvendig, ta av lokket, justere plasseringen av mikrobrikker, og plasser lokket igjen.
- Plasser skruene og fest dem i deres vanlige stedene. Sjekk justeringen av de to vinduene. Jegf nødvendig, fjerne skruene igjen og justere microchips.
MERK: Ikke fikse skruene for hardt, da dette kan forårsake skade. Et vakuum tetning oppnås når skruene bare stramme. - Kontroller forsegling ved å initiere en væskestrøm gjennom systemet ved hjelp av en strømningshastighet på 4 mL / min. Dersom ingen lekkasje observeres på hver side av spissen, er dette en god indikasjon på vakuumtetthet.
- Overfør holder til vakuum pumpestasjon og sjekk vakuum tetthet. Vakuumnivået skal nå minst 10 -5 mbar innen 5 min av pumping.
MERK: Det anbefales å teste pumpestasjonen med en dummy holder før bruk. - Overfør holderen til elektronmikroskop i kabinettet sitt for å hindre den fra å samle støv.
MERK: Hver kommersiell holderen kommer med en innhegning.
- Bruk buet pinsett til å ta prøven microchip på langsiden og legg den i sporet (pocket) i spissen av væskestrømmen TEM holderen. Hold SiN siden vendt oppover. Sjekk riktig plassering av mikrochip i sporet ved hjelp av en kikkert lysmikroskop.
3. STEM av en Specimen i væske
- Justering av elektronmikroskop for STEM MERK: Driften av elektronmikroskop beskrevet i denne protokollen er basert på standardprosedyrer som finnes i bruksanvisningen. Protokollen beskriver nødvendige detaljer utover standard prosedyrer for datainnsamling på flytende prøver.
- Start mikroskop med STEM modus justert. I prøveholder, setter en prøve som består av en tynn karbon film med AuNPs. Juster innstillingene for STEM mikroskop som følger: sette sonden strøm til 0,18 nA og konvergens semi-vinkelen elektronstråle til 20 mrad ved å velge en flekk størrelse på 4C og målet blenderåpning på 30 mikrometer. Velg en 8 cm kamera lengde.
- Legg merke til angitt strømtetthet målt ved fluorescens skjermen mens den automatiske detektoren er satt inn. Fjern prøveholderen.
MERK: Denne strømverdi er nødvendig for senere å estimere tykkelsen av væsken. - Start væskestrømmen med rent vann. Ikke overstige en strøm av 2pl / min.
- Sett væskestrømmen TEM holderen i elektronmikroskop og begynne evakuering. Se både vakuum indikasjon på forvakuum kammeret og varigheten av evakuering. Dersom vakuumnivået er standard og varigheten av pumpe prosedyren ikke overstiger den normale evakuering tid (ca. 1 minutt) ved en faktor på to, sett holderen.
- Åpne strålen ventilen når vakuumet i hovedprøvekammeret er i størrelsesorden som gjør at dens åpning. Sett ADF detektoren ved å trykke på ADF-knappen.
MERK: Denne protokollen refererer til en ADF-detektor anbragt over fosfor-skjerm av elektronmikroskopet. - Sett mikroskop i kontinuerlig bildeopptak-modus med en bildestørrelse på 512 x 512 piksler, en piksel oppholdstid på 2 ms, og en forstørrelse på 20.000. Søk på SiN vinduet ved å oversette scenen i x- og y-retningene.
MERK: microchips blokkere noen elektroner som passerer gjennom prøven mot oppdageeller; signalet er bare synlig på plasseringen av SiN. Se figur 5. Noen ganger er det lettere å finne den SiN vinduet ved å se på fluorescens-skjermen. - Når vinduet er funnet, justere innstillingene for kontrast og lysstyrke (med de respektive knotter), slik at kanten av vinduet blir synlig. Flytt kanten mot midten av synsfeltet ved å trykke på x- og y-oversettings knappene på prøvestadiet. Trykk på nullstillingsknappen for objektivet.
MERK: Lysstyrken må i stor grad redusert i forhold til en vakuum prøven på grunn av sterk spredning i væsken. - Fortsett ved grov fokusere skarpt hjørne på kanten av SiN vinduet ved å justere vertikal posisjon (z-oversettelse) på prøvestadiet. Kontroller at prøven posisjon er på eucentric høyden ved å dreie på scenen med 5 ° og rotere det tilbake. Funksjoner av prøven og hjørnet av SiN vinduet bør ikke skifte ved lave forstørrelser.
- Juster den vertikale stilling som er nødvendig for å plassere vinduet kant i midten av visningsområdet på nytt. Lagre posisjonen til scenen ved hjelp lagringsknappen av programvaren.
- Flytt til en posisjon hvor små biter av rusk eller andre objekter med høy kontrast (f.eks AuNPs) er til stede ved å oversette scenen i x- og y-retningene. Juster fokus på objektivet slik at alle objekter vises skarpt i fokus.
- Legg merke til strømtettheten målt ved den fosforskjerm synlige via operativsystemet programvare, som indikerer den utsendte strøm gjennom væskeholderen og gjennom åpningen av den automatiske detektoren. Beregn tykkelsen av væske cellen ved hjelp av ligning 1. Fortsett kun dersom væsken tykkelse er blitt bestemt, og ikke overstiger 3 um.
14
ligning 1
med t SIN tykkelsen av det amorfe silisiumnitrid membran og t vann tykkelsen på vannlaget. Den midlere fri veilengder beløp til l SiN = 0,79 mikrometer av SiN, = og l vann = 3,0 mikrometer vann for detektoren åpning semi-vinkel på 35 mrad 14. - observere nøye væsken ved lavere forstørrelser for å sikre at gassbobler ikke er til stede. Gassbobler kan forebygges ved hjelp av kontinuerlig væskestrøm og sonden strøm lavere enn 0. 5 nA.
- Oversett scenen i x- og y-retningene til et område som inneholder minst 20 AuNPs haer blitt funnet. Sett bildestørrelse 1024 x 1024 piksler, pixel holdetid til 19 mikrosekunder, og forstørrelsen til 400 000. Hente bilder av AuNPs følges til SiN membranen ved å trykke oppkjøpet knappen.
MERK: Når bildene er hentet der AuNPs er synlige med sterk kontrast og skarpe kanter (se figur 6), kan man være sikker på at eksperimentet er riktig satt opp. I tilfelle uventede problemer oppstår, ikke fortsette med eksperimentet, men sørg for å løse årsaken.
- STEM av oppløsningen av AuNPs
- Fjerne væskestrømmen TEM holderen fra mikroskopet og stoppe væskestrømmen.
- Tilberede minst 1 ml av en oppløsning av 0,1 M natriumklorid i HPLC-kvalitet vann i en glassprøyte.
- Juster strømningssystemet til en hastighet på 20 pl / min og spyle hele strømningssystemet med 0,3 ml av saltløsning. Bruk filterpapir for å samle opp væsken er ført ut på denandre enden av slangen. Etterpå etterjustere strømningssystemet til 2 mL / min.
- Kontroller integriteten til SiN vinduet med en kikkert lysmikroskop. Hvis ingen lekkasje er observert, sett væskestrømmen TEM holderen inn i mikroskop.
- Kontroller vakuum indikasjon på pre-vakuumkammeret og varigheten av evakuering. Dersom vakuumnivået er standard og varigheten av pumpe prosedyren ikke overstiger den normale evakuering tid (ca. 1 minutt) ved en faktor på to, sett holderen
- Flytt scenen iden av mikroskop tilbake til sin tidligere stilling ved hjelp av den lagrede scenen posisjon. Sett mikroskop i kontinuerlig bildeopptak-modus med en bildestørrelse på 512 x 512 piksler, en piksel oppholdstid på 2 ms, og en forstørrelse på 20,000X. Juster kontrast, lysstyrke, fokus, og eucentric høyde, som beskrevet i trinn 3.1.7-3.1.9.
- Finn et sted av interesse ved å oversette scenen i x- og y-retningene. Sett bildestørrelse1024 x 1024 piksler, pixel holdetid til 2 ms, og forstørrelsen til 500.000. Spill en rekke STEM bilder ved å trykke på oppkjøpet knappen manuelt en gang forrige bilde er tatt opp.
MERK: AuNPs begynner å løse seg opp så snart som elektronstrålen blir avsøkt over prøven. Partikler utenfor det bestrålte området er ikke berørt, og kan observeres umiddelbart etter. Tidsangivelsen er lagret i bilde spissen. Det er også mulig å bruke programvare for automatisert innsamling av en serie med bilder til en film.
- Demontering og rengjøring av TEM holderen etter forsøket
- Når væskefase-TEM eksperimenter er utført og holderen er trukket tilbake fra den elektronmikroskop, rense røret, væskekammeret, og dens komponenter for å fjerne eventuelle gjenværende faste partikler eller salt som kan påvirke fremtidige eksperimenter.
- Løsne den bakre skruen litt slik at det fortsatt fasti sporet, men lokket kan fjernes enkelt. Løsne den fremre skruen, fjerne den, og legg den i et støvfritt miljø.
- Ta av lokket og plasser den i støvfritt miljø for lagring.
- Fjern de to microchips fra lommen. Skille dem ved å dyppe dem forsiktig i vann eller i resten av oppløsningen av forsøket. Plasser microchips på silkepapir med SiN membran side oppover og la dem tørke i luft for videre analyse.
- Fjern O-ringene og rengjør de respektive sporene med HPLC-grade vann. Oppbevar O-ringene i et støvfritt miljø.
- Bruke et glass-sprøyte (5 ml) for å tømme hele produksjonsrøret (inngang og utgang), hver med 5 ml av HPLC-grad vann. Samle opp væsken med en liten beger plasseres under TEM holder spissen. Etter spyling, bruke en pipette og / eller filterpapir for å fjerne den gjenværende væske fra væskerommet.
- Inspisere spissen av TEM holderen og fjerne rester som brutte kanter av silikon mikrochips, fiber eller støv. Hvis salt er fortsatt synlig, gjenta rengjøringsprosessen. Returner O-ringene til sine spor.
- Oppbevar TEM holderen og komponentene i et støvfritt miljø.
- Prosedyre alternativ til 3.2: STEM av bevegelige gull nanopartikler
MERK: En annen sammenstilling prosedyre er nødvendig for å undersøke bevegelsen av AuNPs i væske.- Hoppe over trinn 1.2. Laste AuNPs på silisium mikrobrikke umiddelbart før du setter dem i TEM Holder i trinn 2.2. Hold prøven dekkes av et flytende lag til enhver tid for å unngå en sterk festing av AuNPs til SiN membranen. De andre trinnene i protokollen er de samme. En serie av STEM bilder er oppnådd i trinn 3.2.6.
ligning 1 
Figur 4: Montering av LFC TEM Holder. (A) Den flytende celledelen med the mindre O-ring som er lagt inn i sporet. Det innfelte viser topp utsikt. (B) Basismikrobrikke plasseres i respektive kontakten. Det innfelte viser side-visning i en slik vinkel at microchip er synlig fra lysrefleksjon. (CD) En dråpe av løsningen tilsettes til mikrobrikke. (EG) Plassering av dekselet microchip. (HI) Plassering av lokket av det flytende cellerommet. (J) Festing av lokket med de to skruene. (K) montert væskestrøm TEM holderen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Innledende Posisjonering og fokus ved hjelp STEM Mikrografer. (A) For å finne SiN vinduet, er scenen beveget seg mot smarteste signal. Silisiummikrobrikke er tynn nok for noen elektroner å passere gjennom nær vinduet. (B) Kanten av fokusert SiN vinduet viser noen AuNPs vises lyst på den mørke (mindre spredning) SiN membran vinduet. Kanten av mikrobrikke er lys på grunn av overdreven spredning. (C) Fokusering er gjort på hjørnet av SiN vinduet. Bildene viser under-fokusert, i fokus, og over-fokusert situasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Representative Results
Væskestrømmen TEM holderen ble benyttet for å studere oppførselen til AuNPs i væske. AuNPs ble stabilt immobilisert på SiN membranen i rent vann og ble fotografert med nanoskala oppløsning ved hjelp av væske-fase STEM (figur 6). Utmerket kontrast ble innhentet på det sterk-spredning gull. Strømtettheten på fosforskjermen målt for en tørr testprøve var 20 pA / cm, mens det utgjorde 8 pA / cm med væskestrømmen TEM holderen satt inn. Ved å bruke ligning 1, t vann = 2,4 ± 0,5 um, mye større enn hva som ble forventet på grunnlag av avstandsstykket tykkelse på 200 nm. Ikke desto mindre er tykkelsen ikke er for store for avbildning av AuNPs med nanometer romlig oppløsning. Væsken tykkelse var tykkere enn 200 nm satt av avstands grunn svulmende av synden membraner, ikke-flathet av mikrobrikker, og rusk bosatt på mikrobrikker.
16, selv om reaktive radiolyseprodukter (e - aq, H •, H +, OH •) som stammer fra interaksjonen av elektronstrålen med vann kan oksydere enkeltgullatomer, som fører til en endring av formen på AuNPs 15. Når imidlertid væskestrømmen system ble anvendt for å innføre klorioner i et andre forsøk ble stabiliteten til AuNPs endret. Kloridioner er i stand til å stabilisere oksyderte gullatomer i form av tetrachloroaureat, AuCl 4 -. Figur 7 viser at AuNPs sakte oppløst i løpet av en STEM bildebehandling time-lapse serie, tilsvarende resultater rapportert tidligere 16. For brukte elektron doseraten, tok ~ 300 s å oppløse de 30 nm-sized AuNPs.
Bevegelsene til AuNPs i wate r ble undersøkt i et tredje eksperiment (figur 8). Før eksperimentet, ble væskestrømmen TEM holder renset for å fjerne alle spor av salt. Til forskjell fra det første eksperimentet, ble en alternativ prøveprepareringsfremgangsmåten som brukes for å oppnå en svakere befestigelse av AuNPs til SiN membranen 14. I dette eksperimentet, ble løsningen AuNP plassert på silisium mikrobrikke og satt sammen i væskestrømmen TEM holderen uten å la oppløsningen tørke ut. På denne måten de AuNPs lett løsrevet fra SiN membranen på bildebehandling i dosen som benyttes. Noen av de AuNPs flyttet bort fra synsfeltet til bulk løsninger, mens de resterende AuNPs holdt seg innenfor synsfeltet i umiddelbar nærhet til SiN vinduet. Bevegelser av disse AuNPs ble observert, og til slutt de agglomerert. Etter en stund, disse agglomerater også løsrevet fra SiN membran og flyttet ut av synsfeltet og inn i løsningen.
ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 6: Scanning transmisjonselektronmikroskopi (STEM) Micrograph av AuNPs 30 nm i diameter på toppen av en Pure Water Layer. Bildet som vises er et valgt område av det opprinnelige bildet. Bildestørrelsen var 1024 x 1024 piksler, pixel holdetid var 19 mikrosekunder, pikselstørrelse var 0,73 nm, og forstørrelsen var 400,000X. Elektronet dose var dermed 7,1 x 10 4 e - / nm². Strømtettheten målt på fosforskjermen var 8 pA / cm2, slik at den flytende tykkelse ble beregnet til å utgjøre 2,4 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Time-lapse-serienav STEM mikrografer av AuNPs i Saline. (AD) Bilder hentet fra time-lapse serie STEM bilder på 30 s intervaller. De AuNPs gradvis oppløses i væsken som følge av tilstedeværelsen av kloridioner. Pikselen dvele tiden var 2 ms, rammen tiden av tid forfalle serien ble 1,75 s, pikselstørrelsen var 0,44 nm, og forstørrelsen var 500,000X. Elektronet dose per bilde var 1,2 x 10 4 e - / nm². Væsken tykkelse var 2,4 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: STEM Micrograph av AuNPs Flytte i Pure Water. (A) SiN membran med AuNPs, hvorav flere er valgt med piler. (B) Motion sporav de utvalgte AuNPs (se A). Noen AuNPs bevege seg bort fra synsfeltet i den tiden av imaging. De resterende AuNPs bevege seg sideveis langs SiN membran og begynne agglomerering. Når du har nådd et kritisk cluster størrelse, de sende fra membranen og bevege seg bort fra feltet av view.The pixel holdetid ble 1 ms, rammen tiden var 0,52 s, pikselstørrelsen var 1,8 nm, og forstørrelsen var 120,000X. Elektron dose per bilde var 3,5 x 10 2 e - / nm² og væsken tykkelse var 2,4 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Den beskrevne protokollen gjør det mulig STEM av AuNPs i en væske, herunder observasjon av dynamiske prosesser. Monteringen av holderen er en lett-å-lære teknikken. Imidlertid må flere aspekter vurderes når du arbeider med væskestrømmen TEM holderen. For eksempel kan brutte kantene av Si mikrochip eller store partikler på O-ringene resultere i lekkasje av væske cellen. På den annen side, store partikler (> 200 nm, for eksempel, støv eller Si rusk), kan på den SiN membranen resultere i en øket tykkelse av væske celle, noe som fører til en lav bildekontrast eller til en lav romlig oppløsning og kan også føre SiN vinduer å bryte. Viktigere, kan rester av salt eller andre kjemikalier påvirke utfallet av forsøkene på en uønsket måte. Derfor er det avgjørende at de ulike trinnene i prøveopparbeidelse og holder montering utføres nøye og i et rent og støvfritt miljø.
Tykkelsen av væske cell bestemmer den oppnåelige oppløsningen, samt kontrasten av de oppnådde bildene 17. Denne tykkelse kan justeres via avstandsstykker ligger på en av de to Si microchips. Avhengig av dimensjonene av prøven, kan forskjellige tykkelser av væske celle bli realisert. For studiet av AuNPs, er det mulig å bruke små avstandsstykker (200-500 nm), mens hele eukaryote celler trenger større avstandsstykker på opp til 5 um. Tykkelsen av den flytende cellen er ytterligere påvirket av utbuling av syndmembran vinduene som følge av trykkforskjellen mellom væskecellen og det omgivende vakuum. Denne virkning blir mer utpreget med større SiN membran vinduer. Således, for å minimalisere tykkelsen av væske cellen, er det anbefalt å bruke små SiN membran vinduer. I tilfelle er det vanskelig å finne en overlapping mellom to små vinduer, kan de settes sammen i en krysset konfigurasjon ved å bruke en annen base microchip. Alternative konfigurasjoner largely hindre svulmende og består av monolittiske mikrobrikke 18 eller membran vinduer som støttes av søyler 19, men de samlings ulemper angående prøven lasting. En av de mest utfordrende sider ved dagens teknologi er mangelen på nøyaktig kontroll over væsken tykkelse. Ofte er den flytende mye tykkere enn det som er forventet fra avstandslege dimensjonene som brukes, slik det ble vist her. Flere grupper anvendes lukkede væskekamrene 4, 20, 21, 22; disse systemene har noen fordeler med hensyn til romlig oppløsning, som væsken tykkelse kan reduseres ved å fremkalle en boble i væsken. Alternativt kan synden vinduene bli tvunget til å kollapse, noe som fører til en tynnere væske lag. For det tredje finnes kabinettet av andre tynnere vinduer (f.eks graphene) 23, også resulterer i mye tynnere væskerenn hva som er mulig med systemet som beskrives i denne protokollen. Det er imidlertid umulig å strømme væske i disse systemene.
Som ved enhver høy oppløsning mikroskopi teknikk, må en rekke eksperimentelle forhold tas i betraktning. Det viktigste er samspillet av elektronstråle med væske eller prøven. I tillegg til stråleskader, noe som begrenser den oppnåelige romlig oppløsning for mange faste prøver 24, blir de væskeprøver også påvirket av elektronstråle-genererte radiolyseprodukter til 15, 25. Siden disse produktene kan påvirke forsøket, forsiktig tolking og eksperimentell design er avgjørende 26. Mikroskopet innstillinger bør velges i henhold til målene i en bestemt studie. ADF STEM er kraftigere for bildenanopartikler av et høyt atomnummer (Z) i større tykkelser av væsken celle, WHIle TEM gir bedre kontrast på lav-Z materialer og er vanligvis raskere men krever tynnere flytende lag 3. I stedet for å bruke den automatiske detektoren, er det lysfelt (BF) detektor noen ganger brukt til å avbilde den flytende cellen, ettersom BF STEM er fordelaktig for avbilding av lav-Z-materiale i tykke lag 27. Med økende tykkelse av væske cellen, blir mer strøm nødvendig. Dette øker imidlertid også konsentrasjonen av radiolyseprodukter og øker stråleskader. Det bør også bemerkes at en inversjon av kontrast observeres i ADM detektor for meget tykke væsker (> 10 um for vann).
De flytende betingelser ble endret mellom våre eksperimenter ved å fjerne holderen fra mikroskopet og utveksling av både prøven og væsken. I tillegg til å endre saltkonsentrasjon, er det lett mulig å endre andre egenskaper av væsken ved å strømme i forskjellige væsker (for eksempel kan enbruke bufferløsninger for å sette en bestemt pH 16 eller kan innføre organiske løsninger eller andre tilsetningsstoffer). Det er også mulig å skifte væsken mens holderen fremdeles er satt inn i mikroskopet ved å strømme væske gjennom mikrofluidsystem. Men i dette tilfellet, er det ikke kjent på dette tidspunkt peker væsken i prøven forandres. Det er også verdt å merke seg at mikrobrikker som støtter elektroder er tilgjengelige, så nanoelektrokjemi eksperimenter kan utføres 28.
Gjenstander av studien er ikke begrenset til AuNPs i vann, men en lang rekke prøver som kan studeres ved anvendelse av protokollen som er beskrevet ovenfor, inkludert silisiumdioksyd, titanoksyd, og polymerer. Hvis bevegelser av objekter er for rask til å fange i et bilde i oppkjøpet kan viskositeten reduseres med en størrelsesorden ved hjelp av en blanding av 50% glyserol og 50% vann.
Fra de nevnte punktene,en rekke fordeler, muligheter, og også ulemper blir tydelige. Når du arbeider med væskefase STEM, de viktigste ulemper å vurdere er at: 1) noen eksperiment er påvirket av det dynamiske samspillet mellom elektronstråle med hele prøven (objektet under observasjon, væsken, og synden membraner); 2) prøvehåndtering er langtekkelig, og det er ofte vanskelig å oppnå et tynt væskelag fordi prøven eller mikrobrikker inneholde noen mikrometer-store partikler; 3) den flytende tykkelse varierer vanligvis i stor grad fra den tiltenkte tykkelsen er fastsatt av avstandsstykket; og 4) romlig oppløsning og kontrast sterkt avhengig av den flytende tykkelse og forskjellen mellom forandringen tettheten av gjenstanden under observasjon og væsken.
I dag, rikelig metoder finnes for mikroskopi av objekter i væske med nanometer romlig oppløsning. Elektronmikroskopi i amorf is er en kraftfull teknikk 29,men de involverte eksperimentelle prosedyrer er skjøre, ikke alle forsøkene tillate fremstillingen av prøven i is, og tidsoppløst eksperimenter er umulig. Røntgen mikroskopi 30, 31 kan i prinsippet anvendes, men det har en begrenset romlig oppløsning og ikke er allment tilgjengelig i laboratorier. Atomkraftmikroskopi i væske har blitt etablert, men er en overflate teknikk bare 32, 33, 34, 35. Lysmikroskopi oppviser ikke tilstrekkelig rommessig oppløsning. På det nåværende, elektronmikroskopi i flytende synes den mest kraftfulle teknikk for direkte mikroskopi av nanoskala objekter og prosesser i væske.
Væskefase TEM og STEM ennå ikke er rutine analytiske teknikker, men er fortsatt under utvikling. Antallet parametere for å ta i betraktning er betydelig, og det er Often vanskelig å reprodusere eksperimentelle resultater. Videre er kvantitative data vanskelig å oppnå fordi de virkninger under gransking henger sammen med prosesser som skjer som et resultat av elektronstrålen. Protokollen er beskrevet her tar sikte på å standardisere forsøksprotokollen, hvorved sto for alle aktuelle base aspekter av forsøket. Vi håper at denne protokollen vil føre til bedre reproduserbarhet av eksperimentelt arbeid i dette nye feltet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular light microscope | Leica | M60 CMO | |
| Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector | JEOL | ARM200F | |
| Liquid flow TEM specimen holder | DENS Solutions | Ocean | |
| Microfluidic syringe pump | Harvard Scientific | PicoPlus | |
| Plasma cleaner | Gatan | Solarus950 | |
| Chemicals | |||
| Acetone, Rotisolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
| Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
| Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
| Materials | |||
| Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Microfluidic peek tubing | Upchurch Scientific | 1570 | |
| Plastic Replaceable tips Tweezers | |||
| (Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips) | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
| Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
| Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
| Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR) | Hamilton | 81323 | |
| Clean room tissue Sontara Micropure AP (224 x 224mm) | DuPont | Sontara MicroPure |
References
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
- Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
- Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
- Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
- de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
- Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
- Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
- Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
- de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
- Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
- Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
- Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
- Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
- Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
- Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
- Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346 (2004).
- Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
- Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
- Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
- Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
- Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
- Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
- Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
- Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
- Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).
