Abstract
Vi presenterar två minimalt invasiva mikrokirurgisk teknik i gnagare för specifik läkemedelstillförsel i mellanörat så att den kan nå innerörat. Det första förfarandet består av perforering av trum bulla, benämnd bullostomy; den andra en är en transtympanic injektion. Båda efterlikna humana kliniska intratympanic förfaranden.
Kitosan-glycerofosfat (CGP) och Ringers Laktat buffert (RL) användes som biokompatibla fordon för lokal läkemedelstillförsel. CGP är en icke-toxisk biologiskt nedbrytbar polymer används allmänt i farmaceutiska tillämpningar. Det är en viskös vätska vid rt men det stelnar till ett halv fast fas vid kroppstemperatur. RL är en isoton lösning som används för intravenösa administreringar hos människor. En liten volym av detta fordon är exakt placerad på det runda fönstret (RW) nisch medelst en bullostomy. En transtympanic injektion fyller mellanörat och ger mindre kontroll men bredare tillgång till innerörat.
Båda förfarandena är lämpliga som läkemedelsleveransmetoder i musen mellanörat, även om transtympanic injektion visade sig vara mindre invasiva jämfört med bullostomy.
Introduction
Hörselnedsättning är den vanligaste mänskliga sensorisk underskott och drabbar 5,3% av befolkningen i världen, och 30% av personer över 65 års ålder ( http://www.who.int/topics/deafness/en , uppdaterad 2016). Hörselnedsättning påverkar språkinlärning hos barn och accelererar kognitiv försämring hos äldre människor. Därför är det en betydande hälsovårdsproblem med en enorm socioekonomiska effekterna. Det kan orsakas av genetiska defekter, miljöfaktorer eller en kombination av båda 1, vilket i slutändan inducera skador och död av hårceller och neuroner i snäckan. Dessa celler inte regenerera i däggdjur, därför inte kan vändas cellförlust och samtidig hörselnedsättning. Kliniska alternativ baseras på proteser, inklusive hörapparater och cochlea, mellanörat och benledning implantat 2. Tyvärr finns det ingen specifik medicinsk reparativ treatments för hörselskada och därmed flera forskningslinjer är inriktade på utveckling av förebyggande och reparativa terapier. Nya behandlingsalternativ inkluderar gen- och cellterapi samt utveckling av små molekyler för farmakologisk behandling 2.
En av de viktigaste utmaningarna i cochlea farmakologisk terapi är drug delivery. Systemiska behandlingar har begränsad effekt i snäckan på grund av blod-labyrint barriär 3, kontinuerlig endotel i kontakt med cochlea blodkärl, som fungerar som en fysisk och biokemisk barriär för att bibehålla innerörat fluid homeostasis, därför begränsar läkemedelspassage till innerörat. Det är genomträngligt endast för små fettlösliga molekyler, även om permeabiliteten kan höjas under cochlear inflammation, och även med användning av diuretika eller osmotiska medel. Ut mängden läkemedel som så småningom når snäckan efter systemisk administrering reduceras;Därför är höga doser som kan orsaka ekologisk toxicitet krävs. Dessutom kan levermetabolism av läkemedlet ge upphov till toxiska eller inaktiva metaboliter 4, 5, 6, 7. I kontrast, lokala interventioner tillåta placering av en känd begränsad mängd av läkemedlet i mitten eller innerörat utan oönskade biverkningar 4, 7, 8, 9. I nuvarande klinisk praxis, är intratympanic förvaltningar begränsade till vissa hörsel patologier, såsom gentamicin i Ménières sjukdom 10, kortikosteroider i plötslig dövhet, Ménières sjukdom, immunmedierad och buller hörselnedsättning, 11, 12, 13, en4, 15 och insulinliknande tillväxtfaktor 1 (IGF1) i plötslig dövhet 4, 16, 17.
Formuleringar för lokal administrering bör bevara den känsliga homeostas (pH och osmolaritet) av cochlea vätskor. Dessutom är det mycket viktigt för att upprätthålla sterilitet under hela processen för att undvika bakteriell kontaminering av cerebrospinalvätskan. Hjälpämnet som används för läkemedelsadministrering bör vara biokompatibla, icke-ototoxisk och lämplig konsistens. Flytande lösningar rekommenderas för intracochlear injektioner, men är inte lämpliga för den intratympanic vägen på grund av spelrummet genom örontrumpeten. I detta fall, är droger vanligen bärs av halvfasta geler för att öka deras beständighet i mellanörat 4, 18, 19. Alternativ leverans systems som används som bärare för att öka passagen av läkemedlet till innerörat är nanopartiklar 20 och adenovirus 21 Här jämförde vi två fordon: CGP och en RL-lösning. CGP är en hydrogel som bildas av chitosan, en linjär polysackarid som består av D-glukosamin och N-acetyl-D-glukosamin som erhålls från kräftdjursskal, och β-glycerofosfat, en polyol som bildar en sköld vattnet runt kitosan kedjorna och bibehåller den i flytande form. CGP är termokänslig och kan brytas ned av lysozymer, som tillåter en fördröjd frisättning av läkemedel i mellanörat 22, 23, 24, 25. Chitosan-bas hydrogeler är lämpliga vehiklar för kliniska tillämpningar såsom tillförsel av läkemedel på grund av deras brist på immunogenicitet och brist på aktivering av lokala inflammatoriska reaktioner 23, 24. På othER sidan är RL-buffert en icke-pyrogent isoton lösning (273 mOsm / L och pH 6,5) avsedd för intravenös användning i människor som en källa av vatten och elektrolyter, speciellt i blodförlust, trauma eller brännskador på grund av att biprodukter av laktat metabolism i levern motverka acidos.
Här beskriver vi och jämföra två kirurgiska metoder som har förfinats för lokal läkemedelstillförsel till musen innerörat. Säkerhetsprofilen för båda teknikerna utvärderades med hjälp av funktionella, morfologiska och molekylära tester. Höra utvärderades med hjälp av Auditory hjärnstammen svar (ABR) 26, 27 utförs före och efter mikro vid olika tidpunkter. Slutpunkts procedurer användes för att dissekera snäckan och jämföra anatomiska, cell- och molekylär effekten av dessa två mikro förfaranden.
Protocol
Se till att de procedurer djur är i enlighet med internationella och nationella bestämmelser. Protokollet följer Europeiska gemenskapen 2010/63 / EU och spanska RD 53/2013 riktlinjer, respektive.
1. Allmänt Animal Hantering
- Foder möss ad libitum med en standarddiet och dricksvatten. Kontroll hälsa och välbefinnande genom att följa Federation för försöksdjursvetenskap föreningar (FELASA) rekommendationer.
Bedömning 2. Utfrågning
OBS: Spår funktionella effekterna av mikro förfaranden genom att testa hörseln före och många gånger efter operationen (i detta arbete 2, 7, 14 och 28 d postmicrosurgery) med icke-invasiva procedurer såsom ABR 9.
- För ABR-testning, söva möss med kortvariga effektprotokoll dvs. intraperitoneal injektion av ketamin (100 mg / kg kroppsvikt (BW) och xylazin (10mg / kg, BW). Alternativt, utföra hörseltest i inhalant anestesi.
OBS: Eftersom ABR parametrar kan påverkas av bedövningsmedel protokoll 28, använda samma en under hela experimentet. - Kontrollera djupet av anestesi genom att testa toe-nypa reflex.
OBS: När tillbakadragande reflex försvinner, har djuret nått en lämplig anestesidjupet för att utföra hörseltester. - Skydda ögonen från uttorkning och sekundär keratoconjunctivitis sicca genom lokal administrering av tår tillskott, såsom hydroxipropylmetylcellulosa baserade geler.
- Håll musen vid fysiologisk temperatur (37,5-38 ° C) under hela proceduren. För att undvika elektriska störningar, använd en varm vattenpump och värmedynor. Övervaka kroppstemperaturen med rektala sonder. Ta alltid noga med att inte överhetta djuret.
OBS: Vi rekommenderar att rengöra värmedyna med en yta desinfektionsmedel mellan möss.0; För anestesi induktion och återhämtning, elektriska värmedynor, glödlampor eller infrarött ljus kan användas. - ABR förfarande
OBS: För ABR registrering, använda en dator arbetsstation med en inre ljudkort för att skapa vågformer (digital till analog, DA utgång, omvandling) och digitalisera elektriska svars vågformer (analog till digital, AD ingång), en dämpare, ett oscilloskop och en låg impedans förstärkare. Moderna hörsel arbetsstationer (dvs. Tucker Davis Techonologies) omfattar alla dessa komponenter i ett enda kompakt system.- Placera sövda musen i liggande ställning på värmedynor inom en ljuddämpande kammaren för att undvika omgivande ljud störningar och efterklang (Figur 1).
- Leverera akustiska stimuli i den yttre hörselgången. Använd förinställda stimuli eller nya signaler utformade med lämplig mjukvara. Koppla utgång DA arbetsstation till den valda högtalaren.
OBS: FreE-fält eller stängd-fält högtalare införda i den yttre hörselgången skulle kunna användas. Den förstnämnda är att föredra när man arbetar med möss på grund av svårigheten att sonden insättning och ljudkalibrering i slutna system. Fritt fält högtalare stimulera båda öronen och framkalla en binaural svar. För att få övervägande mono svar med fritt fält högtalare har kontra aktivitet elimineras genom ocklusion (dvs med proppar) eller genom att maskera bullret.- Placera fritt fält talare vid ett fast avstånd (vanligen 5-20 cm) som vetter mot huvudet eller valt öra med centrum för högtalaren i linje med den yttre hörselgången. Säkerställa att inga hinder finns mellan högtalaren och örat, och att ytterörat är helt öppen.
- Placera rostfritt stål subdermala nålelektroder enligt följande: i) den aktiva (positiva) elektroden i hårbotten mellan öronen (över vertex av skallen), ii) Referens (negativ) elektrod, i parotisområdet nedanför ytterörat, och iii) jordelektroden i ryggen, svans eller bakbens region (Figur 1).
- Kontrollera den elektriska impedansen i de positiva och negativa elektroderna. Se till att impedansen är mindre än 3 kOhm (idealt 1 kOhm). Om det är högre, flytta, ren med alkohol eller byt elektroderna.
- För ABR inspelning, generera bredbands klick och rena tonfrekvenser och närvarande vid avtagande intensiteter 90-10 dB i förhållande till ljudtrycksnivån (SPL) i 5-10 dB SPL steg 27, 29, 30.
- Present kort klick eller ton brast stimuli (1-5 ms) börjar med hög nivå (dvs. 80 eller 90 dB SPL) och minska intensiteten i 5-10 dB SPL steg. Registrera den elektriska responsen i de första 10 ms efter stimulering (framkallade ABR svar visas på 6-8 ms).
OBS: För denna anledning, stimulering priserbör inte vara högre än 50 stimuli / s (normal ränta 20-50).
- Present kort klick eller ton brast stimuli (1-5 ms) börjar med hög nivå (dvs. 80 eller 90 dB SPL) och minska intensiteten i 5-10 dB SPL steg. Registrera den elektriska responsen i de första 10 ms efter stimulering (framkallade ABR svar visas på 6-8 ms).
- Amplify, spela in och i genomsnitt den framkallade elektriska svar på varje stimulus och intensitet. Använd en förstärkare med lågt brus och en bra signal-brusförhållande, och anslut den till AD ingång.
OBS: ABRS har mycket låga amplituder, typiskt under 1 μV (topp-till-topp) och skall registreras med hjälp av en förstärkare med mycket låg ljudnivå. I normalhörande möss, tydliga ABR vågor fram efter i genomsnitt 100 - 200 svar, men för att få högkvalitativa inspelningar, eller i fallet med hörselnedsättning, fler repetitioner rekommenderas (750-1,000) 27. - Visuellt bestämma ABR tröskel under testet.
OBS: ABR tröskel är den lägsta ljudstimuli intensitet som framkallar en tillförlitlig ABR inspelning med vågor I-IV klart synlig och medel topp-till-toppspänning två SD över medelvärdet bakgrundsaktiviteten 31. Dessa data har inte bekräftats during off-line analys, tillsammans med andra parametrar, bland annat topp och Inter latens, och vågsamplituder. - Utför dataanalys antingen manuellt eller automatiskt.
- För manuell analys, identifiera 4-5 ABR vågor (I, II, III ... osv.) Och markera topparna (P1, P2, P3 ...) och dalar (N1, N2, N3 ...) för varje våg. När analysen är klar, exportera data till kalkylark eller en textfil.
OBS: Specifik programvara för elektriska svaret inspelning utför vanligtvis analysen automatiskt. Ytterligare mätningar kan bestämmas i ABR inspelningen som svar på en fast intensitet (dvs. 70 eller 80 dB SPL) eller vid intensiteter i förhållande till individuella klick tröskelvärden (dvs 15 dB SPL över tröskelvärdet).
- För manuell analys, identifiera 4-5 ABR vågor (I, II, III ... osv.) Och markera topparna (P1, P2, P3 ...) och dalar (N1, N2, N3 ...) för varje våg. När analysen är klar, exportera data till kalkylark eller en textfil.
- Utföra statistiska analyser av ABR data med hjälp av lämplig mjukvara. Beroende på experimentell design, använda standard parade T-test eller variansanalys (ANOVA) för att jämföra huvud ABR Paramegor i de olika grupperna 26, 30.
OBS: I longitudinella studier, många funktionella data som samlats in från samma djur vid olika tidspunkter (dvs före och efter mikrokirurgi). I detta fall ger en allmän linjär modell upprepas åtgärd testa en detaljerad variansanalys.
3. Fordons Framställning
- Bereder och använder fordonslösningar under sterila betingelser.
OBS: Flytande lösningar är oftast rensas snabbt genom örontrumpeten. Olika injicerbara tillförselsystem skulle kunna användas för att öka uppehållstiden av läkemedlet i mellanörat, inklusive hydrogeler och nanopartiklar 32.- För att framställa CGP-hydrogel, upplösa 75% deacetylerat kitosan i 0,2 M ättiksyra, vilket gav en 1,5 till 2% (vikt / vikt) kitosanlösningen. Lägg 9% glycerofosfat (vikt / vikt) till denna lösning 7. Bered lösningenstrax före administration och lagra hydrogel vid 4 ° C fram till användning.
OBS: CGP-hydrogelen är måttligt viskös men fortfarande injicerbar vid denna temperatur. Under 4 ° C den ändras till en fast fas, blockerar dess tillämpning. Efter applicering, CGP undergår en fasövergång till en halvfast gel i ca 15 min vid 37 ° C. - Alikvot (0,5 ml) kommersiell RL buffert och förvara vid 4 ° C fram till användning.
- För att framställa CGP-hydrogel, upplösa 75% deacetylerat kitosan i 0,2 M ättiksyra, vilket gav en 1,5 till 2% (vikt / vikt) kitosanlösningen. Lägg 9% glycerofosfat (vikt / vikt) till denna lösning 7. Bered lösningenstrax före administration och lagra hydrogel vid 4 ° C fram till användning.
4. Mikrokirurgiska Förfaranden
- Inducera narkos med ketamin baserade kombinationer av lugnande medel och smärtstillande medel (dvs. ketamin 100 mg / kg, medetomidin 0,05 mg / kg och phentanile 0,025 mg / kg) genom intraperitoneal injektion, följt av inhalant medel (dvs. isofluran).
- Efter att administrera injicerbara medel, justera anestesiansiktsmasken till musen nos och anslut O2 tillförseln till isofluran ånga. Bibehålla inhalationsanestesi undermikro och övervaka anestesi plan med toe-nypa reflex och andningsmönster. Börja kirurgisk förberedelse när reflexen är helt avskaffats och musen ger regelbunden andning.
- Upprätthålla kroppstemperaturen med värmedynor under hela proceduren och skydda ögonen från hornhinnan keratit med en hydroxipropylmetylcellulosa-gel.
- Förbered en ren operationsområdet med sterila dukar. Sterilisera mikrokirurgiska instrument med ett glas-pärla autoklav före operation. Bibehålla sterila förhållanden under hela kirurgiska ingrepp (sterila handskar, draperier, kirurgiska instrument, etc.).
- mikro~~POS=TRUNC
- Bullostomy
OBS: Bullostomy är ett ensidigt förfarande. Driva ett öra på musen och använda det kontralaterala örat som kontroll.- Placera musen i en liggsår ryggläge. Förbered operationsområdet vid den ventrala ytan av halsen med hjälp av hårklippningsmaskiner för attavlägsna päls. Rengör huden med povidonjod baserad antiseptisk lösning, och täcka den med sterila dukar.
- Med hjälp av en skalpell, gör en två cm längsgående snitt från underkäken till nyckelbenet.
- Under förstoring med ett kirurgiskt mikroskop, identifiera submandibular körtlar och separera både med pincett. Dra in submandibular körtlar och lokalisera ursprunget till den tvåbukiga käkmuskeln och ansiktsnerven.
- Göra ett snitt i ursprunget till den tvåbukiga käkmuskeln med en sax, och dra den tillbaka ventralt, utsätta det underliggande inferior-mediala sidan av trum bulla.
- Göra en öppning i bulla genom borrning in i den med en 27 G-nål (Figur 2A). Lokalisera stapedial artären och RW membran caudal till den (Figur 2B). Rena blodet från det borrade området med en absorberbar gelatinsvamp.
- Med hjälp av en 34 G kateter och en glasmikrospruta, injicera långsamt 3-5 μL fordonslösning (CGP-hydrogel eller RL) genom bullostomy direkt på RW nisch, fylla den (figur 2C). Försegla bullostomy med 1-2 droppar vävnadslim.
- Returnera submandibular körtlar till sitt utgångsläge och stäng huden snitt med 5-0 siden kirurgisk sutur. Applicera en klorhexidin-baserade antiseptiska runt snittet för att undvika sårinfektion. OBS: absorberbara och icke-absorberbara suturer skulle kunna användas. Icke-absorberbara suturer måste avlägsnas i 2 veckor. Silk rekommenderas inte för hud stängning eftersom dess användning är förknippad med snitt infektion och lokala vävnadsreaktioner.
- Bilateral transtympanic injektion
- Placera musen i sidoläge trycksår och förbereda en aseptisk operationsområdet under den yttre hörselgången som beskrivs i 4.3.1.1.
- Göra ett 0,5 cm longitudinellt snitt i den vertikala delen av den yttre hörselgången nära tragus och sAVSNITT interna kutan veck ytterörat (tillval).
- Lokalisera trumhinnan vid slutet av den yttre hörselgången med användning av ett kirurgiskt mikroskop (Figur 2E) och identifiera de övre pars flaccida och de underlägsna pars Tensa, som är uppdelad i främre och bakre sektioner genom handtaget på malleus (Figur 2F) .
- Gör en liten myringostomy i den bakre delen av pars flaccida. Göra en ytterligare snitt i pars Tensa trumhinnans, för att tillåta luftevakuering under insprutningen 33. Försiktigt injicera 10-15 mikroliter av vehikel (CGP-hydrogel eller RL) -lösning med en glasmikrospruta ansluten till en 34 G kateter genom pars flaccida, i närheten av RW nisch tills mellanörat är tydligt full.
- Stäng hudincisionerna med en 5-0 silke kirurgisk sutur och ren som beskrivs i 4.3.1.7.
- Placera musen på dess andra sida och operåt den kontra örat (stegen 4.3.2.1-till 4.3.2.5).
- Bullostomy
- Håll muspekaren över en värmedyna tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Skicka inte tillbaka ett djur som har opererats för sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt.
- Övervaka kroppens tillstånd, aktivitet och närvaron av tecken på smärta eller stress. Åstadkomma analgetika vid behov (dvs. Buprenorfin 0,05 mg / kg, Karprofen 5-10 mg / kg). Granska operationssåret dagligen och ta bort förslutningar huden 7-14 dagar postoperativt efter att ha kontrollerat att såret har läkt.
5. Morfologisk utvärdering av Cochlea cytoarchitecture
- Avliva musen vid slutet av experimentet (i detta arbete 28 dagar postmicrosurgery), med en intraperitoneal pentobarbital överdos (100 mg / kg) för att studera de långsiktiga effekterna av operationen.
- Utföra en transcardial perfusion med kall 0,1 M fosfatbuffradSaltlösning (PBS), pH 7,5, följt av 4% (vikt / volym) paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PBS, pH 7,5, såsom beskrivs 26.
VARNING: Paraformaldehyd är mycket giftigt; undvika kontakt med hud, ögon och slemhinnor. Undvik att andas pulvret under mätning och förberedelse. - Använda ett stereomikroskop för att dissekera ut innerörat från temporalbenet, såsom beskrivits 34, 35 utan att separera det vestibulära och hörsel komponenter i innerörat.
- Fixera den isolerade innerörat med 4% (vikt / volym) PFA i 0,1 M PBS, pH 7,5 vid 4 ° C under 12 h med försiktig skakning. Tvätta 3x under 5 min med 0,1 M PBS, pH 7,5.
- Avkalka proverna med 10% etylendiamintetraättiksyra (EDTA) framställd i 0,1 M PBS, pH 6,5 vid 4 ° C under 10 d med konstant skakning, ändra EDTA-lösning varje 3 d.
- När hörselsnäckor förvärva en mjuk konsistens, avlägsna EDTA och tvätta 3x under 5 min med 0,1 M PBS, pH 7,5, with skakning vid RT.
- Bädda in proverna i paraffin som beskrivs 34 och göra 7 pm tjocka cochlea sektioner parallellt med modiolus.
- För att utvärdera cochlea cytoarchitecture, fläck sektioner med hematoxylin och eosin (H & E) 30 och använda ett ljusmikroskop som är ansluten till en digital kamera för att fånga bilder med 4X och 20X objektiv.
6. Cochlear Gene Expression
- Rengör arbetsytan och kirurgiska instrument med RNas sanering lösning.
- Avliva musen som beskrivs i 5.1 och snabbt dissekera ut innerörat från tinningbenet med hjälp av ett mikroskop. Sänk innerörat i en glasskål innehållande ribonukleinsyra (RNA) skydd och stabiliseringsreagens.
- Avlägsna kvarvarande petrous ben med juvelerare pincett och försiktigt separera snäckan från vestibulen med hjälp av Vanna öga sax 35.
- omedelbart transfer snäckan i en 2 ml mikrocentrifugrör med 80 pl RNA skydd och stabiliseringslösning och frysa vävnaden genom att placera röret i torris. Bevara cochlear prover vid -70 ° C fram till användning.
- Isolera cochlea RNA som beskrivits 35 och bestämma dess kvalitet och kvantitet spektrofotometriskt.
- Generera cochlear cDNA från lika mängder av totalt mus-RNA med användning av en omvänd transkription kommersiell sats.
- Utför QRT-PCR för att förstärka kompletterande deoxiribonukleinsyra (cDNA) i tre exemplar för att mäta gentranskript 35, 36.
OBS: I detta arbete pro- och antiinflammatoriska gentranskript av Il1b, IL6, Tgfb1, TNFa, Il10 och Dusp1 mättes. - Beräkna relativa uttrycksgraderna genom att normalisera mål avskrift cykeltröskel (CT) nivåer till det aritmetiska medelvärdet av referens gennivå och den relativa kvantifieringen genom att normaliseraproblemgrupp transkriptnivåer till det aritmetiska medelvärdet för kalibrator gruppen 37.
Representative Results
Hörsel testades av ABR före och vid flera tillfällen efter mikro att utvärdera effekterna på hörselfunktionen (Figur 1A). ABR register utfördes under narkos för att undvika djurförflyttningar och spännings artefakter och därmed förbättra dess reproducerbarhet 27. Intraperitonealt ketamin baserade kombinationer eller inandning isofluran var vanligen används för att söva djuren under ABR-tester. Ketamin / xylazin kombination ger en kortverkande (2-3 min) induktion och en stabil, säker underhållsfasen när de utför ABR register. Det bör noteras att isofluran kan påverka ABR mätning känslighet 38. För ABR register, är subdermala elektroder placeras på specifika platser (Figur 1B) och den elektriska impedansen mäts. Om impedansen är 3 kOhm eller högre, har elektrod positionering kontrolleras för att undvika altVanliga funktioner i ABR vågsamplituden.
Intratympanic leverans utförs i möss genom två mikrokirurgiska förfaranden (Figur 2). Exponering av bulla under bullostomy innebär indragning av submandibular körtlar och den tvåbukiga käkmuskeln. Detta förfarande genomföres med extrem försiktighet eftersom karotisartären och vagusnerven är mycket nära (Figur 2A). Därefter bulla borras för att lokalisera stapedial artären och RW membran (Figur 2B). För att undvika sprickbildning ben, är en liten 0,5 mm öppning görs med en 27 G nål före borrning. Den 34 G kateter riktas genom bullostomy mot RW membranet och en liten volym av fordonet levererades på fönsternisch (figur 2C). Den transtympanic injektion utförs genom ett snitt i de pars flaccida trumhinnans med en 27 G-nål; en större kan framkalla påöra i membranet. Före injektionen, rekommenderar vi att göra en ytterligare snitt i pars Tensa för att tillåta utströmning av luft under insprutning av fordonet (figur 2F). Det är kritiskt för att undvika skador av stapedial artären, en gren av inre halsartären, vilket skulle leda till livshotande blödning.
Möss med bullostomy eller transtympanic operationer bevarade hörsel under hela experimentet, som liknar opererade kontroller (Figur 3). ABR trösklar som svar på klick och tonen skurar inte ändras nämnvärt efter mikro jämfört med baslinjevärden. Inga signifikanta skillnader observerades mellan bullostomy och transtympanic metoder. Morfologiska studier genomfördes för att bekräfta korrekt fordons leverans i mellanörat och bedöma de eventuella förändringar som orsakas av förfarandena i cochlea cytoarchitecture. Ingen av de viktigaste cochlea regioner showed morfologiska förändringar och djur från båda förfarandena presenterade en liknande morfologi av alla cochlea strukturer (Figur 4A). Dessutom har de cochlea profiler för genuttryck av pro- och antiinflammatoriska cytokiner också studerats. Trots bristen på funktionella skillnader i ABR data mellan de två förfaranden, orsakade bullostomy en starkare inflammatorisk respons än transtympanic strategi (Figur 4B).
Figur 1. Experimentell Design och bedömning Hearing. (A) Diagram över den experimentella proceduren. Höra utvärderades med ABR före och efter mikro. Cochlea Prover togs 28 dagar efter mikro. (B) Sövda musen i liggande ställning över värmedyna i en ljuddämpande kammare, med subdermal electrodes placerade i hårbotten mellan öronen över vertex av skallen (aktiv, positiv); i parotid regionen nedanför ytterörat (referens, negativ) och i ryggen (jord). Den fria-fälthögtalaren är placerad på ett fast avstånd (5 cm) som är vänd höger öra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mikro för fordonsprogrammet. (A) Ventral vy av trum bulla. Den bullostomy utförs kaudalt ansiktsnerven med en 27 G nål. Kan observeras (B) RWN och stapedial artär genom perforeringen. (C) Den 34 G kateter riktas genom bullostomy mot RW nisch. (D) En månad efter bullostomy, en liten benigärr är närvarande i öppningsstället (pilspets). (E) Lateral vy av örat, som visar snittet i den yttre hörselgången och trumhinnan (fyrkant). (F) Detalj av trumhinnan. En punktion gjordes vid den kaudala övre kvadranten av trumhinnan med användning av en 27 G nål (svart asterisk, i pars flaccida); injektionen gjordes genom denna perforering med hjälp av en 34 G kateter. Ytterligare ett hål gjordes i hjärn underlägsna kvadranten av membranet (vitt asterisk, i pars Tensa) före injektionen för att balansera trumtrycket. (G) Vy över 34 G katetern genom punktering av trumhinnan. (H) Vy över cochlea regionen 24 timmar efter mikro. RWN fylld med vehikellösning (asterisk). Lat, lateral; Ro, rostral; Gör, rygg; Ma, hammare; Co, cochlea; OW, ovala fönstret; RWN, runt fönster nisch. Skalstrecken = 200 | j, m i A, D, F; Skalstrecken = 100 | j, m i B, C, H; Skalstrecken = 1000 nm i E, G. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Hearing bedömning. Evolution av ABR tröskelvärden (medelvärde ± SEM, i dB SPL) som svar på klicka (A) och tonskuren (B) stimuli, före och 7, 14 och 28 dagar efter mikro-kirurgi i manlig åtta veckor gamla C57BL / 6J möss. Bullostomy (orange; n = 11); transtympanic injektion (blått; n = 6); icke-operatör (grå, n = 11), Klicka här för att se en större version av denna siffra.
jpg "/>
Figur 4. Cochlear Morfologi och Gene Expression Analysis. (A) Morfologi av huvud cochlear strukturer vid basen av snäckan. Haematoxilin-eosin färgning av mitten-modiolar paraffin (7 pm), av öron från icke styrda möss, och möss en månad efter mikro ingripande från bullostomy eller transtympanic injektion. Scala media facket (a, b, c) uppvisar alla huvudkomponenter. Uppgifter om var och en av dessa strukturer (numrerade rutor) visas i följande bilder: spiral ganglion (1), organ Corti (2), spiral ligament (3) och stria vascularis (4). Inre hårceller (asterisk); yttre hårceller (chef för pil). Skalstrecken = 100 ^ m i a, b, c; Skalstrecken = 50 pm i en-1,2,3,4. (B) Cochlear uttryck av inflammatoriska markörer 28 d efter mikro. Jämförelse mellan bullostomy (orange) och transtympanic injektion (blå) och till icke manövrerade möss (vit). *: Icke-operatör vs.drivs grupper; ^: Jämförelse mellan drivs grupper. Gen-uttrycksnivåer är representerade som 2 - ΔΔCt, eller n-faldig skillnad i förhållande till icke manövrerade group.Values presenteras som medel ± SEM av trippelprover från pool prover av 3 möss per tillstånd. Statistisk signifikans: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Lokal läkemedelstillförsel till innerörat kan göras direkt genom intracochlear injektion eller indirekt genom intratympanic administrering, placera läkemedlet i mellanörat 4, 19, 39. Intracochlear administration ger kontrollerad och exakt läkemedelstillförsel till snäckan, undvika diffusion genom fönstermembran, basal till apikala koncentrationsgradienter och klarering genom örontrumpeten. Men det är oftast en mycket invasiv procedur som kräver en komplicerad och känslig mikro 7, 39. I detta sammanhang är industrin att utveckla nya, överdragna, implanterbara anordningar för fördröjd frisättning av läkemedel 40, 41. Å andra sidan, är intratympanic administrering en minimalt invasiv och lätt att utföra förfarandet som möjliggör injektion av större volymer av den dmatta in i mellanörat, även om farmakokinetiken är inte lätt att kontrollera. Majoriteten av läkemedlet försvinner genom örontrumpeten och den återstående fraktionen måste diffundera genom RW membranet för att nå snäckan 18. RW är platsen för maximal absorption av ämnen från mellanörat i perilymfa fyllda trumkanal cochlea 7. Det är ett semipermeabelt treskiktsstruktur, även om dess permeabilitet beror på läkemedelsegenskaper (storlek, koncentration, löslighet och elektrisk laddning) och trans transportsystem (diffusion, aktiv transport eller fagocytos) 42. Ovala fönstret och öron kapslar är alternativa men mindre effektiva ingångar till cochlea 43, 44.
Här kan vi visa och jämföra två mikro metoder för riktad läkemedelstillförsel i musen mellanörat: bullostomy och transtympainjektion nic förfaranden. Vanliga kritiska steg till dessa förfaranden inkluderar: i) en utvärdering av utfrågning före och efter mikrokirurgi, ii) framställning av en homogen fordon lösning under sterila förhållanden, iii) noggrann övervakning av anestesiproceduren och övervakning av djurkroppstemperatur och konstanter, iv ) långsam placering av lämplig volym av fordon med inriktning på RW, och iv) att ta cochlea prover för att slutföra molekylär och morfologisk analys.
Retroauricular och ventrala metoder för bullostomy har beskrivits 7, 45. Vi använde den ventrala approximation eftersom vår erfarenhet har resulterat i mindre sjuklighet och gav bättre tillgång till RW 46. Transtympanic injektioner genomförs vanligen genom pars Tensa trumhinnans, anteriort eller posteriort malleus manubrium 12. Idetta arbete har vi utfört en modifiering av den teknik, en injektion genom pars flaccida bortom malleus med en tidigare extra punktering av pars Tensa att tillåta luftevakuering under injektion.
Den transtympanic injektion var mindre invasiv än bullostomy, trots att båda microsurgeries var snabb (20 och 5 minuter per öra för bullostomy och transtympanic tillvägagångssätt respektive), med korta postoperativa återhämtning gånger och ingen sjuklighet. Viktigast av allt, upprätthålls både förfaranden förhör och de ABR parametrar var identiska med de bestämmas före mikrokirurgi. Den transtympanic strategi tar mindre tid än bullostomy och kan utföras i båda öronen hos samma djur under samma ingrepp. Fördelar med transtympanic injektion är således att den kan utföras bilateralt och upprepas, om så erfordras. Å andra sidan, erbjuder bullostomy direkt visuell tillgång till RW membranet och tillåter Filling av RW nisch. Däremot inte transtympanic injektion inte tillåter kontroll av fordonets placering i RW nisch.
De förfaranden som redovisas i detta arbete beskriver hur man utför en lokal läkemedels fordon leverans till mellanörat för pre-kliniska tillämpningar såsom utvärdering av ototoxicitet och utvärdering av effekten i hörselnedsättning. Två mikrokirurgi förfaranden beskrivs som ger alternativa metoder med specifika fördelar och nackdelar. Både bevara hörsel och inte orsakar morfologiska förändringar. Lokal inflammation beskrivs som en potentiell komplikation av bullostomy. En uppsättning av kompletterande metoder beskrivs också för postkirurgiska förfaranden, inklusive hörsel, morfologiska och inflammatoriska markör uttryck utvärderingar. Framtida tillämpningar för dessa tekniker är den prekliniska utvärderingen av nya terapier för hörselnedsättning, inklusive genetiska, cellulära och farmakologiska metoder, i djurmodeller. Intratympanic administratjoner säkerställa leverans av behandling i mellanörat, i kontakt med den runda fönstermembranet, vilket underlättar passage in i perilymfa utan uppenbar cochlea skada.
Acknowledgments
Författarna vill tacka genomik och Noninvasiv Neurofunctional Utvärderingsmekanismer (IIBM, CSIC-UAM) för deras tekniska support. Detta arbete har finansierats med bidrag från den spanska "Ministerio de Economía y Competitividad" (ERUF-SAF2014-53979-R) och Europeiska unionen (FP7-AFHELO och FP7-PEOPLE-TARGEAR) till IVN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
| Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
| Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
| Water pump | Gaymar | # TP472 | |
| Surface disinfectant | José Collado SA | # CR-36 | |
| Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
| Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
| Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
| System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
| Statistics software (SPSS) | IBM | ||
| Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
| Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer |
| Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
| Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
| Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
| Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h. |
| Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
| Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
| Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
| Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
| Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
| Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
| Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
| Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
| Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
| Microlance 27 G | Becton Dickinson | # 302200 | |
| Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
| Catheter (Microfil 34 G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
| Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
| Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
| Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
| Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
| Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
| Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
| Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
| RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
| RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
| Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
| cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
| Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
| Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |
References
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing impairment: a panoply of genes and functions. Neuron. 68 (2), 293-308 (2010).
- Muller, U., Barr-Gillespie, P. G. New treatment options for hearing loss. Nat Rev Drug Discov. 14 (5), 346-365 (2015).
- Okano, T. Immune system of the inner ear as a novel therapeutic target for sensorineural hearing loss. Front Pharmacol. 5, 205 (2014).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- Horie, R. T., et al. Stealth-nanoparticle strategy for enhancing the efficacy of steroids in mice with noise-induced hearing loss. Nanomedicine (Lond). 5 (9), 1331-1340 (2010).
- Kanzaki, S., et al. Novel in vivo imaging analysis of an inner ear drug delivery system: Drug availability in inner ear following different dose of systemic drug injections. Hear Res. 330 (Pt A), 142-146 (2015).
- Paulson, D. P., et al. A novel controlled local drug delivery system for inner ear disease). Laryngoscope. 118 (4), 706-711 (2008).
- Fetoni, A. R., Troiani, D., Eramo, S. L., Rolesi, R., Paludetti Troiani, G. Efficacy of different routes of administration for Coenzyme Q10 formulation in noise-induced hearing loss: systemic versus transtympanic modality. Acta Otolaryngol. 132 (4), 391-399 (2012).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Direct drug application to the round window: a comparative study of ototoxicity in rats. Otolaryngol Head Neck Surg. 141 (5), 584-590 (2009).
- Pullens, B., van Benthem, P. P. Intratympanic gentamicin for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (3), (2011).
- Lavigne, P., Lavigne, F., Saliba, I. Intratympanic corticosteroids injections: a systematic review of literature. Eur Arch Otorhinolaryngol. , (2015).
- Park, S. H., Moon, I. S. Round window membrane vibration may increase the effect of intratympanic dexamethasone injection. Laryngoscope. 124 (6), 1444-1451 (2014).
- Phillips, J. S., Westerberg, B. Intratympanic steroids for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (7), (2011).
- Trune, D. R., Canlon, B. Corticosteroid therapy for hearing and balance disorders. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1928-1943 (2012).
- Wei, B. P., Stathopoulos, D., O'Leary, S. Steroids for idiopathic sudden sensorineural hearing loss. Cochrane Database Syst Rev. 7, (2013).
- Varela-Nieto, I., Silvia, M. -C., Rodriguez-de la Rosa, L. ourdes, Lassaletta, L. uis, Contreras, J. ulio IGF-I deficiency and hearing loss: molecular clues and clinical implications. Pediatr Endocrinol Rev. 10 (4), 12 (2013).
- Nakagawa, T., et al. Audiometric outcomes of topical IGF1 treatment for sudden deafness refractory to systemic steroids. Otol Neurotol. 33 (6), 941-946 (2012).
- Liu, H., et al. Evaluation of intratympanic formulations for inner ear delivery: methodology and sustained release formulation testing. Drug Dev Ind Pharm. 40 (7), 896-903 (2014).
- Nakagawa, T., Ito, J. Local drug delivery to the inner ear using biodegradable materials. Ther Deliv. 2 (6), 807-814 (2011).
- Buckiova, D., et al. Minimally invasive drug delivery to the cochlea through application of nanoparticles to the round window membrane. Nanomedicine. 7 (9), 1339-1354 (2012).
- Stover, T., Yagi, M., Raphael, Y. Cochlear gene transfer: round window versus cochleostomy inoculation. Hear Res. 136 (1-2), 124-130 (1999).
- Ahmed, T. A., Aljaeid, B. M. Preparation, characterization, and potential application of chitosan, chitosan derivatives, and chitosan metal nanoparticles in pharmaceutical drug delivery. Drug Des Devel Ther. 10, 483-507 (2016).
- Bhattarai, N., Gunn, J., Zhang, M. Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 62 (1), 83-99 (2010).
- Rao, S. B., Sharma, C. P. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential. J Biomed Mater Res. 34 (1), 21-28 (1997).
- Supper, S., et al. Thermosensitive chitosan/glycerophosphate-based hydrogel and its derivatives in pharmaceutical and biomedical applications. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 249-267 (2014).
- Riquelme, R., et al. A comparative study of age-related hearing loss in wild type and insulin-like growth factor I deficient mice. Front Neuroanat. 4, 27 (2010).
- Willott, J. F. Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8 Unit8 21B (2006).
- Cederholm, J. M., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hear Res. 292 (1-2), 71-79 (2012).
- Cediel, R., Riquelme, R., Contreras, J., Diaz, A., Varela-Nieto, I. Sensorineural hearing loss in insulin-like growth factor I-null mice: a new model of human deafness. Eur J Neurosci. 23 (2), 587-590 (2006).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Insulin receptor substrate 2 (IRS2)-deficient mice show sensorineural hearing loss that is delayed by concomitant protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) loss of function. Mol Med. 18, 260-269 (2012).
- Ngan, E. M., May, B. J. Relationship between the auditory brainstem response and auditory nerve thresholds in cats with hearing loss. Hear Res. 156 (1-2), 44-52 (2001).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Grewal, A. S., Nedzelski, J. M., Chen, J. M., Lin, V. Y. Dexamethasone uptake in the murine organ of Corti with transtympanic versus systemic administration. J Otolaryngol Head Neck Surg. 42, 19 (2013).
- Camarero, G., et al. Delayed inner ear maturation and neuronal loss in postnatal Igf-1-deficient mice. J Neurosci. 21 (19), 7630-7641 (2001).
- Rodriguez-de la Rosa, L., et al. Comparative gene expression study of the vestibular organ of the Igf1 deficient mouse using whole-transcript arrays. Hear Res. 330 (Pt A), 62-77 (2015).
- Sanchez-Calderon, H., et al. RNA microarray analysis in prenatal mouse cochlea reveals novel IGF-I target genes: implication of MEF2 and FOXM1 transcription factors. PLoS One. 5 (1), e8699 (2010).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Ruebhausen, M. R., Brozoski, T. J., Bauer, C. A. A comparison of the effects of isoflurane and ketamine anesthesia on auditory brainstem response (ABR) thresholds in rats. Hear Res. 287 (1-2), 25-29 (2012).
- Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. J Control Release. 174, 171-176 (2014).
- Astolfi, L., et al. Cochlear implants and drug delivery: In vitro evaluation of dexamethasone release. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (2), 267-273 (2014).
- Roche, J. P., Hansen, M. R. On the Horizon: Cochlear Implant Technology. Otolaryngol Clin North Am. 48 (6), 1097-1116 (2015).
- Duan, M. -l, Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. Journal of Otology. 4 (1), 34-43 (2009).
- Mikulec, A. A., Plontke, S. K., Hartsock, J. J., Salt, A. N. Entry of substances into perilymph through the bone of the otic capsule after intratympanic applications in guinea pigs: implications for local drug delivery in humans. Otol Neurotol. 30 (2), 131-138 (2009).
- Kang, W. S., et al. Intracochlear Drug Delivery Through the Oval Window in Fresh Cadaveric Human Temporal Bones. Otol Neurotol. 37 (3), 218-222 (2016).
- Lajud, S. A., et al. A regulated delivery system for inner ear drug application. J Control Release. 166 (3), 268-276 (2013).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res. 151 (1-2), 106-114 (2001).
