Introduction
Lo sviluppo di xenotrapianti derivati da pazienti tumorali (PDXs), in cui i campioni di tumore chirurgicamente asportati vengono innestati direttamente in topi immuno-compromessi, offre diversi vantaggi rispetto ai modelli di xenotrapianto di cellule-linea standard e rappresenta un importante passo avanti nella ricerca sul cancro 1,2. PDXs possono essere mantenuti e ampliati con passaggi successivi con minima alterazione delle caratteristiche genetiche e biologiche del tumore coltivate nel primo passaggio; e riflettere più accuratamente l'eterogeneità del tumore di xenotrapianti derivate da linee cellulari tumorali umane 3-8. Questi modelli sono ora ampiamente utilizzate come piattaforma per la personalizzazione cancro terapeutica 9,10, come piattaforma preclinico nello sviluppo di farmaci 6,11 e come uno strumento sperimentale per lo studio della biologia del cancro 4,12.
La maggior parte dei PDXs vengono impiantati e propagate per via sottocutanea, che permette di tenerne la misurazione della crescita tumorale nel tempo utilizzando pinze. però, La malattia metastatica è stato più difficile da modellare con PDXs. In particolare per il cancro al seno, xenotrapianti con capacità metastatica a diversi organi sono stati descritti 3,5,13, ma la frequenza di diffusione spontanea di siti metastatici è estremamente bassa. Dove riportato, l'identificazione e la quantificazione degli oneri si basa metastatico in esame istologico laboriosa degli organi bersaglio post-mortem. linee cellulari di cancro che esprimono bioluminescente (luciferasi, Luc) o fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP) reporter gene sono comunemente utilizzati in modelli sperimentali di metastasi del cancro al seno a cervello, polmoni, ossa e il fegato dopo intracardiaca, la coda-venosa, intrafemoral e iniezione milza 14-16. Anche se questi modelli bypassare diffusione dei tumori primari, che sono preziosi per studiare i meccanismi di tropismo d'organo e di colonizzazione metastatica. Tuttavia, le cellule derivate da tumori di pazienti primari e PDXs possono avere bassi tassi di trasfezione o trasduzione using procedure standard. Una alternativa è quella di stabilire linee cellulari derivate PDX-17 in vitro, che può essere poi etichettati utilizzando protocolli di coltura dei tessuti convenzionali. Questo approccio tuttavia, non è adatto per l'etichettatura maggior PDXs, per cui linea cellulare derivazione è difficile e può modificare il fenotipo delle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per la trasduzione di cellule tumorali PDX-dissociate con vettori lentivirali adatti per l'imaging in vivo. Inoltre, descriviamo metastasi sperimentale con iniezione intracardiaca delle cellule dissociate PDX luc-GFP etichettati in topi immunocompromessi.
Un protocollo di base per la trasduzione di organoidi PDX-dissociate con gene reporter che esprime lentivirus è stato descritto in precedenza 18. Nel protocollo corrente si descrivono metodi aggiuntivi per arricchire per le cellule tumorali umane ed ottenere vicino efficienza di trasduzione 100%, così come l'uso di PDXs etichettati per rilevare il cancro al seno sperimentalemetastasi. Questo protocollo può essere adattato per l'etichettatura più tipi di cancro di PDXs con vari marcatori luminescenti e fluorescenti e la modulazione dell'espressione genica (cioè, shRNA knockdown di geni di interesse).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
| EGF | BD Biosciences | 354001 | |
| Heparin | Sigma | H4784 | |
| B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
| Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
| Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| HBSS Red Ca2+/Mg2+ free | Hyclone | SH30031.02 | |
| Hepes | |||
| 10x PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
| Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
| 30 °C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
| 70 μm filters | Falcon | 7352350 | |
| scalpels | Fisher | 22079690 | |
| Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
| Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
| Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
| EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
| Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
| Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
| MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
| Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
| Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
| Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
| Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |
References
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