Abstract
이 내이에 도달 할 수 있도록 우리는 중이에 특정 약물 전달을위한 설치류에 두 개의 최소 침습 미세 수술 기법을 제시한다. 첫 번째 절차는 bullostomy 되나, 고막 수포의 천공으로 구성; 두번째는 transtympanic 주입된다. 모두 인간의 임상 고 실내 절차를 에뮬레이트.
키토산 - 글리세 (CGP) 및 Ringer's 젖산 버퍼 (RL)이 지역의 약물 전달 용 생체 적합성 차량으로 사용되었다. CGP 널리 의약 용도로 사용되는 무독성 생분해 성 중합체이다. 이것은 RT에서 점성 액체이지만 체온에서 반 고체상에 응결. RL은 인간에서 정맥 내 투여에 사용되는 등장 성 용액이다. 이 차량의 작은 부피를 정확하게 bullostomy 의해 원형 윈도우 (RW)의 틈새에 배치된다. transtympanic 주입 중이을 채우고 적은 제어하지만 내 귀에 폭 넓은 액세스 할 수 있습니다.
transtympanic 주입 bullostomy에 비해 덜 침습적 인 것을 입증 있지만 두 절차는 마우스 중이에 약물 전달 방법으로 적합하다.
Introduction
장애 청력 (가장 빈번한 인간의 감각 적자이며, 전 세계 인구의 5.3 %, 65 세 이상 개인의 30 %에 영향을 http://www.who.int/topics/deafness/en을 2016 업데이트). 청력 손실은 아이들의 언어 습득에 영향을 미치고 노인의인지 기능 저하를 가속화합니다. 따라서 엄청난 사회 경제적 영향을 중요한 건강 관리 문제입니다. 이것은 유전 적 결함, 환경 적 요인 또는 결국 달팽이관 손상 모발 세포 및 신경 세포의 사멸을 유도하는 양 (1)의 조합에 의해 발생 될 수있다. 이러한 세포 따라서 세포 손실과 동반 청력 손실이 되돌릴 수 없습니다, 포유 동물에서 재생되지 않습니다. 임상 옵션은 보청기와 인공 와우, 중이 및 골전도 임플란트 (2)를 포함하여 보철 장치를 기반으로합니다. 불행하게도, 어떤 특정 건강 회복 누 없다청각 장애에 대한 tments 따라서 여러 연구 라인은 예방 및 수복 치료의 개발에 초점을 맞추고있다. 새로운 치료 옵션이 약물 치료 2 유전자 및 세포 치료뿐만 아니라 작은 분자의 개발을 포함한다.
인공 약리학 적 치료에있어서 가장 중요한 문제 중 하나는 약물 전달된다. 전신 치료에 의한 혈관 미로 배리어 3 달팽이관의 유효성이 제한되어 있으므로, 내부 귀 약물 통로를 제한 내이 유체 항상성을 유지하는 물리적 및 생화학 장벽 역할 인공 혈관과 접촉하는 연속 내피. 투과성 이뇨제 또는 삼투 제의 사용과 같은 인공 염증 동안 증가 될 수 있지만 이는 단지 작은 지용성 분자 투과성이다. 결국 전신 투여 후에 감소 달팽이관 도달 할 약물의 양;따라서, 유기 독성을 일으킬 수 과다 복용이 필요합니다. 또한, 약물의 간 대사 독성 비활성 대사 4, 5, 6, 7을 제조 할 수있다. 대조적으로, 로컬 개입 바람직 부작용 4, 7, 8, 9없이 중간 또는 내이으로 약물의 공지 제한된 양의 배치를 허용한다. 현재 임상에서 고 실내 정부는 이러한 메니 에르 병 (10) 겐타 마이신과 같은 특정 인공 와우 병리, 제한되어, 갑작스런 난청의 코르티코 스테로이드, 메니 에르 병, 면역 매개 성 1, 13, 12, 11, 및 소음 난청갑작스런 난청 4, 16, 17 (4), (15) 및 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF1).
지역 투여를위한 제제는 인공 와우 유체의 섬세한 항상성 (pH와 삼투압)을 유지해야한다. 또한, 뇌척수액의 세균 오염을 방지하기 위해 프로세스를 통해 멸균을 유지하는 것이 매우 중요하다. 약물 전달에 사용되는 부형제 nonototoxic, 생체 적절한 일관성이 있어야한다. 액체 솔루션 인해 이관을 통해 통관에 intracochlear 주사를 권장하지만, 고 실내 경로에 대한 적합하지 않습니다. 이 경우에, 약물은 일반적 중이 4 (18, 19)에서 자신의 보존성을 높이기 위해 반 - 고체 겔에 의해 수행된다. 대체 배달 등산용내이에 약물의 통과를 증가시키는 캐리어로서 사용 MS는 나노 입자 (20)이며, 여기서 21 아데노 우리는 두 차량 비교 : CGP 및 RL 용액. CGP 키토산에 의해 형성된 하이드로 겔 -D- 글루코사민 및 갑각류의 껍질로부터 얻은 N- 아세틸 -D- 글루코사민과 β-글리세 키토산 체인 주위 물 실드를 형성하고 그것을 유지하는 폴리올로 구성된 선형 다당류 액체 형태. CGP는 열성이고 중이 22, 23, 24, 25의 지속적인 약물 방출을 허용 lysozymes 의해 분해 될 수있다. 키토산 계 하이드로 겔 인해 면역 원성 및 염증 반응 지역 23, 24의 활성 부족 부족 그러한 약물 전달 임상 응용에 적합한 차량이다. O 번째에어 손, RL 버퍼는 특히 출혈, 외상에, 물과 전해질의 소스로 인간의 정맥 투여를위한 비 발열 등장 성 용액 (273 mOsm / L pH를 6.5) 또는 젖산 대사의 부산물로 인해 부상을 구울 간에서 산증을 중화.
여기에 우리가 설명하고 마우스 내 귀에 지역 약물 전달을위한 정제 된 두 가지 수술 방법을 비교한다. 두 기법의 안전성 프로파일은 기능적 형태 및 분자 시험을 사용하여 평가 하였다. 청력 청성 뇌간 반응 (ABR) (26) (27) 이전과 다른 시간에 미세 후에 수행을 사용하여 평가 하였다. 종료점 절차는 두 미세 수술 절차의 해부학 적 세포 및 분자 영향 달팽이관 해부와 비교하기 위해 사용 하였다.
Protocol
동물의 처리 절차는 국제 및 국내 규정에 따라 있는지 확인합니다. 이 프로토콜은 각각 유럽 공동체 63분의 2,010 / EU와 스페인어 RD에게 2천13분의 53 가이드 라인을 따른다.
1. 일반 동물 취급
- 피드 마우스 광고 무제한 표준식이 요법과 마시는 물. 제어 건강과 실험 동물 과학 협회 (FELASA) 권장 사항 연맹 따라 웰빙.
2. 청력 평가
참고 : 이러한 ABR (9)와 같은 비 침습적 절차 (이 작품 2, 7, 14, 28 d 개 postmicrosurgery)에서 수술 후 전에 테스트 청문회에 의해 미세 수술 절차와 많은 시간의 추적 기능에 미치는 영향.
- ABR 시험용 (복강 주사 케타민 (100 ㎎ / ㎏ 체중 (BW)과 자일 라진 (10)를 즉, 단기간 효과 프로토콜 쥐를 마취㎎ / ㎏, BW). 또한, 흡입 마취하에 테스트를 듣고 수행합니다.
주 : ABR 파라미터 마취 프로토콜 (28)에 의해 영향을받을 수 있으므로, 실험 전반에 걸쳐 동일한 하나를 사용한다. - 발가락 - 핀치 반사를 테스트하여 마취의 깊이를 확인합니다.
참고 : 철수 반사가 사라지면 동물이 청각 테스트를 수행하기 위해 마취의 적절한 깊이에 도달했습니다. - 이러한 히드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스 기반의 젤 같은 눈물 보충제의 국소 투여에 의해 탈수 및 보조 건성 각 결막염의 눈을 보호합니다.
- 전체 절차를 수행하는 동안 생리 학적 온도 (37.5-38 °에 C)에서 마우스를 유지합니다. 전기 간섭을 방지하기 위해 따뜻한 물 펌프 및 난방 패드를 사용합니다. 직장 프로브와 함께 체온을 모니터링합니다. 항상 동물을 과열하지 않도록주의.
참고 : 우리는 쥐 사이의 표면 살균제로 가열 패드를 청소하는 것이 좋습니다.0; 마취 유도 및 복구, 전기 가열 패드, 백열등 또는 적외선 등을 사용할 수있다. - ABR 절차
참고 : ABR 등록의 경우, 파형 생성하는 내측 사운드 카드가있는 컴퓨터 워크 스테이션을 사용 (디지털 - 아날로그를, DA 출력, 변환) 및 전기 응답 파형을 디지털화은, 감쇠기, 오실로스코프와을 (디지털, AD 입력에 아날로그) 낮은 임피던스 증폭기. 현대 청각 워크 스테이션 (즉, 터커 데이비스 Techonologies)는 단일 컴팩트 한 시스템의 모든 구성 요소를 포함한다.- 주변 소음 간섭과 잔향 (그림 1)을 방지하기 위해 사운드 감쇠 챔버 내의 가열 패드에 발생하기 쉬운 위치에 마취 된 마우스를 놓습니다.
- 외이도에 음향 자극을 제공합니다. 사전 자극 또는 적합한 소프트웨어로 디자인 된 새로운 신호를 사용합니다. 선택한 스피커로 DA 워크 스테이션 출력을 연결합니다.
참고 : Fre을외이도 내에 삽입 전기장 또는 폐쇄 - 필드 스피커가 이용 될 수있다. 때문에 폐쇄 시스템에 프로브를 삽입 및 사운드 교정에 어려움 마우스로 작업 할 때 이전이 바람직하다. 무료 필드 스피커는 양쪽 귀를 자극하고 바 이노 럴 반응을 유도. 무료 필드 스피커와 주로 모노 응답을 얻으려면, 반대측 활동 (귀 플러그 예) 또는 잡음을 마스킹에 의한 폐색에 의해 제거되어야한다.- 외이도에 정렬 스피커의 중심과 머리 또는 선택한 귀를 향하도록 고정 된 거리 (보통 5-20cm)에서 무료로 필드 스피커를 배치합니다. 장애물 스피커와 귀 사이와 날개가 완전히 개방되어 있는지 없는지 확인합니다.
- 다음 스테인리스 피하 바늘 전극 배치 : ⅰ) 두개골의 정점 위에 귀 사이의 두피에서 활성 (양극) 전극 (), ii) 상기 레퍼런스 (음극) 전극, 이하선에귓바퀴 아래 영역 및 ⅲ)이면, 테일 또는 뒷다리 영역에 상기 접지 전극 (도 1).
- 양극과 음극의 전기 임피던스를 확인합니다. 임피던스 미만 3 킬로 옴 (이상적으로 1 킬로 옴)인지 확인합니다. 더 높은 경우, 알코올 깨끗 재배치 또는 전극을 교체한다.
- ABR 기록 용 5-10 dB SPL 27, 29, 30 단계에서 음압 레벨 (SPL)에 대해 90 내지 10 dB의 상대적인 강도를 감소시 클릭 및 광대역 순음 주파수와 현재 생성.
- 현재 간단한 클릭 또는 톤 자극 (1-5 MS) 높은 수준 (예 : 80 또는 90dB SPL)로 시작하고 5-10dB의 SPL 단계의 강도를 감소시키는 버스트. 자극 후 처음 10 밀리의 전기 반응을 등록 (ABR 응답이 6-8 밀리에 표시 유발).
참고 :이 때문에, 자극 속도이상 50 자극해서는 안 / s의 (정상 속도 20-50).
- 현재 간단한 클릭 또는 톤 자극 (1-5 MS) 높은 수준 (예 : 80 또는 90dB SPL)로 시작하고 5-10dB의 SPL 단계의 강도를 감소시키는 버스트. 자극 후 처음 10 밀리의 전기 반응을 등록 (ABR 응답이 6-8 밀리에 표시 유발).
- 증폭, 기록 및 각각의 자극 강도로 유발 전기 응답을 평균. 저잡음 양호한 신호 대 잡음비와 앰프를 사용하고, AD의 입력에 연결한다.
주 : ABRS는 일반적으로 아래를 1 μV (피크 간) 매우 낮은 진폭을 가지며 매우 낮은 노이즈 증폭기를 사용하여 기록되어야한다. 그러나 고품질의 녹음을 얻기 위해, 200 응답, 또는 청각 장애의 경우, 더 많은 반복은 (750-1,000) (27)을 추천합니다 - 정상 청력 쥐에서 분명 ABR 파도 (100)를 평균 한 후 등장. - 육안 검사시 ABR 임계 값을 결정합니다.
참고 : ABR 임계 값은 I IV 명확하게 보이는 중간 피크 - 투 - 피크 전압이 SD에 평균 백그라운드 작업 (31) 위의 파도 기록 신뢰할 수있는 ABR을 이끌어 가장 낮은 소리 자극의 강도입니다. 이 데이터는 뒤 확인해야합니다피크와 인터 대기 시간을 포함하여 다른 매개 변수와 함께 오프라인 분석을 링 및 진폭을 파. - 수동 또는 자동으로 데이터 분석을 수행합니다.
- 수동 분석을 위해, (나는, II, III ... 등.) 및 피크 (P1, P2, P3 ...) 계곡을 표시 4-5 ABR 파도를 식별 (N1, N2, N3 ...) 각 파. 분석은 스프레드 시트 또는 텍스트 파일로 내보내기 데이터를 완료되면.
참고 : 전기 응답 기록에 대한 특정 소프트웨어는 일반적으로 자동 분석을 수행합니다. 추가 측정은 고정 된 강도 (즉, 70 또는 80dB SPL) 또는 개별 클릭 임계 값 (임계 값 이상 즉 15dB SPL)에 대해 강도에 대한 응답으로 ABR 기록에서 확인할 수 있습니다.
- 수동 분석을 위해, (나는, II, III ... 등.) 및 피크 (P1, P2, P3 ...) 계곡을 표시 4-5 ABR 파도를 식별 (N1, N2, N3 ...) 각 파. 분석은 스프레드 시트 또는 텍스트 파일로 내보내기 데이터를 완료되면.
- 해당 소프트웨어를 사용하여 ABR 데이터의 통계 분석을 수행합니다. 실험 디자인에 따라 사용하는 표준의 주요 ABR parame과 비교 T 검정 또는 변동 (ANOVA) 분석 페어링다른 그룹 26, 30 TERS.
참고 : 종 연구에서 많은 기능 데이터 (즉, 이전과 미세 후) 다른 시간 지점에서 같은 동물로부터 수집된다. 이 경우, 일반 선형 모델의 반복 측정 시험 상세한 분산 분석을 제공한다.
3. 차량 준비
- 준비 및 멸균 조건 하에서 차량의 솔루션을 사용합니다.
참고 : 액체 솔루션은 일반적으로 유스타키오 관을 통해 신속하게 삭제됩니다. 다른 주사 전달 시스템은 하이드로 겔 나노 입자 (32)를 포함하는 중이에서 약물의 체류 시간을 증가시키기 위해 사용될 수있다.- , CGP-하이드로 겔을 준비합니다 1.5 % (중량 / 중량) 키토산 용액을 얻었다 0.2 M 아세트산 75 % 탈 아세틸 화 키토산을 용해합니다. 이 솔루션 7 9 % 글리세 (중량 / 중량)를 추가합니다. 솔루션을 준비다만 투여 전 및 사용까지 4 ° C에서 하이드로 겔을 저장합니다.
참고 : CGP-하이드로 겔이 온도에서 적당한 점성하지만 여전히 주사입니다. 4 ℃ 이하 그것의 응용 프로그램을 차단하고, 고상로 변경됩니다. 도포 후, CGP 37 ° C에서 약 15 분에서 반고체 겔 상전이를 겪는다. - 사용까지 4 ° C에서 나누어지는 (0.5 ㎖) 상업 RL 버퍼 및 저장.
- , CGP-하이드로 겔을 준비합니다 1.5 % (중량 / 중량) 키토산 용액을 얻었다 0.2 M 아세트산 75 % 탈 아세틸 화 키토산을 용해합니다. 이 솔루션 7 9 % 글리세 (중량 / 중량)를 추가합니다. 솔루션을 준비다만 투여 전 및 사용까지 4 ° C에서 하이드로 겔을 저장합니다.
4. 미세 수술 절차
- 흡입 제제 (예 : 이소 플루 란) 다음에, 진정제 및 진통제의 케타민 기반의 조합 (예 케타민 100 ㎎ / ㎏, 메데 토미 0.05 ㎎ / ㎏과 0.025 ㎎ / ㎏ phentanile) 복강 내 주사하여 전신 마취를 유도한다.
- 주 사용 제제를 투여 한 후, 마우스 주둥이에 마취 안면 마스크를 조정하고 이소 플루 란 증기로 O 2 공급 장치를 연결합니다. 동안 흡입 마취 유지미세하고는 발가락 - 핀치 반사와 호흡 패턴 마취 비행기를 모니터링 할 수 있습니다. 반사적 완전히 폐지하고 마우스를 정기적으로 호흡을 제시 할 때 수술 준비를 시작합니다.
- 전체 과정 동안 가열 패드 본체의 온도를 유지하고, 히드 록시 프로필 메틸 셀룰로스 계 겔 각막염, 각막으로부터 눈을 보호한다.
- 멸균 커튼을 사용하여 깨끗한 수술 영역을 준비합니다. 수술 전에 유리 비드 살균기로 미세 수술기구를 소독. 전체 수술시 무균 조건 (멸균 장갑, 커튼, 수술 도구 등)을 유지한다.
- 미세
- Bullostomy
참고 : Bullostomy는 일방적 인 절차입니다. 마우스 하나 귀를 작동 및 제어로 반대측 귀를 사용합니다.- 욕창 부정사 위치에 마우스를 놓습니다. 에 가위를 사용하여 목의 복부 표면에서 수술 영역을 준비모피를 제거합니다. 포비돈 요오드를 기반으로 소독액으로 피부를 청소하고, 멸균 커튼으로 커버.
- 메스를 사용하여 쇄골에 하악에서 2cm 세로 절개를합니다.
- 수술 현미경의 배율에 따라, 턱밑 샘을 파악하고 집게로 모두 분리합니다. 턱밑 샘을 철회하고 digastric 근육의 기원과 안면 신경을 지역화.
- 고막 수포의 기본 열등-내측 측면을 노출, 가위로 digastric 근육의 기원에 절개를하고, 복부를 수축.
- 27 G 바늘 (그림 2A)와 그것으로 시추에 의해 수포에 개구부를 확인합니다. stapedial 동맥과 RW 막 꼬리 그것 (그림 2B)를 로컬 라이즈. 흡수성 젤라틴 스폰지 드릴 영역에서 혈액을 청소합니다.
- 34 G 카테터와 유리 마이크로 주사기를 사용하여 서서히 주입 3-5 μRW의 틈새 상에 직접 bullostomy을 통해 차량 용액 (CGP-하이드로 겔 또는 RL)의 L, 그것은 (그림 2C)를 작성합니다. 조직 접착제의 1-2 방울 bullostomy를 밀봉.
- 초기 위치로 턱밑 샘을 돌아 5-0 실크 수술 봉합과 피부 절개를 닫습니다. 클로르헥시딘 기반 피하기 위해 절개 주위 살균 상처 감염을 적용합니다. 주 : 흡수성 및 비 흡수성 봉합사가 사용될 수있다. 비 흡수성 봉합사 2 주에 제거해야합니다. 그것의 사용은 절개 감염과 지역 조직 반응과 연관되어 있기 때문에 실크는 피부 폐쇄하지 않는 것이 좋습니다.
- 양측 transtympanic 주입
- 횡 욕창 위치에 마우스를 위치시키고 4.3.1.1에서 설명한 바와 같이 외이도 (外耳道) 아래 무균 수술 영역을 준비한다.
- tragus 및 S 부근 외이도의 수직 부분의 길이는 0.5 cm 절개를(선택 사항) 날개의 내부 피부 배 ection.
- 수술 현미경 (그림 2E)를 사용하여 외부 외이도의 끝에서 고막을 찾아 추골의 손잡이 전방 및 후방 섹션으로 나누어 져 상부 갈 거예요 flaccida 및 하부 동위 tensa을 식별한다 (그림 2 층) .
- 갈 거예요의 flaccida의 꼬리 부분에있는 작은 myringostomy합니다. 주입 33시 공기 배출 할 수 있도록, 고막의 동위 tensa에 추가 절개를합니다. 부드럽게 차량의 10 ~ 15 μL (CGP-하이드로 겔 또는 RL) 중이 명확하게 가득 찰 때까지 RW 틈새에 가까운 동위 flaccida를 통해 34 G 카테터에 연결 유리 마이크로 주사기와 솔루션을 주입.
- 4.3.1.7에 설명 된대로 5-0 실크 수술 봉합으로 피부 절개를 닫고 청소.
- 그 다른 쪽과 운영자에 마우스를 놓습니다반대측 귀를 먹었다 (4.3.2.5 4.3.2.1-에 단계).
- Bullostomy
- 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 가열 패드에 마우스를 유지합니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다.
- 신체 조건, 활동 및 통증이나 스트레스의 징후의 존재를 모니터링합니다. 필요한 경우 진통제를 제공합니다 (즉, 부 프레 놀핀 0.05 ㎎ / ㎏, 카프로 펜 5 ~ 10 ㎎ / ㎏). 매일 수술 상처를 검토하고 수술 후 상처가 치유되었는지 확인 후 피부 폐쇄를 7-14일를 제거합니다.
인공 와우 Cytoarchitecture 5. 형태 학적 평가
- 수술의 장기간 효과를 연구하기 위해 과량 복강 내 펜토 바르 비탈 (100 ㎎ / ㎏)을, (이 작업 이십팔일의 postmicrosurgery)에서 실험의 끝에서 마우스를 안락사.
- 차가운 0.1 M 인산 버퍼와 transcardial 관류를 수행0.1 M PBS로 4 % (중량 / v)의 파라 포름 알데히드 (PFA)이어서 식염수 (PBS), pH를 7.5, 7.5의 pH를 26로 기재.
주의 : 파라 포름 알데히드는 매우 독성; 피부, 눈 또는 점막과의 접촉을 피하십시오. 측정 및 준비 중에 분말을 흡입하지 않도록. - 전정 및 내이의 달팽이관 구성 요소를 분리하지 않고 34, 35 설명 된대로 측두골에서 내 귀를 해부 실체 현미경을 사용합니다.
- 부드러운 흔들림과 함께 12 시간 동안 4 ℃에서 0.1 M PBS, pH를 7.5에서 4 % (중량 / v)의 PFA와 분리 된 내부 귀를 수정합니다. 0.1 M PBS, pH를 7.5으로 5 분 동안 세척 배.
- EDTA 용액마다 세 D 변경 일정한 교반과 함께 10 일 동안 4 ℃에서 0.1 M PBS, pH를 6.5로 제조 한 10 % 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)과 샘플 석회.
- cochleae 부드러운 일관성을 취득하는 경우, EDTA를 제거하고 0.1 M PBS, pH를 7.5, 위스콘신과 5 분 동안 배를 씻어RT에서 진탕 일.
- 설명 (34) 파라핀 왁스의 샘플을 포함, 7 μm의 두께 인공 절에서는 modiolus 평행합니다.
- 인공 와우 cytoarchitecture, 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 30 얼룩 부분을 평가하고 4 배 및 20 배 렌즈와 이미지를 캡처하는 디지털 카메라에 연결된 광학 현미경을 사용합니다.
6. 인공 와우 유전자 발현
- 의 RNAse 오염 제거 용액과 함께 작업 표면 및 수술 도구를 청소합니다.
- 현미경을 사용하여 측두골에서 내 귀를 해부 신속 5.1에서 설명한대로 마우스를 안락사. 리보 산 (RNA) 보호 및 안정 화제를 포함하는 유리 접시에 내 귀를 담가.
- 보석 집게로 남아있는 추체 뼈를 제거하고 부드럽게 Vanna의 눈 가위 (35)를 사용하여 현관에서 달팽이관을 분리합니다.
- 즉시 TRANSFER 80 μL RNA 보호 및 안정화 용액과 2 용액을 마이크로 원심 튜브에 달팽이관과 드라이 아이스 튜브를 배치하여 조직을 동결. 사용할 때까지 -70 ℃에서 인공 와우 샘플을 보존합니다.
- (35) 설명에 따라 인공 RNA를 분리하고 분광 광도계의 질과 양을 결정합니다.
- 역전사 상업 키트를 사용하여 총 마우스 RNA의 동일한 양에서 인공 와우의 cDNA를 생성합니다.
- 유전자 전 사체 (35), (36)을 측정하는 중으로 보완 디옥시리보 핵산 (cDNA를)를 증폭하기 위해 QRT-PCR을 수행합니다.
참고 :이 작업 프로와 Il1b, IL6, Tgfb1, 된 TNFa-, IL10 및 Dusp1의 항 염증 유전자 전 사체에서 측정 하였다. - 기준 유전자 레벨의 산술 평균과 정상화 상대적인 정량 타겟팅 사체 사이클 역치 (CT) 레벨을 정규화하여 상대적인 발현 비율을 계산문제 그룹 교정기 그룹 (37)의 산술 평균에 대한 성적 수준.
Representative Results
청각은 청각 기능 (그림 1A)에 미치는 영향을 평가하기 위해 미세 후 전 ABR에 의해 여러 번에 시험 하였다. ABR 레지스터 동물 이동 전압 아티팩트를 방지하고, 따라서 27 재현성을 개선하기 위해 마취 하에서 수행 하였다. 복강 케타민을 기반으로 조합 투여 또는 흡입 성 이소 플루 란 일반적으로 ABR 테스트 동안 동물을 마취하기 위해 사용되었다. ABR 레지스터를 수행하는 동안 케타민 / 자일 라진 조합은 속효성 (2-3 분) 유도 안정된 안전 유지 단계를 제공한다. 이는 이소 플루 ABR은 측정 감도 (38)에 영향을 미칠 수 있음을 유의해야한다. ABR 레지스터를 들어, 피하 전극을 특정 위치 (도 1b)에 배치하고, 온 저항을 측정한다. 임피던스 3 킬로 옴 이상인 경우, 전극의 위치는 ALT 않도록 확인해야ABR 파의 진폭이 작 동.
고 실내 배달이 미세 수술 절차 (그림 2)에 의해 쥐에서 수행된다. bullostomy 동안 수포의 노출은 턱밑 샘과 digastric 근육의 수축을 포함한다. 경동맥과 미주 신경이 매우 가까이 (그림 2A)이기 때문에이 절차는 극도의주의를 실시한다. 다음으로, 수포는 stapedial 동맥과 RW 막 (그림 2B)를 국산화 드릴된다. 뼈를 균열 방지하기 위해 작은 0.5 mm의 구멍을 드릴링하기 전에 27 G 바늘로 이루어집니다. 34 G 카테터가 RW 멤브레인과 차량의 소량 향해 bullostomy 통해 지향 창 틈새 (도 2c)에 전달된다. transtympanic 주입은 동위에 절개를 통해 수행되는 27 G 바늘 고막의 flaccida; 에서 도발 할 수있는 더 큰 하나막 귀. 주입 전에, 차량 (도 2F)의 주입시에 공기의 유출을 허용하는 동위 tensa의 추가 절개을 권장합니다. 생명을 위협하는 출혈로 이어질 것 stapedial 동맥, 경동맥의 분지의 손상을 방지하는 것이 중요합니다.
비 작동 컨트롤 (그림 3)과 유사한 실험을 통해 청력을 보존 bullostomy 또는 transtympanic 수술과 마우스. 클릭과 톤 버스트에 응답하여 ABR 임계 값을 기준 값에 비해 미세 이후 크게 변화하지 않았다. 유의 한 차이는 bullostomy 및 transtympanic 접근 방법 사이에 관찰되지 않았다. 형태 학적 연구 중이 내로 정확한 차량 전달을 확인하고 인공 cytoarchitecture의 절차에 의한 전위의 변화를 평가하기 위해 수행 하였다. 주 인공 와우 지역의 해당 사항 없음모두 절차에서 howed 형태 변경과 동물 모두 인공 구조물 (그림 4A)의 유사한 형태를 제시했다. 또한, 프로 및 항 염증 사이토 카인 유전자 발현을위한 인공 프로필은 연구 하였다. 두 절차 사이의 ABR 데이터의 기능상의 차이의 부족에도 불구하고, bullostomy는 transtympanic 방법 (그림 4B)보다 강한 염증 반응을 일으키는 원인이되었다.
그림 1. 실험 설계 및 청력 평가. 실험 절차 (A) 다이어그램. 청력은 이전과 미세 후 ABR으로 평가 하였다. 인공 샘플 이십팔일 미세 후에 얻었다. (B) 피하 electrod와 사운드 감쇠 챔버 내부의 가열 패드를 통해 발생하기 쉬운 위치에 마취 마우스,두개골 (활성, 긍정적 인)의 정점에 걸쳐 귀 사이에 두피에 배치 에스; 귓바퀴 (참조, 음수) 아래 이하선 지역과 백 (접지)입니다. 무료 필드 스피커는 오른쪽 귀를 향하도록 고정 된 거리 (5cm)에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
차량 적용을위한 그림 2. 미세. (A)가 고막 수포의 복부보기. bullostomy는 27 G 바늘 안면 신경에 꼬리 수행된다. (B) 및 RWN stapedial 동맥 천공을 통해 관찰 될 수있다. (C) 34 G 카테터 RW 틈새 향해 bullostomy 통해 관한 것이다. (D)를 bullostomy 후 한 달, 작은 뼈상처가 개방 위치 (화살표)으로 존재한다. 외이도의 절개와 고막 (사각형)을 보여주는 (E) 귀 측면보기. 고막의 (F) 세부 사항. 펑크는합니다 (갈 거예요 flaccida에, 검은 색 별표) 27 G 바늘을 사용하여 고막의 꼬리 윗부분에 만들어졌다; 주입은 34 G 카테터를 사용하여이 구멍을 통해 만들어졌다. 추가 구멍이 고막 압력의 균형을 주입하기 전에합니다 (갈 거예요 tensa에, 흰색 별표) 멤브레인의 두개골 하부 사분면에 만들어졌다. 고막의 구멍을 통해 34 G 카테터의 (G)보기. 미세 후 인공 와우 지역에서 24 시간의 (H)보기. RWN 차량 용액 (별표) 가득합니다. 측면, 북위; 롬, 주동이; , 등의 작업을 수행; 엄마, 추골; 공동 달팽이관; OW, 타원형 창; RWN, 둥근 창 틈새. 스케일 바 = A, D, F 200 μm의; 스케일 바 = 100 B, C, H에서 μm의; 스케일 바 = E 1,000 μm의, G.는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 청력 평가 그림. ABR 임계 값 (dB SPL에서 ± SEM을 의미) 응답의 진화는 클릭 (A) 및하기 톤 버스트 (B) 자극, 남성 팔 주령 C57BL / 6J의 마이크로 수술 후 14, 28 일 전 (7) 마우스. Bullostomy (오렌지, N = 11); transtympanic 주입 (파란색, N = 6); 비 작동 (회색, N = 11), 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 4. 인공 와우 형태학 및 유전자 발현 분석. 달팽이관의 기지에서 주 인공 구조물 (A) 형태론. 일개월 bullostomy 또는 transtympanic 주입하여 미세 개입 후 중간 modiolar 파라핀 비 작동 마우스의 귀 부분 (7 μm의), 그리고 마우스의 Haematoxilin - 에오신 염색. 스칼라 미디어 실의 (A, B는 C) 모든 주요 구성 요소를 제공합니다. 이러한 구조 (번호 상자)의 각각의 세부 사항은 다음 이미지에 나와 있습니다 나선 신경절 (1), 코르티 기관 (2), 나선형 인대 (3) 맥리의 vascularis (4). 내부 헤어 셀 (별표) 외부 유모 세포 (화살표 머리). 스케일 바 = A, B, C에서 100 μm의; 스케일 바는-1,2,3,4 50 μm의 =. (B) 28 D를 미세 후 염증 마커의 인공 와우 식입니다. bullostomy (오렌지)와 transtympanic 주입 (파란색) 사이의 비 작동 마우스 (흰색)에 비교. * 비 작동 대운영 그룹; ^ : 운영 그룹 간의 비교. ΔΔCt 또는 비 작동 group.Values에 N 배의 차이가 상대적으로 조건 당 3 마우스의 풀 샘플로부터 삼중의 ± SEM 의미로 표현된다 - 유전자 발현 수준은 2로 표현된다. 통계적 유의성 : ** P는 ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ 페이지 ≤0.01; ^^^ P는 ≤0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
내 귀에 지역 약물 전달은 중이 4, 19, 39 약물을 배치, 고 실내 투여에 의해 직접 intracochlear 주사 또는 간접적으로 수행 할 수 있습니다. Intracochlear 투여는 기저 대 정점 농도 기울기 및 클리어런스 유스타키오 관을 통해 창구 막을 통해 확산을 방지하고 통제 달팽이관 정확한 약물 전달을 제공한다. 그러나, 복잡하고 섬세한 미세 7 (39)이 필요한 높은 침습적 보통이다. 이러한 맥락에서, 산업은 지속적인 약물 방출 (40), (41)에 대한 새로운 코팅, 이식 장치를 개발하고있다. 한편, 고 실내 투여는 (D)의 큰 볼륨의 주입을 허용하는 최소 침습 및 수행하기 쉬운 절차약동학은 제어가 용이하지 않지만, 중이로 깔. 약물의 대부분은 유스타키오 관을 통해 클리어하고, 나머지 부분은 달팽이관 (18)에 도달하기 RW 막을 통해 확산한다. RW는 달팽이관 (7)의 외 림프 가득 고막 덕트에 중간 귀에서 물질의 최대 흡수의 사이트입니다. 투과성이 약물 특성 (크기, 농도, 용해도 및 전하)과 트랜스 교통 시스템 (확산, 능동 수송 또는 탐식) (42)에 의존하지만 그것은 반투과성 세 층 구조이다. 타원형 창 귀 캡슐은 달팽이관 (43), (44)에 대한 대안하지만 덜 효과적 입구입니다.
여기에 우리가 입증하고 표적 약물 마우스 중이로 전달을위한 두 개의 미세 수술 방법 비교 : bullostomy 및 transtympa을NIC 주입 절차. 이러한 절차에 대한 일반적인 중요한 단계를 포함한다 : I) 심리 평가 전과 미세 후, II)를 멸균 조건 하에서 균일 비히클 용액의 조제, ⅲ) 마취 절차 동물 체온 상수 모니터링주의 감독 IV 분자량 및 형태 학적 분석을 완료하기 위해 인공 샘플을 채취) 느린 RW 타겟팅 차량의 해당 볼륨의 배치 및 IV).
bullostomy위한 Retroauricular 복부 접근법, 45 (7)를 설명 하였다. 우리의 경험에 덜 병적 가져왔다과 RW (46)에 더 나은 액세스를 제공하기 때문에 우리는 복부 근사치를 사용했다. Transtympanic 주사는 일반적으로 동위 고막의 tensa을 통해 수행, 추골의 흉골 (12)에 전방 또는 후방. 에서이 작품은 우리가 주입시 공기 배출을 허용하도록 동위 tensa의 이전 추가 구멍과 추골 넘어 갈 거예요의 flaccida을 통해 기술, 주입의 변형을 수행 하였다.
모두 microsurgeries 빠른 (bullostomy 각각 transtympanic 접근 귀 당 20 및 5 분)이었다 있지만 transtympanic 주입은 짧은 수술 후 회복 시간없이 병적으로는 bullostomy보다 덜 침습적했다. 가장 중요한 두 절차 청각 유지되고 ABR 파라미터는 미세 전에 결정된 것과 동일 하였다. transtympanic 방법은 bullostomy보다 시간이 덜 걸리며 같은 개입 동안에 동일 동물의 양쪽 귀에서 수행 될 수있다. transtympanic 분사의 이점 필요한 경우는, 좌우 반복 수행 될 수 있음을 포함된다. 한편, RW bullostomy는 멤브레인에 직접 시각 액세스를 제공하고 filli 허용RW의 틈새의 NG. 반면, transtympanic 주사는 RW 틈새 차량 위치의 제어를 허용하지 않습니다.
이 연구에서보고 된 절차는 청력에이 독성 및 효능 평가의 평가로 사전 임상 응용 프로그램에 대한 중간 귀에 지역 약물 차량 전달을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 두 미세 절차는 특정 장점과 단점에 다른 방법을 제공하는 기술되어있다. 모두 청력 보존 및 형태 학적 변화가 발생하지 않습니다. 로컬 염증 bullostomy의 전위 합병증으로 설명한다. 보완 기술의 집합은 청각, 형태 학적 및 염증 마커 발현 평가를 포함하여 수술 후 절차에 대해 설명합니다. 이러한 기술에 대한 미래의 응용 프로그램은 동물 모델에서 유전자 세포 및 약물 학적 접근 방법을 포함하여 손실, 청각에 대한 새로운 치료법의 임상 평가를 포함한다. 고 실내의 administrat이온은 분명 인공 손상없이 외 림프로 통과를 용이 원형 창 막과 접촉, 중이에서의 치료의 전달을 보장한다.
Acknowledgments
저자는 기술 지원을위한 유전체학 및 비 침습 신경 기능 평가 시설 (IIBM, CSIC-UAM)을 감사드립니다. 이 작품은 스페인 "Ministerio 드 Economia y를 Competitividad"(FEDER-SAF2014-53979-R) 및 유럽 연합 (FP7-AFHELO와 FP7-PEOPLE-TARGEAR) IVN에의 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
| Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
| Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
| Water pump | Gaymar | # TP472 | |
| Surface disinfectant | José Collado SA | # CR-36 | |
| Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
| Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
| Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
| System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
| Statistics software (SPSS) | IBM | ||
| Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
| Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer |
| Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
| Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
| Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
| Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h. |
| Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
| Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
| Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
| Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
| Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
| Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
| Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
| Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
| Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
| Microlance 27 G | Becton Dickinson | # 302200 | |
| Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
| Catheter (Microfil 34 G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
| Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
| Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
| Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
| Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
| Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
| Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
| Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
| RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
| RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
| Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
| cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
| Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
| Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |
References
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