Summary
Этот протокол описывает работу держателя потока жидкости образца для сканирующей просвечивающей электронной микроскопией AuNPs в воде, используемый для наблюдения наноразмерных динамических процессов.
Abstract
Образцы полностью встроенные в жидкости могут быть изучены на наноуровне с пространственным разрешением сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM) с использованием микрожидкостных камеры собранном в держателе образца для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и STEM. Микрожидкостных система состоит из двух кремниевых микрочипов, поддерживающих тонких нитрид кремния (SiN) мембранные окна. В данной статье описываются основные этапы загрузки образца и сбора данных. Наиболее важным из всех является обеспечить, чтобы жидкость отсек плотно собран, обеспечивая тем самым тонким слоем жидкости и вакуумное уплотнение. Этот протокол также включает в себя ряд тестов, необходимых для выполнения во время загрузки образца для того, чтобы обеспечить правильную сборку. После того, как образец загружают в электронный микроскоп, жидкость толщина должна быть измерена. Неправильная сборка может привести к слишком густой жидкости, в то время как слишком тонкие жидкость может указывать на отсутствие жидкости, например, когда образуется пузырь. И, наконец, протоколобъясняет, как изображения взяты и как динамические процессы могут быть изучены. Образец, содержащий AuNPs визуализируется как в чистой воде, и в физиологическом растворе.
Introduction
Обычные сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM) ограничена диапазоном образцов, пригодных для анализа, в частности, сухих и твердых образцов, пригодных для размещения в высоком вакууме. Тем не менее, многие научные и технологические вопросы касаются наноразмерных материалов и процессов в жидкой среде. Образцы полностью встроенные в жидкости теперь могут быть изучены с использованием STEM концепцию , которая включает в себя микрожидком камеру в собранном в держателе образца для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и штоком 1. Эта новая методика становится все более популярным, так как он обеспечивает новое понимание важных процессов различных направлений исследований, в том числе рост, растворение, и агрегации процессов наночастиц 2, 3, 4, 5, 6. Не только металлы, но и biominerals 7 и биологические системы могут быть изучены 8, 9, 10, 11. Загрузки образца и получения изображения для жидкой фазы STEM отличается от стволовым сухих образцов и включают протокол, который требует специализированного обучения.
Микрожидкостных система состоит из двух кремниевых микрочипов , поддерживающих нитрида кремния (SiN) мембранные окна прозрачные для электронного пучка при 200 кэВ энергии 12 (см рисунок 1А). Подробная информация о размерах и об обработке этих микрочипов можно найти в другом месте 12, 13. Образец обычно содержит наноразмерные объекты. В данной работе мы наблюдали наночастицы золота (AuNPs). В AuNPs обездвижены в верхнем окне (по отношению к нисходящим путешествующего электронным пучком) или плавают в жидкого мылаЯ бы. Наномасштабная пространственное разрешение в STEM получается путем сканирования электронного пучка над AuNPs и сбор передаваемых рассеянных электронов с помощью детектора 9 Кольцевая Dark Field (АПД). Два микрочипы помещают в небольшую щель в наконечнике дл жидкости ТЕМ потока 1 (держатель действует как для стеблем и ТЭМ , но упоминается как держатель ПЭМ). Один из микрочипов содержит распорку так, чтобы жидкость отсек образован между микросхемами. Уплотнительные кольца по обе стороны от двух микрочипов обеспечивают вакуумное уплотнение жидкости отсека 13 (см Фигура 1В).
Цель данной статьи состоит в том, чтобы продемонстрировать основные этапы загрузки образца и сбора данных, с тем чтобы заинтересованные пользователи могут найти легкий доступ к этой новой новой техники. Система доступна от конкретной компании используется, но протокол также подходит для систем других компаний. Техникаболее сложным по сравнению с обычными ТЭМ и стебле, а также ряд практических аспектов необходимо учитывать при работе с системой жидкостного держателя 13. Наиболее важным из всех является обеспечить, чтобы жидкость отсек плотно собран, обеспечивая тем самым тонким слоем жидкости и вакуумное уплотнение. Таким образом, крайне важно, чтобы работать чисто и чтобы предотвратить образование пыли во время подготовки и монтажа держателя жидкости ТЕМ потока. В частности, уплотнительные кольца и два кремниевых микрочипов должны быть свободны от всех загрязнений. Даже мелкие частицы пыли на одном из микрочипов может существенно увеличить толщину собранной клетки, что может помешать достижению полезного пространственного разрешения. Вакуумное уплотнение имеет важное значение, так что никакое загрязнение или повреждение не будет оставлен в электронном микроскопе после эксперимента. Этот протокол описывает процедуру загрузки и несколько необходимых тестов. Работа электронного микроскопа проста, бушельт он требует некоторых дополнительных шагов по сравнению с микроскопией твердых образцов. С увеличением толщины жидкости, больше электронов поглощается и рассеивается жидкостью; измерение толщины жидкой имеет важное значение. И, наконец, протокол объясняет, как изображения взяты и как динамические процессы могут быть изучены.
Рисунок 1: Liquid Cell Flow для сканирующей просвечивающей электронной микроскопии (STEM). (А) Схематическое изображение собранной жидкости клетки. Два кремниевых микрочипов с нитрид кремния (SiN) мембраны окна расположены между двумя уплотнительными кольцами. Жидкость заключена между мембраной SiN и, таким образом, отделяется от вакуума в электронном микроскопе. Сфокусированный электронный пучок сканирует по образцу. Контраст получается из рассеянных электронов. Наночастицы золота (AuNPs) обездвижены в жидкости на мембране SiN, но также может двигаться вжидкость. (Б) Схематическое вид сбоку поперечное сечение стопкой двух микрочипов с уплотнительными кольцами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Protocol
Рисунок 2: Процедура очистки из Si микрочипов. (A) Два мензурки заполнены 40-60 мл ацетона и этанола каждый. Микрочипов (В) Si помещают в химический стакан , наполненную ацетоном. Сторона с мембраной SiN должна быть обращена вверх. Отражение двух микрочипов Si ясно показывает канавку на задней поверхности двух микрочипов. (C) , через 2 мин, микрочипы Si передаются на второй стакан , заполненный этанолом. Еще через 2 мин, микрочипы Si переносят в чистой комнате ткани для сушки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Поток жидкости просвечивающий электронный Microscopy (ПЭМ) держатель оборудования. (А) держатель жидкость ТЕМ потока с пластиковой трубкой и шприц для потока жидкости. (В) Наконечник держателя ТЭМ потока жидкости вынимается из держателя вала, крышка отсека ячейки жидкости, уплотнительных колец и двух кремниевых микросхемах. Трубка выступает из левой части наконечника. (C) Клетка отделение жидкости показывает одно уплотнительное кольцо, слот для размещения микрочипа. (D) Различные пинцет на беспыльном поверхности (алюминиевая фольга). (Е) Крышка отсека ячейки жидкости с двумя уплотнительными кольцами. (F) Два кремниевых микрочипов с SiN мембранных окон. Слева: образец микрочип без распорки; справа: крышка микрочип с 200 мкм распорки с. (G) микрожидком насос системы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого FIGUчисло рейнольдса
1. Приготовление микрочипы
1. Очистка микрочипов
- Подготовьте рабочее пространство с низким уровнем пыли в ламинарного потока воздуха капотом с фильтром частиц пыли.
- Очистите световой микроскопии стекло с безволокнистого ткани и чистого этанола для размещения и транспортировки микрочипов. Поместите предметное стекло на чистом помещении ткани в чашке Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования технического этанола во все времена. - Выберите 5 базовых микрочипов (без прокладки) для размещения образца и 5 микрочипы с распоркой густого 200 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размеры окна составляют 20 х 400 мкм 2 , а толщина SiN составляет 50 нм. Поскольку существует некоторая терпимость по размерам, рекомендуется проверить размеры с помощью светового микроскопа. - Используйте покрытые углеродом пинцет, чтобы удалить микрочипов из коробки для хранения и поместить их на предметное стекло. Возьмите микрочипов твердо, но тщательно их Ионг стороны. Ручка микрочипа таким образом, что сторона SiN, мембрана всегда обращена вверх.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к хрупкой мембраны SiN на верхней стороне. Также будьте осторожны с обработкой микрочипов во избежание образования трещин их острых кромок, которые могут вызвать проблемы из-за частиц кремния, находящихся на микрочипе или более поздних протечек.
Примечание: Обучение для процедуры, чтобы удалить микрочипы из клейкой поверхности могут быть выполнены на (дешевые) фиктивных микрочипов. - Поместите на микрочипы в чистой комнате ткани в чашке Петри. Закройте блюдо и передать его на вытяжкой.
Примечание: Шаги, включающие ацетон выполняются в вытяжном шкафу для химической безопасности. - Возьмите два 120 стеклянных колбочек мл. Промыть один стакан с ацетоном, а другой с этанолом, чтобы очистить их. Заполните первый с 40-60 мл ацетона, а другой с 40-60 мл этанола.
Примечание: Важно использовать ВЭЖХ-класса жидкостей, также для этого шага в протоколе. - Переводмикрочипы в стакан с ацетоном, чтобы удалить защитный слой резиста. Аккуратно переместите стакан вручную , чтобы эффективно промыть микрочипов, но будьте осторожны , чтобы не превратить микрочипов с ног на голову - смотрите Рисунок 2.
- Через 2 мин, удалите микрочипы и быстро передавать их в стакан с этанолом. Аккуратно перенести мензурку вручную с этанолом в течение 2 мин, чтобы удалить любые остатки слоя резиста. Накройте стакан с алюминиевой фольгой и передать его на ламинарный поток верстаке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте микрочипы высыхать во время передачи, чтобы избежать осаждения мусора. - Удалите микрочипы из стакана и поместите их на новую ткань чистых помещений. Пусть им высохнуть в течение нескольких минут и передавать микрочипов на световом микроскопе предметное стекло в чашку Петри.
Примечание: Влажные микрочипы может легко перевернуть вокруг, перевернуть вверх дном, или придерживаться пинцета, когда были освобождены. Этого можно избежать с помощью врпеть микрочипов мягко на фильтровальную бумагу и вытягивать пинцетом в сторону в горизонтальном направлении. - Закройте чашку Петри и передать микрочипов на очиститель плазмы.
- Поместите стекло с микрочипов в пылесос плазмы. Запуск программы очистки 5 мин для визуализации поверхности мембраны гидрофильные из нитрида кремния и с целью удаления углеводородов.
Примечание: Соответствующие параметры , применяемые для нашего плазменного пылесоса являются: 70 мТорр, газовый поток 11,5 кубических сантиметров в минуту для O 2 и 35,0 SCCM для Ar, 50 Вт радиочастотной (РЧ) цели вперед, 5 Вт Диапазон РФ, и максимальное отражение РФ. Любая плазма способна индуцировать поверхностный заряд подходит. - Поместите предметное стекло с микрочипом обратно в чашку Петри, закройте крышку, и передать его в световой микроскоп.
- Изучите микрочипы под световым микроскопом для возможных мембранных разрывов или оставшихся частиц грязи. Соблюдайте особую осторожность с окном областей и проверить наличие небольших пятен, указывающих агupture мембраны. Уволить микрочипы с поврежденных мембран.
- Закройте чашку Петри и хранить его в ламинарный воздушный поток верстаке.
2. Подготовка образца на микрочипов
- Готовят водный раствор AuNP (цитрат стабилизированный) путем смешивания небольших количеств исходных растворов, содержащих 30 нм диаметра, цитрат-стабилизированного AuNPs при концентрации ~ 3 М.
- Поместите микрочипы на чистую клейкую поверхность в транспортной коробке для осаждения капель приложения / образца.
- Поместите капельку (1-2 мкл) раствора образца на мембранной стороне греху свеже плазмы очищенную микрочипа (использовать микрочип без прокладки) и дайте раствору высохнуть в ламинарный воздушный поток верстаке.
Примечание: Эта процедура может быть повторена с целью повышения концентрации AuNPs на мембране SiN. - Нанести 1 мкл деионизованной воды на микрочип для удаления соли и / или поверхностно-активными веществами. После 30 секунд, осторожноудалить капли воды с фильтровальной бумагой. Пусть микрочипы высохнуть на воздухе в ламинарного потока воздуха верстаке.
ПРИМЕЧАНИЕ: достаточно большое количество AuNPs будет приклеен к микрочипа и не будут смыты в воде больше. - Используйте подготовленные микрочипы образцы в течение 4 ч, как SiN теряет свои гидрофильные свойства поверхности, оказываемые в течение долгого времени, что может привести к жидкости ведут себя по-разному во время эксперимента. Примечание: Обратитесь к разделу обсуждения для более подробной информации.
- Используйте закрытую транспортную коробку для хранения и передачи микрочипов.
2. Подготовка Держателем потока жидкости ТЕМ
- Очистка держателя ПЭМ потока жидкости
- Очистите все инструменты (пинцеты и отвертки), которые будут находиться в контакте с вакуумной частей с использованием ацетона и этанола в ультразвуковой ванне и поместить их на поверхности пыли, представленной куском новой алюминиевой фольги, размещенной на верстаке. Работа с перчаткамичтобы избежать загрязнения держателя жидкости ТЕМ потока.
Примечание: Средства не должны быть тщательно очищены, если уверен, что они чистые для работы с вакуумной частей. Перчатки можно избежать, если один способен обрабатывать оборудование, не касаясь вакуумных частей. - Поместите держатель ТЕМ потока жидкости под бинокулярным светового микроскопа таким образом, что можно наблюдать кончик держателя, содержащего жидкостную камеру. Смотрите рисунок 3.
- Снимите крышку наконечника держателя и поместите его на поверхность без пыли.
Примечание: Крышка титана чувствительна к царапинам, вызванных более твердыми материалами, как пинцетом. Рекомендуется использовать с полимерным покрытием пинцет для чувствительных материалов. - Приготовьте по крайней мере, 1-2 мл чистой воды (ВЭЖХ).
Примечание: Если не использовать ВЭЖХ-класса жидкости, то рекомендуется проверить, что жидкости, используемые не содержат микрочастицы, которые могли бы привести к засорению системы потока; ФИЛТэр жидкость по мере необходимости с микро порами фильтра. - С помощью стеклянного шприца (1 мл) для промывки системы проточная с 0,5 мл чистой воды. Рекомендуется использовать микрожидком систему впрыскивающего. С помощью пипетки и / или фильтровальную бумагу, чтобы удалить жидкость выбрасываются в отсеке для культур клеток жидкости. Проверьте все трубки для потока жидкости. Сухой кончик держатель впоследствии с помощью фильтровальной бумаги и / или пипетку.
- С помощью светового микроскопа, чтобы проверить, что кончик держателя чистой и сухой. При необходимости, промойте кончик держателя с водой или этанолом для удаления любых твердых остатков, которые, возможно, были оставленные высушенного раствора. Удалите кусочки пыли или остатки волокон, а также. Осторожно удалите эти куски с помощью пинцета, тем самым избегая царапин на поверхности титана. Также проверьте внутри кольцевых канавок и удалить остатки жидкости с небольшой кусочек ткани чистых помещений.
Примечание: Если держатель не станет чистой с этой процедурой, то рекомендуетсячтобы снять наконечник из держателя и очистить его в ацетоне в течение 2 мин и в этаноле в течение еще 2 мин с использованием ультразвуковой ванны. - Проверьте все дополнительные части наконечника (уплотнительные кольца, крышки и винты) под световым микроскопом и удалить пыль, волокна и т.д. ...
Примечание: Иногда, небольшие кусочки, происходящих из винтов или микрочипов Si должны быть удалены, а также. При необходимости, на короткое время очистки вакуумных частей с помощью ВЭЖХ-класса этанола. Крышка и винты могут быть очищены с помощью ультразвука, как описано для наконечника. Избегайте размещения уплотнительные кольца часто в этаноле, так как это может сделать уплотнительные кольца ломкими с течением времени, уменьшая их вакуумную герметичность. Система работает без вакуумной смазки, но если возникают проблемы уплотнения, вакуумной смазки могут быть использованы. - Заново уплотнительные кольца в соответствующие пазы держателя и убедитесь, что они подходят и не выступают на любой стороне паза.
- Держите держатель ТЕМ потока жидкости свободной от пыли до загрузки образца (например ,., Покрывая его с алюминиевой фольгой).
- Очистите все инструменты (пинцеты и отвертки), которые будут находиться в контакте с вакуумной частей с использованием ацетона и этанола в ультразвуковой ванне и поместить их на поверхности пыли, представленной куском новой алюминиевой фольги, размещенной на верстаке. Работа с перчаткамичтобы избежать загрязнения держателя жидкости ТЕМ потока.
- Сборка держателя ПЭМ потока жидкости
Примечание: Следующая процедура описывает процедуру загрузки микрочипов в держатель образца с оптимальной ориентацией для щупов. В этой конфигурации, базовая микрочипа с образцом, будет верхняя микрочип раз переносили в микроскоп. Смотри рисунок 4. Для ТЕМ, более высоким пространственным разрешением получается в нижней части жидкой клетки по отношению к нисходящим передвижного электронным пучком. Таким образом, микрочипы будут установлены с точностью до наоборот.- Используйте изогнутые пинцет, чтобы захватить образец микрочип на длинной стороне и поместите его в отверстие (карман) в наконечнике держателя жидкости ТЕМ потока. Держите сторону SiN вверх. Проверьте правильность размещения микрочипа в гнезде с помощью бинокулярного оптического микроскопа.
Примечание: Если уплотнительное кольцо ниже микрочипа неправильно установлен микрочип может выступать пПЗУ слот. - Поместите каплю 0,3 мкл отфильтрованной жидкости для эксперимента на образце микрочипа с использованием микропипетки. При необходимости зафиксировать микрочип на месте с помощью пинцета, так как капиллярные силы капли могут вытащить микрочип из своего кармана.
- Используйте вверх ногами изогнутые пинцет, чтобы взять второй микрочип (один с разделительного слоя). Осторожно переверните микрочип с ног на голову. Поместите распорную микрочип на базе микрочипа в слоте.
Примечание: Эта процедура должна быть сделано достаточно быстро, чтобы избежать высыхания капли на образце микрочипа. - Проверить правильное положение с помощью бинокулярного оптического микроскопа при перемещении кусок светоотражающего материала под кончиком держателя образца. Оба микрочипы должны быть выровнены точно параллельно для достижения наилучшего совпадения окон SiN.
Примечание: В случае, если окна не перекрываются, микрочипы можно перемещать нажатием на одной стороне с наконечникомпинцет, но избежать перемещения микрочипов слишком много, так как мембрана SiN может быть легко повреждены. Некоторые микрочипы поставляются с перекрестно (окно одного микрочипа перпендикулярно к окну в другом микрочипом); эта конфигурация облегчает выравнивание двух микрочипов пока также уменьшает поле зрения в электронном микроскопе. - Возьмите переднюю сторону крышки камеры образца с помощью пинцета и повернуть ее вверх дном. Не касаясь микрочипов, поместите заднюю часть крышки на кончике. Медленно откройте пинцет таким образом, что крышка исключительно лежит на нижней ветви пинцета. Осторожно опустите крышку, пока она не лежит на двух микросхемах. Удалите пинцетом.
- Перепроверьте выравнивание окон обоих микрочипов. При необходимости, снять крышку, отрегулировать позиционирование микрочипов, и установите крышку снова.
- Установите винты и зафиксировать их в своих обычных местах. Проверьте выравнивание двух окон. яе необходимо, удалите винты снова и отрегулируйте микрочипов.
Примечание: Не закрепляйте винты слишком сильно, так как это может привести к повреждению. Вакуумное уплотнение достигается тогда, когда винты только затянуть. - Проверьте герметичность путем инициирования потока жидкости через систему с использованием скорости потока 4 мкл / мин. Если нет утечки не наблюдается по обе стороны от наконечника, это является хорошим показателем вакуумной герметичности.
- Перенесите держатель на насосной станции вакуум и проверьте герметичность вакуумной. Уровень вакуума должен составлять не менее 10 -5 мбар в течение 5 мин накачки.
Примечание: Рекомендуется проверить насосную станцию с фиктивным держателем перед использованием. - Перенесите держатель электронного микроскопа в его корпусе, чтобы предотвратить его от сбора пыли.
Примечание: Каждый коммерческий держатель поставляется с корпусом.
- Используйте изогнутые пинцет, чтобы захватить образец микрочип на длинной стороне и поместите его в отверстие (карман) в наконечнике держателя жидкости ТЕМ потока. Держите сторону SiN вверх. Проверьте правильность размещения микрочипа в гнезде с помощью бинокулярного оптического микроскопа.
3. STEM образца в жидком
- Регулировка электронного микроскопа для щупов ПРИМЕЧАНИЕ: Работа электронного микроскопа, описанного в этом протоколе основаны на стандартных процедур, которые можно найти в руководстве пользователя. Протокол описывает требуемую деталь за пределы стандартных процедур для сбора данных на жидких образцах.
- Запуск микроскопа с режимом STEM выровненной. В держателе образца, вставить тестовый образец, состоящий из тонкой углеродной пленки с AuNPs. Отрегулируйте настройки микроскопа STEM следующим образом: установить зондовый ток до 0,18 нА и сходимость полу-угол электронного пучка до 20 мрад путем выбора размера пятна от 4С и апертура объектива 30 мкм. Выберите длину камеры 8 см.
- Обратите внимание на указанной плотности тока, измеренного на экране флуоресценции в то время как детектор ADF вставлен. Снимите держатель образца.
Примечание: Это значение тока необходимо в дальнейшем для оценки толщины жидкости. - Запуск потока жидкости с чистой водой. Не превышать потока 2мкл / мин.
- Вставьте держатель ТЕМ потока жидкости в электронном микроскопе и начать эвакуацию. Проверьте как показание вакуума в камере форвакуумом и продолжительность эвакуации. Если уровень вакуума является стандартным и длительность процедуры откачки не превышает нормальное время эвакуации (около 1 мин) с коэффициентом два, вставьте держатель.
- Открыть Балка клапан, когда вакуум основной камеры для образца находится в диапазоне, дающий возможность его открытия. Вставьте детектор АПД, нажав на кнопку ADF.
Примечание: Этот протокол относится к детектору ADF, расположенной над люминесцентным экраном электронного микроскопа. - Установите микроскоп в режиме непрерывного захвата изображений с использованием изображения размером 512 х 512 пикселей, время задержки пикселя 2 мкс, а также увеличение в 20000. Поиск окна SiN путем перевода на сцену в направлениях х и у.
Примечание: Микрочипы блокировать любые электроны, проходящие через образец в направлении Обнаруживатьили; Сигнал виден только в месте расположения SiN. Смотрите рисунок 5. Иногда легче найти окно грешат просмотра экрана флуоресценции. - После того, как окно было найдено, отрегулируйте настройки контрастности и яркости (с помощью соответствующих регуляторов) так, чтобы край окна становится видимым. Перемещение края по направлению к центру поля зрения, нажав на Х- и переводческое кнопки стадии образца. Нажмите кнопку сброса объектива.
Примечание: Яркость должна быть в значительной степени уменьшена по сравнению с вакуумным образца за счет сильного рассеяния в жидкости. - Проследует по грубой фокусировки острый угол на краю окна SiN путем регулировки вертикального положения (Z-трансляцию) стадии образца. Убедитесь в том, что положение образца находится на высоте eucentric путем поворота сцены на 5 ° и вращая его обратно. Особенности образца и углу окна SiN не должны смещаться при низких увеличениях.
- Отрегулировать вертикальное положение по мере необходимости, чтобы поместить края окна в середине области просмотра снова. Храните позицию сцены с помощью кнопки магазина программного обеспечения.
- Переместить в положение , в котором небольшие кусочки мусора или других объектов высокой контрастности (например, AuNPs) присутствуют путем перевода на сцену в направлениях х и у. Отрегулируйте фокус объектива так, чтобы все объекты выглядят резкими в фокусе.
- Обратите внимание на плотность тока, измеренного на фосфорный экран видимым через операционное программное обеспечение, что указывает на переданный ток через емкости дл жидкости и через отверстие детектора АПД. Вычислить толщину жидкой ячейки, используя уравнение 1. Продолжайте только если жидкость толщина была определена, и не превышает 3 мкм.
14
Уравнение 1
с т Sin толщины аморфного нитрида кремния мембраны и т воды от толщины слоя воды. Средняя длина свободного пробега длины сумму л SiN = 0,79 мкм SiN, = и л воды = 3,0 мкм воды для детектора открытия полу-угол 35 мрад 14. - Тщательно наблюдать жидкости при низких увеличениях, чтобы гарантировать, что пузырьки газа нет. Газовые пузырьки могут быть предотвращены с помощью непрерывного потока жидкости и зонда ток ниже, чем 0. 5 нА.
- Перевести на сцену в х и у направлениях, пока область, содержащую по меньшей мере 20 AuNPs гаs был найден. Установите размер изображения 1024 х 1024 пикселей, время ожидания на пиксель 19 мкс, а увеличение до 400000. Приобретать изображения AuNPs прилипших к мембране SiN, нажав на кнопку захвата.
Примечание: После того, как изображения были получены , в которых AuNPs видны с сильным контрастом и острыми краями (смотрите рисунок 6), можно быть уверенным в том , что эксперимент правильно настроен. В случае возникают неожиданные проблемы, не продолжать эксперимент, но убедитесь, что устранить причину.
- СТЭМ роспуска AuNPs
- Снимите держатель жидкого ТЕМ потока от микроскопа и остановить поток жидкости.
- Приготовьте по меньшей мере, 1 мл раствора 0,1 М хлорида натрия в ВЭЖХ-очищенной воды в стеклянный шприц.
- Настройка системы измерения потока до скорости 20 мкл / мин и промывать систему проточная с 0,3 мл физиологического раствора. С помощью фильтровальной бумаги для сбора жидкости выбрасывается надругой конец трубки. После этого повторно отрегулировать систему подачи до 2 мкл / мин.
- Проверьте целостность окна SiN с помощью бинокулярного оптического микроскопа. Если не наблюдается утечки, снова вставьте держатель жидкости ТЕМ потока в микроскоп.
- Проверьте индикацию вакуума в предварительно вакуумной камере и продолжительность эвакуации. Если уровень вакуума является стандартным и длительность процедуры откачки не превышает нормальное время эвакуации (около 1 мин) с коэффициентом два, вставьте держатель
- Перемещение этапа задней части микроскопа обратно в прежнее положение с помощью сохраненной позиции стадии. Установите микроскоп в режиме непрерывного захвата изображений с использованием изображения размером 512 х 512 пикселей, время задержки пикселя 2 мкс, а также увеличение в 20,000X. Отрегулируйте контрастность, яркость, фокус, и eucentric высоту, как описано в пунктах 3.1.7-3.1.9.
- Найдите местоположение интереса путем перевода на сцену в направлениях х и у. Установите размер изображения1024 х 1024 пикселей, время пикселей задержки до 2 мкс, а также от увеличения до 500000. Запишите ряд STEM изображений, после того, как предыдущее изображение было записано вручную нажатием кнопки захвата.
Примечание: В AuNPs начинают растворяться, как только электронный пучок сканируется по образцу. Частицы вне зоны облучения, не затрагиваются и могут наблюдаться сразу после. Метка времени хранится в заголовке изображения. Кроме того, можно использовать программное обеспечение для автоматизированного сбора серии изображений в кино.
- Разборка и очистка держателя ПЭМ после эксперимента
- Когда эксперименты жидкофазного ПЭМ завершены и держатель отводится от электронного микроскопа, очистить трубки, жидкостную камеру, и его компоненты, чтобы удалить любые твердые частицы или оставшиеся соли, которые могут повлиять на будущие эксперименты.
- Слегка ослабьте задний винт так, чтобы он по-прежнему фиксируетсяв гнездо, но крышка может быть легко удалена. Ослабить передний винт, снимите его и поместите его в окружающей среде без пыли.
- Снимите крышку и поместите его в защищенном от пыли окружающей среды для хранения.
- Удалите два микрочипы из кармана. Разделив их погружением их тщательно в воде или в растворе оставшегося эксперимента. Поместите микрочипы на папиросную бумагу со стороной SiN мембраны вверх и дайте им высохнуть на воздухе для дальнейшего анализа.
- Снимите уплотнительные кольца и очистите соответствующие канавки с помощью ВЭЖХ-очищенной воды. Храните уплотнительные кольца в среде без пыли.
- С помощью стеклянного шприца (5 мл), чтобы промыть все трубки (вход и выход), каждый с 5 мл ВЭЖХ-очищенной воды. Сбор жидкости с небольшой стакан, расположенной под наконечником держателя ТЭМ. После промывки, использовать пипетку и / или фильтровальную бумагу, чтобы удалить остатки жидкости из жидкостного отсека.
- Осмотрите наконечник держателя ПЭМ и удалить остатки как сломанные края кремниевой микро-стружка, волокна или пыль. Если соль остается видимым, повторите процедуру очистки. Возврат уплотнительные кольца их пазы.
- Храните держатель ТЭМ и его компонентов в среде без пыли.
- Процедура альтернатива 3.2: STEM движущихся наночастиц золота
Примечание: Иной порядок сборки требуется изучить движение AuNPs в жидкости.- Пропустите шаг 1.2. Загрузите AuNPs на кремниевой микросхеме непосредственно перед их помещением в ПЭМ держатель на шаге 2.2. Хранить образец, покрытый слоем жидкости в любое время для того, чтобы избежать сильного прикрепление AuNPs к мембране SiN. Остальные этапы протокола одинаковы. Ряд STEM изображений будет получен на этапе 3.2.6.
Уравнение 1 
Рисунок 4: Сборка держателя потока жидкости ПЭМ. (А) Жидкая отсеками с гое меньше уплотнительное кольцо помещается в паз. На вставке показан вид сверху. (Б) Основание микрочип помещается в соответствующем гнезде. На вставке показан вид сбоку на такой угол, что микрочип видно из отражения света. (Компакт - диск) Каплю раствора добавляется в микрочипе. (EG) Размещение крышки микрочипа. (HI) Размещение на крышке отсека ячейки жидкости. (J) Крепление крышки с помощью двух винтов. (K) в собранном виде держатель жидкого ТЕМ потока. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Начальное позиционирование и фокусировка с помощью STEM микрофотографии. (A) Чтобы найти окно SiN, сцена перемещается к яркому сигNAL. Микрочип кремния достаточно тонкий для некоторых электронов, чтобы пройти через близко к окну. (B) Край сосредоточенного окна SiN показывая некоторые AuNPs появляющиеся яркие на темном (меньше рассеяние) окна SiN мембраны. Край микрочипа ярко из-за чрезмерного рассеяния. (C) Фокусировка производится на углу окна SiN. Изображения показывают под сосредоточенный, в центре внимания, и чрезмерно сфокусировано ситуации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Representative Results
Держатель жидкости ТЕМ поток был использован для изучения поведения AuNPs в жидкости. AuNPs стабильно иммобилизованным на мембране SiN в чистой воде и были обследованы с разрешением наноуровне с использованием жидкой фазы STEM (рисунок 6). Отличный контраст был получен на сильно-рассеяния золота. Плотность тока на люминесцентном экране, измеренного для сухой образец для испытаний 20 пА / см, в то время как она составила 8 пА / кв.см с держателем ТЕМ потока жидкости, вставленного. Используя уравнение 1, Т воды = 2,4 ± 0,5 мкм, гораздо больше , чем ожидалось на основании толщины спейсера 200 нм. Тем не менее, толщина не слишком велика для формирования изображения из AuNPs с нанометровым пространственным разрешением. Толщина жидкость была толще, чем 200 нм, установленного проставки из-за выпячивание SiN мембраны, несплющенности из микрочипов, и мусор, находящийся на микрочипов.
16, хотя реактивные продукты радиолиза (е - р - р, Н •, Н +, ОН •) , происходящих от взаимодействия электронного пучка с вода может окисляться отдельные атомы золота, что приводит к изменению формы AuNPs 15. Тем не менее, когда система потока жидкости была использована для введения ионов хлора во втором эксперименте, стабильность AuNPs изменилась. Хлорид - ионы способны стабилизировать окисленные атомы золота в виде tetrachloroaureat, AuCl 4 -. На рисунке 7 показано , что AuNPs медленно растворенные во время покадровой серии STEM изображений, аналогичные результатам сообщалось ранее 16. Для используемой скорости электронов дозы, потребовалось ~ 300 сек для растворения 30 нм размером AuNPs.
Движения AuNPs в водосна г были изучены в третьем эксперименте (рисунок 8). До начала эксперимента, держатель жидкость ТЕМ поток был очищен для того, чтобы удалить все следы соли. В отличие от первого эксперимента, препарат подход альтернативный образец был использован для достижения более слабое прикрепление AuNPs к SiN мембраны 14. В этом эксперименте раствор AuNP помещали на кремниевую микрочипа и собранный в держателе жидкости ТЕМ поток, не давая раствор высыхает. Таким образом, AuNPs легко отделяется от мембраны SiN при визуализации при мощности дозы, используемой. Некоторые из AuNPs отошли от поля зрения в объемных решений, в то время как остальные AuNPs оставались в поле зрения в непосредственной близости от окна SiN. наблюдались движения этих AuNPs, и в конце концов они агломерируют. Через некоторое время, эти агломераты также отделяется от мембраны SiN и переехал из поля зрения, так и в растворе.
ntent "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 ">
Рисунок 6: Сканирование просвечивающей электронной микроскопии (STEM) Микрофотография AuNPs 30 нм в диаметре в верхней части чистого слоя воды. Изображение, показанное является выбранная область исходного изображения. Размер изображения был 1024 × 1024 пикселей, время пикселей задержки составлял 19 мкс, размер пикселя составил 0,73 нм, а увеличение было 400,000X. Таким образом , доза электронов составляла 7,1 × 10 4 е - / nm². Плотность тока , измеренная на фосфорный экран был 8 пА / см 2, так что жидкость толщины рассчитывают составит 2,4 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 7: Серия Покадровыйстеблевой микрофотографии AuNPs в физиологическом растворе. (AD) Изображения извлекаются из покадровой серии STEM изображений с интервалом 30 сек. В AuNPs постепенно растворяется в жидкости, как следствие присутствии ионов хлорида. Время выдержки пикселя составляет 2 мкс, временные рамки серии времени истечения 1,75 с, размер пикселя 0,44 нм, а увеличение было 500,000X. Доза электронов на изображение составляло 1,2 × 10 4 е - / nm². Толщина жидкости была равна 2,4 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 8: STEM микрофотография AuNPs скользящими в чистой воде. (A) SiN мембраны с AuNPs, некоторые из которых выбираются стрелками. (Б) Движение дорожкииз выбранных AuNPs (см A). Некоторые AuNPs отойти от поля зрения во время визуализации. Остальные AuNPs двигаться в боковом направлении вдоль мембраны SiN и начать агломерацию. При достижении критического размера кластера, они шли от мембраны и отойти от области view.The времени пикселя выдержки был 1 мкс, временной интервал 0,52 с, размер пикселя составляет 1,8 нм, а увеличение было 120,000X. Доза электронов на изображение составила 3,5 х 10 2 е - / nm² и жидкость толщина составляла 2,4 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Описанный протокол позволяет стебле AuNPs в жидкости, в том числе наблюдения динамических процессов. Узел держателя является простым в освоении техника. Однако некоторые аспекты необходимо учитывать при работе с держателем жидкости ТЕМ потока. Например, сломанные ребра микрочипа Si или крупных частиц на уплотнительных кольцах может привести к утечке жидкости клетки. С другой стороны, большие частицы (> 200 нм, например, пыль или мусор Si) на мембране SiN может привести к увеличению толщины жидкой клетки, что приводит к контрасте низкой изображения или низким пространственным разрешением и может даже привести к SiN окна ломаться. Важно отметить, что остатки соли или других химических веществ, могут повлиять на результаты экспериментов нежелательным образом. Поэтому крайне важно, чтобы различные стадии подготовки образца и узла держателя осуществляется тщательно и в чистой и без пыли окружающей среды.
Толщина жидкого CELL определяет достижимое разрешение, а также контраст получаемых изображений 17. Эта толщина может быть отрегулирована с помощью распорок, расположенных на одной из двух микрочипов Si. В зависимости от размеров образца, различной толщины жидкой клетки могут быть реализованы. Для изучения AuNPs, можно использовать небольшие проставки (200-500 нм), в то время как целые клетки эукариот нуждаются в больших распорки вплоть до 5 мкм. Толщина жидкой клетки далее под влиянием распиранием мембранных окон SiN в результате разности давлений между жидкой клетки и окружающим вакуумом. Этот эффект становится более выраженным с большими окнами мембраны SiN. Таким образом, для того, чтобы свести к минимуму толщину жидкой ячейки, рекомендуется использовать небольшие SiN, мембранные окна. В случае трудно найти перекрытие между двумя небольшими окнами, они могут быть собраны в скрещенных конфигурации, используя другую базовую микрочип. Альтернативные конфигурации LARGEly предотвратить вздутие и состоят из монолитных микрочипа 18 или мембранных окон , поддерживаемых колоннами 19, но эти недостатки экспоната в отношении загрузки образца. Одним из наиболее сложных аспектов современной технологии является отсутствие точного контроля над жидкой толщины. Часто жидкость намного толще, чем то, что, как ожидается, от размеров распорных, используемых, как это было показано здесь. Несколько групп использовали закрытые жидкостных камер 4, 20, 21, 22; Эти системы имеют некоторые преимущества в отношении пространственного разрешения, поскольку жидкость толщина может быть уменьшена за счет индукции пузырька в жидкости. В качестве альтернативы, окна SiN может быть принужден разрушаться, что приводит к более тонким слоем жидкости. В- третьих, корпус других более тонких окон существует (например, графен) 23, а также в результате чего значительно тоньше жидкостейчем это возможно с системой, описанной в данном протоколе. Тем не менее, невозможно потока жидкости в этих системах.
Как и для любой техники микроскопии высокого разрешения, необходимо учитывать ряд экспериментальных аспектов. Наиболее важным аспектом является взаимодействие электронного пучка с жидкостью или образца. В дополнение к радиационных повреждений, что ограничивает достижимую пространственное разрешение для многих твердых образцов 24, жидкие образцы также под влиянием электронно - лучевых сгенерированных продуктов радиолиза 15, 25. Так как эти продукты могут повлиять на эксперимент, интерпретация данных тщательные и опытно - конструкторские имеют важное значение 26. Настройки микроскопа должны быть выбраны в соответствии с целями конкретного исследования. ADF STEM является более мощным, для наночастиц формирования изображения с высоким атомным номером (Z) в большей толщине жидкой клетки, бееле TEM дает лучший контраст по низким Z материалов и , как правило , быстрее , но требует более тонких жидких слоев 3. Вместо того чтобы использовать детектор АПД (BF) детектор Яркое Поле иногда используется для изображения жидкого клетки, так как BF STEM является предпочтительным для получения изображений с низким уровнем Z материалов в толстых слоях 27. С увеличением толщины жидкой ячейки, больше тока необходим. Тем не менее, это также увеличивает концентрацию продуктов радиолиза и увеличивает радиационных повреждений. Следует также отметить, что инверсия контраста наблюдается в АПД детектора для очень толстых жидкостей (> 10 мкм для воды).
Жидкие условия были изменены между нашими экспериментами удалением держателя от микроскопа и обмениваясь как образца, так и жидкости. В дополнение к изменению концентрации соли, то легко можно изменить другие свойства жидкости, протекая в различных жидкостях (например, можноиспользование буферных растворов для того , чтобы установить определенный рН 16 или может ввести органические растворы или другие добавки). Кроме того, можно изменить жидкость в то время как держатель еще вставлена в микроскоп с помощью проточной жидкости через микрожидком систему. Тем не менее, в данном случае, неизвестно, в какое время указывают жидкости при изменении образца. Следует также отметить , что микрочипы , поддерживающие электроды доступны, поэтому Электрохимия эксперименты могут быть проведены 28.
Объектами исследования не ограничиваются AuNPs в воде, но широкое разнообразие образцов могут быть изучены с использованием протокола, описанного выше, в том числе диоксид кремния, оксид титана, и полимеров. Если перемещение объектов слишком быстро, чтобы захватить в изображении в приобретении, вязкость может быть уменьшена на порядок величины с использованием смеси 50% глицерина и 50% воды.
Из вышеупомянутых пунктов,целый ряд преимуществ, возможностей, а также недостатки становятся очевидными. При работе с жидкофазной STEM, наиболее важные недостатки, которые следует учитывать в том, что: 1) любой эксперимент находится под влиянием динамического взаимодействия электронного пучка с всего образца (объект под наблюдением, жидкости и мембран SIN); 2) обработка образца является утомительным, и часто бывает трудно достичь тонким слоем жидкости, так как образец или микрочипы содержат некоторые микронного размера частиц; 3) жидкость толщина, как правило, в значительной степени отличается от предполагаемой толщины установленной прокладки; и 4) пространственное разрешение и контраст сильно зависит от толщины жидкости, а разница между плотностью смены объекта, находящегося под наблюдением и жидкостью.
В настоящее время широкие методы существуют для микроскопии объектов в жидкости с нанометровым пространственным разрешением. Электронная микроскопия в аморфный лед является мощным средством 29,но вовлеченные экспериментальные процедуры являются тонкими, не все эксперименты позволяют получение образца во льду, и времяразрешенные эксперименты невозможны. Рентгеновской микроскопии 30, 31 в принципе может быть использован, но он имеет ограниченное пространственное разрешение , и не широко доступны в лабораториях. Методами атомно - силовой микроскопии в жидкости была установлена , но это техника поверхность только 32, 33, 34, 35. При световой микроскопии не обладает достаточным пространственным разрешением. В настоящее время электронная микроскопия в жидкости кажется наиболее мощную технику для прямой микроскопии объектов и процессов в наноразмерных жидкости.
Жидкофазная TEM и STEM еще не обычные аналитические методы, но все еще развиваются. Число параметров, чтобы принять во внимание, является значительным, и это ofteп трудно воспроизвести результаты эксперимента. Кроме того, количественные данные трудно получить, потому что эффекты исследуемые переплетаются с процессами, происходящими в результате электронного пучка. Протокол, описанный здесь, имеет целью стандартизировать экспериментальный протокол, таким образом, с учетом всех соответствующих базовых аспектов эксперимента. Мы надеемся, что этот протокол приведет к улучшению воспроизводимости экспериментальных работ в этой новой области.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular light microscope | Leica | M60 CMO | |
| Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector | JEOL | ARM200F | |
| Liquid flow TEM specimen holder | DENS Solutions | Ocean | |
| Microfluidic syringe pump | Harvard Scientific | PicoPlus | |
| Plasma cleaner | Gatan | Solarus950 | |
| Chemicals | |||
| Acetone, Rotisolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 7328.2 | |
| Water, chromasolv Plus for HPLC | Sigma-Aldrich | 34877-2.5L | |
| Ethanol, Rotisolv HPLC grade | Carl Roth | P076.2 | |
| Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm | British-Biocell | EM.GC20 | |
| Materials | |||
| Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm | DENS Solutions | for Ocean system | |
| Microfluidic peek tubing | Upchurch Scientific | 1570 | |
| Plastic Replaceable tips Tweezers | |||
| (Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips) | ideal-tek | 2ASVR.SA | |
| Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-7Te | |
| Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating) | Electron Microscopy Sciences | 78322-2ATe | |
| Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR) | Hamilton | 81323 | |
| Clean room tissue Sontara Micropure AP (224 x 224mm) | DuPont | Sontara MicroPure |
References
- Ring, E. A., de Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).
- Ross, F. M. Opportunities and challenges in liquid cell electron microscopy. Science. 350, 9881-9889 (2015).
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron microscopy of specimens in liquid. Nat. Nanotechnol. 6, 695-704 (2011).
- Zheng, H., Smith, R. K., Jun, Y. W., Kisielowski, C., Dahmen, U., Alivisatos, A. P. Observation of single colloidal platinum nanocrystal growth trajectories. Science. 324, 1309-1312 (2009).
- Evans, J. E., Jungjohann, K. L., Browning, N. D., Arslan, I. Controlled growth of nanoparticles from solution with in situ liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 11, 2809-2813 (2011).
- Alloyeau, D., et al. Unravelling kinetic and thermodynamic effects on the growth of gold nanoplates by liquid transmission electron microscopy. Nano Lett. 15, 2574-2581 (2015).
- Smeets, P. J., Cho, K. R., Kempen, R. G., Sommerdijk, N. A., De Yoreo, J. J. Calcium carbonate nucleation driven by ion binding in a biomimetic matrix revealed by in situ electron microscopy. Nat. Mater. 14, 394-399 (2015).
- Peckys, D. B., de Jonge, N. Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells. Microsc. Microanal. 20, 346-365 (2014).
- de Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).
- Evans, J. E., et al. Visualizing macromolecular complexes with in situ liquid scanning transmission electron microscopy. Micron. 43, 1085-1090 (2012).
- Dukes, M. J., et al. Improved microchip design and application for in situ transmission electron microscopy of macromolecules. Microsc. Microanal. 20, 338-345 (2014).
- Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells. J. Microsc. 243, 273-283 (2011).
- de Jonge, N., Pfaff, M., Peckys, D. B. Practical aspects of transmission electron microscopy in liquid. Adv. Imag. Electr. Phys. 186, 1-37 (2014).
- Verch, A., Pfaff, M., De Jonge, N. Exceptionally slow movement of gold nanoparticles at a solid:liquid interface investigated by scanning transmission electron microscopy. Langmuir. 31, 6956-6964 (2015).
- Schneider, N. M., Norton, M. M., Mendel, B. J., Grogan, J. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Electron-water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. J. Phys. Chem. C. 118, 22373-22382 (2014).
- Hermannsdoerfer, J., de Jonge, N., Verch, A. Electron beam induced chemistry of gold nanoparticles in saline solution. Chem. Comm. 51, 16393-16396 (2015).
- Schuh, T., de Jonge, N. Liquid scanning transmission electron microscopy: Nanoscale imaging in micrometers-thick liquids. C. R. Phys. 15, 214-223 (2014).
- Jensen, E., Burrows, A., Molhave, K. Monolithic chip system with a microfluidic channel for in situ electron microscopy of liquids. Microsc. Microanal. 20, 445-451 (2014).
- Creemer, J. F., et al. A MEMS reactor for atomic-scale microscopy of nanomaterials under industrially relevant conditions. J. Microelectromech. Syst. 19, 254-264 (2010).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic microscopy of nanoscale cluster growth at the solid-liquid interface. Nat. Mater. 2, 532-536 (2003).
- Thiberge, S., et al. Scanning electron microscopy of cells and tissues under fully hydrated conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 3346 (2004).
- Chen, Q., et al. 3D motion of DNA-Au nanoconjugates in graphene liquid cell electron microscopy. Nano Lett. 13, 4556-4561 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336, 61-64 (2012).
- Reimer, L., Kohl, H. Transmission electron microscopy: physics of image formation. , Springer. (2008).
- Abellan, P., Woehl, T. J., Parent, L. R., Browning, N. D., Evans, J. E., Arslan, I. Factors influencing quantitative liquid (scanning) transmission electron microscopy. Chem. Commun. 50, 4873-4880 (2014).
- Woehl, T. J., Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Experimental procedures to mitigate electron beam induced artifacts during in situ fluid imaging of nanomaterials. Ultramicroscopy. 127, 53-63 (2013).
- Hohmann-Marriott, M. F., et al. Nanoscale 3D cellular imaging by axial scanning transmission electron tomography. Nat. Methods. 6, 729-731 (2009).
- Unocic, R. R., et al. Quantitative electrochemical measurements using in situ ec-S/TEM devices. Microsc. Microanal. 20, 452-461 (2014).
- Kourkoutis, L. F., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Electron Microscopy of Biological Materials at the Nanometer Scale. Annu. Rev. Mater. Res. 42, 33-58 (2012).
- Chao, W., Harteneck, B. D., Liddle, J. A., Anderson, E. H., Attwood, D. T. Soft X-ray microscopy at a spatial resolution better than 15 nm. Nature. 435, 1210-1213 (2005).
- Larabell, C. A., Nugent, K. A. Imaging cellular architecture with X-rays. Curr Opin Struct Biol. 20, 623-631 (2010).
- Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. Force probing surfaces of living cells to molecular resolution. Nat. Chem. Biol. 5, 383-390 (2009).
- Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2, 618-634 (2010).
- Fleming, A. J., Kenton, B. J., Leang, K. K. Bridging the gap between conventional and video-speed scanning probe microscopes. Ultramicroscopy. 110, 1205-1214 (2010).
- Sulchek, T., Hsieh, R., Adams, J. D., Minne, S. C., Quate, C. F., Adderton, D. M. High-speed atomic force microscopy in liquid. Rev. Sci. Instr. 71, 2097-2099 (2000).
