Abstract
Vi presenterer to minimalt invasive mikrokirurgisk teknikk i gnagere for spesifikk levering av legemidlene i mellomøret, slik at den kan nå det indre øret. Den første prosedyren består av perforasjon av tromme bulla, betegnes bullostomy; den andre er en transtympanic injeksjon. Både ligne menneskelige kliniske intratympanic prosedyrer.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) og Ringer's Laktat buffer (RL) ble brukt som biokompatible kjøretøy for lokal levering av legemidler. CGP er et ikke-toksisk biologisk nedbrytbar polymer som er mye brukt i farmasøytiske anvendelser. Det er en viskøs væske ved romtemperatur, men den blir stiv til en halvfast fase ved kroppstemperatur. RL er en isotonisk løsning som brukes for intravenøs administrering hos mennesker. Et lite volum av denne bilen er nøyaktig plassert på det runde vindu (RW) nisje ved hjelp av en bullostomy. En transtympanic injeksjon fyller mellomøret og tillater mindre kontroll, men bredere adgang til det indre øret.
Begge fremgangsmåter er egnet som medikament-tilførselsmetoder, og i mus mellomøret, selv om transtympanic injeksjon viste seg å være mindre invasiv i forhold til bullostomy.
Introduction
Nedsatt hørsel er den hyppigste menneskelige sanse underskudd og rammer 5,3% av den verdensomspennende befolkningen, og 30% av personer over 65 år ( http://www.who.int/topics/deafness/en , oppdatert 2016). Hørselstap påvirker språktilegnelse hos barn og akselererer kognitiv svikt hos eldre mennesker. Derfor er det et betydelig helsevesenet problem med en enorm samfunnsøkonomisk effekt. Det kan være forårsaket av genetiske defekter, miljøfaktorer eller en kombinasjon av begge deler 1, som til slutt forårsake skade og død av hårceller og nevroner i sneglehuset. Disse cellene ikke regenerere hos pattedyr, derfor cellular tap og samtidig hørselstap kan ikke reverseres. Kliniske alternativene er basert på proteser, inkludert høreapparat og cochlea, mellomøret og benlednings implantater 2. Dessverre er det ingen spesifikk medisinsk restorative treareksjonene for nedsatt hørsel og dermed flere forskningslinjer er fokusert på utvikling av forebyggende og reparerende behandling. Nye terapeutiske alternativene inkluderer gen og celleterapi samt utvikling av små molekyler for farmakologisk behandling to.
En av de viktigste utfordringene i cochlea-farmakologisk behandling er levering av legemidler. Systemiske behandlinger har begrenset effektivitet i sneglehuset på grunn av blod-labyrinten barrieren 3, kontinuerlig endotel i kontakt med cochlea blodkar, som virker som en fysisk og biokjemisk barriere for å opprettholde det indre øret væske homeostase, derfor begrenser medikament passasje til det indre øret. Det er permeabel kun for små liposoluble molekyler, selv om permeabiliteten kan økes i løpet av sneglehuset betennelse, og også ved bruk av diuretika eller osmotiske midler. Volumet av stoffet som til slutt når cochlea etter systemisk administrasjon er redusert;Derfor er høye doser som kan forårsake organisk toksisitet nødvendig. I tillegg kan hepatisk metabolisme av legemidlet produsere giftige eller inaktive metabolitter 4, 5, 6, 7. I motsetning til dette lokale inngrep tillate plassering av et visst begrenset mengde av medikamentet inn i den midtre eller indre øret uten uønskede bivirkninger 4, 7, 8, 9. I klinisk praksis er intratympanic administrasjoner begrenset til visse cochlea patologi, som gentamicin i Ménières sykdom 10, kortikosteroider i plutselig døvhet, Ménières sykdom, immun-mediert og hørselstap, 11, 12, 13, 14, 15 og insulin-lignende vekstfaktor 1 (IGF1) i plutselig døvhet 4, 16, 17.
Formuleringer for lokal administrasjon bør bevare den skjøre homeostase (pH og osmolaritet) av cochlea væsker. I tillegg er det meget viktig å opprettholde sterilitet under hele prosessen for å unngå bakteriell forurensning av cerebrospinalvæske. Eksipienten anvendes for medikamentavgivelse bør være biokompatibelt, nonototoxic og av den passende konsistens. Flytende løsninger er anbefalt for intracochlear injeksjoner, men er ikke egnet for den intratympanic rute på grunn av klaringen gjennom øretrompeten. I dette tilfelle blir stoffene vanligvis båret av halvfaste geler for å øke deres varighet i mellomøret 4, 18, 19. Alternative levering systems brukes som bærere for å øke passasje av stoffet til det indre øret er nanopartikler 20 og adenovirus 21 Her har vi sammenlignet to biler: CGP og en RL løsning. CGP er en hydrogel dannet av kitosan, et lineært polysakkarid bestående av D-glukosamin og N-acetyl-D-glukosamin oppnådd fra krepsdyrskall og β-glycerofosfat, en polyol som danner et skjold av vann rundt kitosan kjedene og holder den i flytende form. CGP er termo og kan bli degradert ved lysozymer, slik at en vedvarende medikamentfrigjøring i mellomøret 22, 23, 24, 25. Chitosan-base-hydrogeler er egnede bærere for kliniske anvendelser slik som medikamentavgivelse på grunn av deres manglende immunogenisitet og mangelen på aktivering av lokale inflammatoriske reaksjoner 23, 24. På otheh hånd, er RL-buffer et ikke-pyrogent isotonisk løsning (273 mOsm / liter og pH-verdi 6.5) ment for intravenøs administrering hos mennesker som en kilde av vann og elektrolytter, spesielt i blodtap, traumer eller brannskader fordi biprodukter av laktatmetabolismen i leveren motvirke acidose.
Her beskriver vi og sammenligne to kirurgiske metoder som har blitt raffinert for lokal levering av legemidler til muse indre øret. Sikkerhetsprofilen til begge teknikkene ble evaluert ved hjelp av funksjonelle, morfologiske og molekylære tester. Høring ble evaluert med Auditory hjernestammen Response (ABR) 26, 27 utført før og etter mikro til forskjellige tider. End-point prosedyrer ble brukt til å dissekere sneglehuset og sammenligne den anatomiske, cellulært og molekylært virkningen av disse to mikro prosedyrer.
Protocol
Sørg for at dyret håndteringsprosedyrer er i samsvar med internasjonale og nasjonale forskrifter. Protokollen følger EU 2010/63 / EU og spansk RD 53/2013 retningslinjer, henholdsvis.
1. Generelt Animal Håndtering
- Strøm mus ad libitum med et standard diett og drikkevann. Kontroll helse og trivsel ved å følge Federation for forsøksdyrlære Associations (FELASA) anbefalinger.
2. Hearing Assessment
MERK: Spor funksjonelle effekten av mikro prosedyrer ved testing høring før, og mange ganger etter operasjonen (i dette arbeidet 2, 7, 14 og 28 d postmicrosurgery) med ikke-invasive prosedyrer som for eksempel ABR 9.
- For ABR testing, bedøve mus med kortvarige virkning protokoller dvs. intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg kroppsvekt (BW) og xylazin (10mg / kg, BW). Alternativt utføre hørselstester i henhold sniffe anestesi.
MERK: Siden ABR parametere kan bli påvirket av narkosen protokoll 28, kan du bruke den samme gjennom hele forsøket. - Sjekk anestesidybden ved å teste tå-klemme refleks.
MERK: Når tilbaketrekking refleks forsvinner, har dyret nådd en passende anestesidybden å utføre auditiv testing. - Beskytt øynene fra uttørking og videregående keratokonjunktivitt sicca av lokal administrasjon av tåre kosttilskudd, slik som hydroksypropylmetylcellulose-basert gels.
- Hold mus ved fysiologisk temperatur (37,5 til 38 ° C) under hele prosedyren. For å unngå elektriske forstyrrelser, bruker en varm vannpumpe og varmere. Overvåk kroppstemperatur med rektal sonder. Alltid passe på å ikke overopphetes dyret.
MERK: Vi anbefaler at du rengjør varmeputen med en overflate desinfeksjonsmiddel mellom mus.0; For anestesi induksjon og utvinning, elektrisk oppvarming pads, glødelamper eller infrarødt lys kan brukes. - ABR prosedyre
MERK: For ABR registrering, bruke en datamaskin arbeidsstasjon med en innenbords lydkort for å lage kurver (digital til analog, DA utgang, konvertering) og å digitalisere elektriske responskurveformer (analog til digital, AD inngang), en attenuator, et oscilloskop og en lav-impedans-forsterker. Moderne auditive arbeidsstasjoner (dvs. Tucker Davis Techonologies) omfatter alle disse komponentene i et enkelt kompakt system.- Plasser bedøvet mus i liggende stilling på varmeputene i en lyd-demping kammer for å unngå støy fra omgivelsene forstyrrelser og etterklang (figur 1).
- Lever akustiske stimuli i den ytre øregangen. Bruk forhåndsinnstilte stimuli eller nye signaler utformet med riktig programvare. Koble DA arbeidsstasjon utgang til den valgte høyttaleren.
MERK: FreE-felt eller lukket-felt høyttalere er satt inn i den ytre hørekanal kan benyttes. Den førstnevnte er foretrukket når det arbeides med mus på grunn av vanskeligheter i sonden innsetting og lyd kalibrering i lukkede systemer. Gratis felt høyttalere stimulere begge ørene og lokke fram en binaural respons. For å få overveiende mono svar med frittfelt høyttalere, har motsatt aktivitet for å bli eliminert ved okklusjon (dvs. med øreplugger) eller ved å maskere støy.- Plasser fritt felt foredragsholder på en fast avstand (vanligvis 5-20 cm) mot hodet eller valgt øret med midten av høyttaleren på linje med den ytre øregangen. Pass på at ingen hindringer er mellom høyttaleren og øret, og at det ytre øret er helt åpen.
- Plasser rustfritt stål subdermale nålelektroder som følger: i) det aktive (positiv) elektrode i hodebunnen mellom ørene (over toppunktet av skallen), ii) referansen (negative) elektrode, i parotidområdet under det ytre øret, og iii) den første elektrode i ryggen, halen eller bakben region (Figur 1).
- Kontroll av den elektriske impedans i de positive og negative elektroder. Sørg for at impedansen er mindre enn tre kOhm (helst en kOhm). Hvis det er høyere, omplassere, ren med alkohol eller erstatte elektrodene.
- For ABR-opptak, generere bredbånd klikk og ren tone frekvenser og til stede på avtagende intensiteter 90-10 dB i forhold til lydtrykknivå (SPL) på 5-10 dB SPL trinn 27, 29, 30.
- Present kort klikk eller tone burst stimuli (1-5 ms) som begynner med høyt nivå (dvs. 80 eller 90 dB SPL) og redusere intensiteten i 5-10 dB SPL trinn. Registrer elektriske respons i de første 10 ms etter stimulering (fremkalt ABR vises svarene på 6-8 ms).
MERK: For denne grunn, stimulering priserbør ikke være høyere enn 50 stimuli / s (normal hastighet 20-50).
- Present kort klikk eller tone burst stimuli (1-5 ms) som begynner med høyt nivå (dvs. 80 eller 90 dB SPL) og redusere intensiteten i 5-10 dB SPL trinn. Registrer elektriske respons i de første 10 ms etter stimulering (fremkalt ABR vises svarene på 6-8 ms).
- Forsterke, posten og et gjennomsnitt av fremkalt elektriske respons til hver stimulus og intensitet. Bruk en forsterker med lavt støynivå og et godt signal-til-støy-forhold, og koble den til AD inngang.
MERK: abrs har svært lave amplituder, vanligvis under 1 uV (peak-to-peak) og må være tatt opp med en forsterker med svært lavt støynivå. I normale høre mus, klare ABR bølger dukke opp etter snitt 100 - 200 svar, men for å oppnå høykvalitets innspillinger, eller i tilfelle av nedsatt hørsel, er flere repetisjoner anbefales (750-1,000) 27. - Visuelt bestemme ABR terskel under testen.
MERK: ABR terskel er den laveste lyd stimuli intensitet som utløser en pålitelig ABR innspilling med bølger I-IV godt synlig og mellom peak-to-peak spenning 2 SD over gjennomsnittet bakgrunnen aktivitet 31. Denne informasjonen har ikke bekreftet during off-line analyse, sammen med andre parametere inkludert topp og interpeak ventetid, og bølgeamplitudene. - Utføre dataanalyse enten manuelt eller automatisk.
- For manuell analyse, identifisere de 4-5 ABR bølger (I, II, III ... osv.) Og markere ut toppene (P1, P2, P3 ...) og daler (N1, N2, N3 ...) for hver bølge. Når analysen er ferdig, eksportere data til regneark eller en tekstfil.
MERK: Spesiell programvare for elektriske respons opptak utfører vanligvis analysen automatisk. Ytterligere målinger kan bestemmes på ABR opptak i respons til en fast intensitet (dvs. 70 eller 80 dB SPL) eller ved intensiteter i forhold til de enkelte klikkterskelverdier (dvs. 15 dB SPL enn terskel).
- For manuell analyse, identifisere de 4-5 ABR bølger (I, II, III ... osv.) Og markere ut toppene (P1, P2, P3 ...) og daler (N1, N2, N3 ...) for hver bølge. Når analysen er ferdig, eksportere data til regneark eller en tekstfil.
- Utføre statistisk analyse av ABR data ved hjelp av den aktuelle programvaren. Avhengig av eksperimentell design, bruk standard paret t-test eller analyse av varians (ANOVA) for å sammenligne hoved ABR Paramemeterne i de ulike gruppene 26, 30.
MERK: I longitudinelle studier, mange funksjonelle data samlet inn fra samme dyr på ulike tidsmessige punkter (dvs. før og etter mikro). I dette tilfelle gir en generell lineær modell gjentatt måle test en detaljert variansanalyse.
3. Vehicle Forberedelse
- Utarbeide og bruke kjøretøy løsninger under sterile forhold.
MERK: Flytende løsninger er vanligvis fjernet raskt gjennom øretrompeten. Forskjellige injiserbare leveringssystemer kan benyttes for å øke oppholdstiden for stoffet i mellomøret, inklusive hydrogeler og nanopartikler 32.- For å fremstille CGP-hydrogel, oppløse 75% deacetylert kitosan i 0,2 M eddiksyre, hvilket ga en 1,5-2% (vekt / vekt) kitosan løsning. Legg 9% glycerofosfat (vekt / vekt) til denne løsningen 7. Forbered løsningenlike før administrering og lagre hydrogel ved 4 ° C inntil bruk.
MERK: CGP-hydrogel er moderat viskøs, men likevel injiserbar ved denne temperatur. Under 4 ° C endres den til en fast fase, blokkerer dens anvendelse. Etter påføring, gjennomgår CGP en faseovergang til en halvfast gel i omtrent 15 minutter ved 37 ° C. - Delmengde (0,5 ml) kommersiell RL buffer og oppbevares ved 4 ° C inntil bruk.
- For å fremstille CGP-hydrogel, oppløse 75% deacetylert kitosan i 0,2 M eddiksyre, hvilket ga en 1,5-2% (vekt / vekt) kitosan løsning. Legg 9% glycerofosfat (vekt / vekt) til denne løsningen 7. Forbered løsningenlike før administrering og lagre hydrogel ved 4 ° C inntil bruk.
4. Mikro Prosedyrer
- Indusere generell anestesi med ketamin basert kombinasjoner av sedativer og analgetika, (dvs. ketamin 100 mg / kg, medetomidin 0,05 mg / kg og phentanile 0,025 mg / kg) ved intraperitoneal injeksjon, etterfulgt av inhalant midler (dvs. isofluran).
- Etter administrering av injiserbare midler, justere bedøvelse ansiktsmasken til musen snute og koble O 2 forsyning til isofluran damp. Opprettholde inhalasjonsanastesi undermikrokirurgi og overvåke bedøvelse flyet med tå-pinch refleks og pustemønster. Begynn kirurgisk forberedelse når refleksen er helt avskaffet og musen presenterer regelmessig pusting.
- Opprettholde kroppstemperaturen med varmeputer under hele prosedyren og beskytte øynene mot hornhinnebetennelse med en hydroksypropylmetylcellulose basert gel.
- Forbered et rent kirurgiske området ved hjelp av sterile forheng. Sterilisere mikro instrumenter med et glass-perle sterilisator før operasjonen. Oppretthold sterile forhold under hele kirurgiske prosedyren (sterile hansker, forheng, kirurgiske instrumenter, etc.).
- mikro
- Bullostomy
MERK: Bullostomy er en ensidig prosedyre. Operere ett øre av musen og bruke det kontralaterale øret som kontroll.- Plasser musen i en decubitus liggende stilling. Klargjør den kirurgiske området på ventral overflaten av halsen ved hjelp clippers åfjerne pelsen. Rens huden med povidonjodid basert antiseptisk løsning og dekke det til med sterile forheng.
- Ved hjelp av en skalpell, lage en 2 cm langsgående snitt fra kjeven til krageben.
- Under forstørrelse med et kirurgisk mikroskop, identifisere submandibular kjertler og skille både med tang. Trekk submandibular kjertler og lokalisere opprinnelsen til digastric- og ansikts nerve.
- Lag et snitt i opprinnelsen til digastric- med en saks, og trekke det ventralt, utsette den underliggende mindreverdig-mediale aspekt av tromme bulla.
- Lage en åpning i bulla ved å bore inn i den med en 27 G nål (figur 2A). Lokalisere stapedial arterien og RW membranen caudal til den (figur 2B). Rense blod fra det borede området med et absorberbart gelatin svamp.
- Ved hjelp av en 34 G kateter og et glass mikrosprøyte, sakte injisere 3-5 μL av bæreroppløsning (CGP-hydrogel eller RL) gjennom bullostomy direkte på RW nisje, fylle det (figur 2C). Tett bullostomy med 1-2 dråper av vev lim.
- Returner submandibular kjertler til sin opprinnelige posisjon og lukk huden snittene med 5-0 silke kirurgisk sutur. Påfør en klorheksidin-baserte antiseptisk rundt innsnitt for å unngå sårinfeksjoner. MERK: Absorberbare og ikke-absorberbare suturer kan benyttes. Ikke-absorberbare suturer må fjernes i 2 uker. Silke er ikke anbefalt for hud nedleggelse siden bruken er assosiert med innsnitt infeksjon og reaksjoner lokale vev.
- Bilateral transtympanic injeksjon
- Plassere musen i lateral decubitus posisjon og fremstille en aseptisk kirurgisk område under den ytre øregang som beskrevet i 4.3.1.1.
- Foreta en 0,5 cm langsgående snitt i den vertikale delen av den ytre øregang i nærheten av tragus og sEL den interne kutan fold av pinna (valgfritt).
- Lokaltrommehinnen ved enden av den ytre ørekanalen ved hjelp av et kirurgisk mikroskop (figur 2E) og identifisere de øvre pars flaccida og mindreverdig pars TENSA, som er delt i fremre og bakre deler av håndtaket til hammeren (figur 2F) .
- Lag en liten myringostomy i haledelen av Pars flaccida. Lag en ekstra snitt i pars Tensa av trommehinnen, slik at luft evakuering under injeksjon 33. Forsiktig injisere 10-15 mL av kjøretøy (CGP-hydrogel eller RL) løsning med et glass mikro sprøyte koblet til en 34 G kateter gjennom pars flaccida, nær RW nisje til mellomøret er tydelig full.
- Lukk huden snittene med en 5-0 silke kirurgisk sutur og rent som beskrevet i 4.3.1.7.
- Plasser musen på den andre siden og operspiste den kontralaterale øret (trinn 4.3.2.1 til 4.3.2.5).
- Bullostomy
- Hold musen på en varmepute før den har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi i selskap med andre dyr før fullt restituert.
- Overvåke kroppens tilstand, aktivitet og tilstedeværelse av tegn på smerte eller stress. Gi smertestillende hvis det er nødvendig (dvs. Buprenorfin 0,05 mg / kg, karprofen 5-10 mg / kg). Gjennomgå operasjonssåret daglig og fjerne hud nedleggelser 7-14 dager postoperativt etter å ha kontrollert at såret har grodd.
5. Morfologisk Evaluering av Cochlear cytoarchitecture
- Avlive mus ved slutten av eksperimentet (i dette arbeidet 28 dager postmicrosurgery), med en intraperitoneal pentobarbital overdose (100 mg / kg) for å studere de langvarige effektene av operasjonen.
- Utfør en transcardial perfusjon med kaldt 0,1 M fosfat-bufretSaltvann (PBS), pH 7,5, etterfulgt av 4% (vekt / volum) paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PBS, pH 7,5, som beskrevet 26.
FORSIKTIG: Paraformaldehyde er svært giftig; unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Unngå innånding av pulveret under måling og forberedelse. - Bruk en stereomikroskop for å dissekere ut det indre øret fra tinningbenet som beskrevet 34, 35 uten skille vestibulære og cochlea komponenter i det indre øret.
- Feste den isolerte indre øret med 4% (vekt / volum) PFA i 0,1 M PBS, pH 7,5 ved 4 ° C i 12 timer med forsiktig risting. Vask 3 ganger i 5 minutter med 0,1 M PBS, pH 7,5.
- Avkalk prøvene med 10% etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) fremstilt i 0,1 M PBS, pH 6,5 ved 4 ° C i 10 d med konstant risting, endring av EDTA-løsning hver 3 d.
- Når cochleae få en myk konsistens, fjerne EDTA og vaske 3x i 5 min med 0,1 M PBS, pH 7,5, with risting ved RT.
- Embed prøvene i parafinvoks som beskrevet 34 og gjør 7 mikrometer tykke cochlea seksjoner parallelt med modiolus.
- For å evaluere cochlea cytoarchitecture, beis seksjoner med haematoxylin og eosin (H & E) 30 og bruke et lysmikroskop koblet til et digitalt kamera til å ta bilder med 4X og 20x objektiver.
6. Cochlear Gene Expression
- Rengjør arbeidsflaten og kirurgiske instrumenter med RNase dekontaminering løsning.
- Avlive mus som beskrevet i 5.1 og raskt dissekere ut det indre øret fra tinningbenet ved hjelp av et mikroskop. Lev det indre øret i et glassfat som inneholder Ribonucleic syre (RNA) beskytter og stabilisator reagens.
- Fjern de rester petrous bein med gullsmed tang og forsiktig skille cochlea fra vestibylen ved hjelp av Vanna s øye saks 35.
- umiddelbart transfer sneglehuset i en 2 ml mikrosentrifugerør med 80 mL RNA beskytter og stabilisator løsning og fryse vevet ved å plassere røret i tørris. Bevare cochlea prøver ved -70 ° C inntil bruk.
- Isoler cochlea RNA som beskrevet 35 og bestemme dens kvalitet og kvantitet spektrofotometrisk.
- Generer cochlea cDNA fra like mengder total mus RNA ved hjelp av en omvendt transkripsjon kommersielt sett.
- Utføre QRT-PCR for å amplifisere komplementær deoksyribonukleinsyre (cDNA) in triplo for å måle gentranskriptene 35, 36.
MERK: I dette arbeidet pro- og anti-inflammatoriske genet transkripsjoner av Il1b, IL6, Tgfb1, TNFa, Il10 og Dusp1 ble målt. - Beregn relative uttrykk forhold ved å normalmålet transkripsjon syklus terskel (CT) nivåer til det aritmetiske gjennomsnitt av referansen gennivå og den relative kvantifiseringen av normalisereProblemet gruppe transkripsjonsnivåer til det aritmetiske gjennomsnittet av kalibratoren gruppe 37.
Representative Results
Høring ble testet ved ABR før og på flere ganger etter mikrokirurgi for å evaluere virkningen på auditiv funksjon (figur 1A). ABR registre ble utført under bedøvelse for å unngå dyre bevegelse og spenning gjenstander og dermed forbedre sin reproduserbarhet 27. Administrert intraperitonealt ketamin basert kombinasjoner eller ved innånding isofluran ble vanligvis benyttet til å bedøve dyr under ABR tester. Den ketamin / xylazin kombinasjonen gir et korttidsvirkende (2-3 min) induksjon og en stabil, trygg vedlikeholdsfasen mens du utfører ABR registre. Det skal bemerkes at isofluran kan påvirke ABR målefølsomhet 38. For ABR registre, er subdermal elektroder plassert på bestemte steder (Figur 1b) og den elektriske impedansen blir målt. Hvis impedansen er 3 kOhm eller høyere, har elektroden posisjonering for å bli kontrollert for å unngå altrasjoner i ABR wave amplitude.
Intratympanic levering blir utført i mus ved to mikrokirurgiske prosedyrer (figur 2). Eksponering av bulla under bullostomy innebærer tilbaketrekning av submandibular kjertler og digastric-. Denne prosedyren utføres med ekstrem forsiktighet fordi halspulsåren og vagal nerve er meget nær (figur 2A). Deretter blir bulla boret for å lokalisere stapedial arterien og RW membranen (figur 2B). For å unngå sprekker bein, er en liten 0,5 mm åpning laget med en 27 G nål før boring. Den 34 G Kateteret føres gjennom bullostomy mot RW membranen og et lite volum av kjøretøyet blir levert på vindus nisje (figur 2C). Den transtympanic injeksjon utføres gjennom et snitt i pars flaccida av trommehinnen med en 27 G nål; et større en kan provosere vedøre i membranen. Før injeksjonen, anbefaler vi å lage et ekstra snitt i pars Tensa å tillate strøm av luft under injeksjon av kjøretøyet (figur 2F). Det er avgjørende for å unngå skade på stapedial arterien, en gren fra arteria carotis interna, noe som ville føre til livstruende blødninger.
Mus med bullostomy eller transtympanic operasjoner bevarte hørsel gjennom hele forsøket, i likhet med ikke-opererte kontroller (figur 3). ABR terskler som svar på klikk og tonestøt ikke endres vesentlig etter mikro forhold til baseline-verdier. Det ble ikke observert signifikante forskjeller mellom bullostomy og transtympanic tilnærminger. Morfologiske studier ble utført for å bekrefte riktig kjøretøy levering inn i mellomøret, og for å vurdere potensielle endringer forårsaket av prosedyrene i cochlea cytoarchitecture. Ingen av de viktigste cochlea regioner showed morfologiske endringer og dyr fra begge fremgangsmåtene presentert en lignende morfologi av alle cochlea strukturer (figur 4A). I tillegg ble cochlea profiler for gen-ekspresjon av pro- og anti-inflammatoriske cytokiner også studert. Til tross for mangel på funksjonelle forskjeller i ABR data mellom de to fremgangsmåter, bullostomy forårsaket en sterkere inflammatorisk respons enn den transtympanic måte (figur 4B).
Figur 1. Experimental Design og Hearing Assessment. (A) Diagram av den eksperimentelle prosedyre. Høring ble evaluert med ABR før og etter mikro. Cochlea Prøver ble tatt 28 dager etter mikro. (B) Bedøvet mus i utsatt posisjon over varmeputen inne i en lyd-demping kammer, med subdermal Electrodes plassert i hodebunnen mellom ørene over toppunktet av skallen (aktiv, positiv); i parotid regionen under det ytre øret (referanse, negativ) og i ryggen (jord). Den gratis-feltet høyttaler er plassert i en fast avstand (5 cm) som vender mot høyre øre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Microsurgery for Vehicle Application. (A) Ventral visning av tromme bulla. Den bullostomy utføres hale til ansikts nerve med en 27 G nål. (B) RWN og stapedial arterien kan observeres gjennom perforeringen. (C) Den 34 G Kateteret føres gjennom bullostomy mot RW nisje. (D) En måned etter bullostomy, en liten benetearret er til stede i åpningen området (pilspiss). (E) Lateral visning av øret, viser snitt i den ytre øregangen og trommehinnen (firkant). (F) Detalj av trommehinnen. En punktering ble gjort på hale øvre kvadrant av trommehinnen ved hjelp av en 27 G nål (svart stjerne i pars flaccida); injeksjon ble gjort gjennom denne perforering ved hjelp av en 34 G kateter. En ytterligere hull ble laget i den kraniale nedre kvadrant av membranen (hvit stjerne, i pars Tensa) før injeksjonen for å balansere trommehinnetrykket. (G) Utsikt over 34 G kateteret gjennom punktering av trommehinnen. (H) Utsikt over cochlea-regionen 24 timer etter mikrokirurgi. RWN fylt med kjøretøy løsning (stjerne). Lat, lateral; Ro, rostralt; Gjøre, rygg; Ma, hammeren; Co, cochlea; OW, Oval vinduet; RWN, runde vinduet nisje. Skala barer = 200 mikrometer i A, D, F; Skala barer = 100 mikrometer i B, C, H; Skala barer = 1000 mikrometer i E, G. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Hearing Assessment. Utviklingen av ABR terskler (gjennomsnitt ± SEM, i dB SPL) som svar på klikk (A) og tone burst (B) stimuli, før og 7, 14 og 28 dager etter mikrokirurgi i mannlig åtte uker gamle C57BL / 6J mus. Bullostomy (appelsin; n = 11); transtympanic injeksjon (blå; n = 6); ikke-opererte (grå; n = 11), Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
jpg "/>
Figur 4. Cochlear morfologi og Gene Expression Analysis. (A) Morfologi av hoved cochlea strukturer på basis av sneglehuset. Haematoxilin-eosin farging av mid-modiolar parafinsnitt (7 mm), av ører fra ikke-opererte mus og mus én måned etter mikro intervensjon ved bullostomy eller transtympanic injeksjon. Scala medierommet (a, b, c) presenterer alle de viktigste komponentene. Detaljer om hver av disse strukturene (nummererte bokser) er vist i de etterfølgende bilder: spiral ganglion (1), organ Corti (2), spiral ligament (3) og stria vascularis (4). Indre hår celle (stjerne); ytre hårcellene (leder av pil). Skala barer = 100 um i a, b, c; Skala barer = 50 mikrometer i a-1,2,3,4. (B) cochlea uttrykk av betennelsesmarkører 28 d etter mikrokirurgi. Sammenligning mellom bullostomy (oransje) og transtympanic injeksjon (blå) og ikke-opererte mus (hvit). *: Non-opererte vs.opererte grupper; ^: Sammenligning mellom opererte grupper. Genuttrykk nivåer er representert som to - ΔΔCt, eller n-ganger forskjell i forhold til ikke-opererte group.Values er presentert som gjennomsnitt ± SEM av tre paralleller fra pool prøver av tre mus per tilstand. Statistisk signifikans: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Lokal levering av legemidler til det indre øret kan gjøres direkte av intracochlear injeksjon eller indirekte ved intratympanic administrasjon, plassere stoffet i mellomøret 4, 19, 39. Intracochlear administrasjon gir kontrollert og presis levering av legemidler til sneglehuset, unngå diffusjon gjennom vinduet membraner, basal-til-apikal konsentrasjons gradienter og klaring gjennom øretrompeten. Imidlertid er det vanligvis en meget invasiv prosedyre som krever en kompleks og delikat mikro 7, 39. I denne sammenheng er næringen utvikle nye, belagt, implanterbare enheter for vedvarende legemiddeldosering 40, 41. På den annen side, er intratympanic administrering kan en minimalt invasiv og lett å utføre fremgangsmåten som tillater injeksjon av større mengder av Drug inn i mellomøret, selv om farmakokinetikk er ikke lett å kontrollere. Flertallet av medikamentet frigjøres gjennom øretuben og den gjenværende fraksjon har til å diffundere gjennom membranen RW for å nå sneglehuset 18. RW er stedet for maksimal absorpsjon av stoffer fra mellomøret inn i perilymph fylte trommekanal cochlea 7. Det er en halvgjennomtrengelig trelagsstruktur, selv om dens permeabilitet er avhengig av narkotika egenskaper (størrelse, konsentrasjon, løselighet og elektrisk ladning) og på trans transportsystemer (diffusjon, aktiv transport eller fagocytose) 42. Den ovale vinduet og otic kapsler er alternative, men mindre effektive innganger til cochlea 43, 44.
Her viser vi og sammenligne to mikro metoder for målrettet levering av legemidler i musen mellomøret: bullostomy og transtympanic injeksjonsprosedyrer. Vanlige kritiske trinn i disse fremgangsmåtene omfatter: i) en evaluering av hørsel før og etter mikrokirurgi, ii) fremstilling av en homogen kjøretøy oppløsning under sterile betingelser, iii) nøye overvåkning av anestesiprosedyre og overvåkning av dyrekroppstemperatur og konstanter, iv ) langsom plassering av riktig volum bærer rettet mot RW, og iv) tar cochlea prøver å fullføre molekylære og morfologiske analyser.
Retroauricular og ventral tilnærminger for bullostomy har blitt beskrevet 7, 45. Vi brukte ventral tilnærming fordi vår erfaring har resultert i mindre sykelighet og gitt bedre tilgang til RW 46. Transtympanic injeksjoner er vanligvis utføres gjennom pars TENSA av trommehinnen, anterior eller posterior til hammeren manubrium 12. IDette arbeidet utførte vi en modifikasjon av teknikken, en injeksjon gjennom pars flaccida utenfor hammeren med en foregående ytterligere punktering av pars Tensa for å tillate luft evakuering under injeksjon.
Den transtympanic injeksjon var mindre invasiv enn bullostomy, selv om begge microsurgeries var rask (20 og 5 min per øre for bullostomy og transtympanic tilnærming henholdsvis), med korte postoperative rekreasjon ganger og ingen sykelighet. Viktigst, begge prosedyrene vedlikeholdes hørsel og ABR-parametere var identiske med de som ble bestemt før den mikrokirurgi. Den transtympanic tilnærmingen tar mindre tid enn den bullostomy og kan utføres i begge ørene av samme dyret i løpet av den samme intervensjon. Fordeler med den transtympanic injeksjon er således at den kan utføres bilateralt og gjentatt om nødvendig. På den annen side, gir bullostomy direkte visuell adgang til RW membranen og tillater Filling av RW nisje. I kontrast, ikke transtympanic injeksjon ikke tillate for kontroll av kjøretøy plassering i RW nisje.
Prosedyrene rapportert i dette arbeidet beskriver hvordan du utfører en lokale stoffet kjøretøy levering til mellomøret for pre-kliniske applikasjoner som for eksempel evaluering av ototoksisitet og evaluering av effekt i hørselstap. To mikrokirurgi fremgangsmåter er beskrevet som gir alternative metoder med spesielle fordeler og ulemper. Både bevare hørselen og ikke forårsake morfologiske forandringer. Lokal betennelse er beskrevet som en potensiell komplikasjon av bullostomy. Et sett med komplementære teknikker er også beskrevet for postsurgical prosedyrer, inkludert hørsel, morfologiske og inflammatoriske markør uttrykk evalueringer. Fremtidige søknader om disse teknikkene inkluderer prekliniske evaluering av nye behandlingsformer for hørselstap, inkludert genetiske, cellulære og farmakologiske tilnærminger, i dyremodeller. Intratympanic Sjefioner sikre levering av behandlingen i mellomøret, i kontakt med det runde vindu membranen, lette passasje inn i perilymph uten tydelig skade sneglehuset.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Genomics og invasiv Neurofunctional evalueringstjenester (IIBM, CSIC-UAM) for deres tekniske support. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd av den spanske "Ministerio de Economia y Competitividad" (FEDER-SAF2014-53979-R) og Den europeiske union (FP7-AFHELO og FP7-PEOPLE-TARGEAR) til IVN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
| Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
| Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
| Water pump | Gaymar | # TP472 | |
| Surface disinfectant | José Collado SA | # CR-36 | |
| Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
| Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
| Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
| System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
| Statistics software (SPSS) | IBM | ||
| Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
| Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer |
| Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
| Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
| Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
| Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h. |
| Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
| Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
| Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
| Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
| Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
| Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
| Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
| Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
| Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
| Microlance 27 G | Becton Dickinson | # 302200 | |
| Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
| Catheter (Microfil 34 G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
| Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
| Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
| Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
| Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
| Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
| Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
| Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
| RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
| RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
| Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
| cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
| Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
| Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |
References
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing impairment: a panoply of genes and functions. Neuron. 68 (2), 293-308 (2010).
- Muller, U., Barr-Gillespie, P. G. New treatment options for hearing loss. Nat Rev Drug Discov. 14 (5), 346-365 (2015).
- Okano, T. Immune system of the inner ear as a novel therapeutic target for sensorineural hearing loss. Front Pharmacol. 5, 205 (2014).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- Horie, R. T., et al. Stealth-nanoparticle strategy for enhancing the efficacy of steroids in mice with noise-induced hearing loss. Nanomedicine (Lond). 5 (9), 1331-1340 (2010).
- Kanzaki, S., et al. Novel in vivo imaging analysis of an inner ear drug delivery system: Drug availability in inner ear following different dose of systemic drug injections. Hear Res. 330 (Pt A), 142-146 (2015).
- Paulson, D. P., et al. A novel controlled local drug delivery system for inner ear disease). Laryngoscope. 118 (4), 706-711 (2008).
- Fetoni, A. R., Troiani, D., Eramo, S. L., Rolesi, R., Paludetti Troiani, G. Efficacy of different routes of administration for Coenzyme Q10 formulation in noise-induced hearing loss: systemic versus transtympanic modality. Acta Otolaryngol. 132 (4), 391-399 (2012).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Direct drug application to the round window: a comparative study of ototoxicity in rats. Otolaryngol Head Neck Surg. 141 (5), 584-590 (2009).
- Pullens, B., van Benthem, P. P. Intratympanic gentamicin for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (3), (2011).
- Lavigne, P., Lavigne, F., Saliba, I. Intratympanic corticosteroids injections: a systematic review of literature. Eur Arch Otorhinolaryngol. , (2015).
- Park, S. H., Moon, I. S. Round window membrane vibration may increase the effect of intratympanic dexamethasone injection. Laryngoscope. 124 (6), 1444-1451 (2014).
- Phillips, J. S., Westerberg, B. Intratympanic steroids for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (7), (2011).
- Trune, D. R., Canlon, B. Corticosteroid therapy for hearing and balance disorders. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1928-1943 (2012).
- Wei, B. P., Stathopoulos, D., O'Leary, S. Steroids for idiopathic sudden sensorineural hearing loss. Cochrane Database Syst Rev. 7, (2013).
- Varela-Nieto, I., Silvia, M. -C., Rodriguez-de la Rosa, L. ourdes, Lassaletta, L. uis, Contreras, J. ulio IGF-I deficiency and hearing loss: molecular clues and clinical implications. Pediatr Endocrinol Rev. 10 (4), 12 (2013).
- Nakagawa, T., et al. Audiometric outcomes of topical IGF1 treatment for sudden deafness refractory to systemic steroids. Otol Neurotol. 33 (6), 941-946 (2012).
- Liu, H., et al. Evaluation of intratympanic formulations for inner ear delivery: methodology and sustained release formulation testing. Drug Dev Ind Pharm. 40 (7), 896-903 (2014).
- Nakagawa, T., Ito, J. Local drug delivery to the inner ear using biodegradable materials. Ther Deliv. 2 (6), 807-814 (2011).
- Buckiova, D., et al. Minimally invasive drug delivery to the cochlea through application of nanoparticles to the round window membrane. Nanomedicine. 7 (9), 1339-1354 (2012).
- Stover, T., Yagi, M., Raphael, Y. Cochlear gene transfer: round window versus cochleostomy inoculation. Hear Res. 136 (1-2), 124-130 (1999).
- Ahmed, T. A., Aljaeid, B. M. Preparation, characterization, and potential application of chitosan, chitosan derivatives, and chitosan metal nanoparticles in pharmaceutical drug delivery. Drug Des Devel Ther. 10, 483-507 (2016).
- Bhattarai, N., Gunn, J., Zhang, M. Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 62 (1), 83-99 (2010).
- Rao, S. B., Sharma, C. P. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential. J Biomed Mater Res. 34 (1), 21-28 (1997).
- Supper, S., et al. Thermosensitive chitosan/glycerophosphate-based hydrogel and its derivatives in pharmaceutical and biomedical applications. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 249-267 (2014).
- Riquelme, R., et al. A comparative study of age-related hearing loss in wild type and insulin-like growth factor I deficient mice. Front Neuroanat. 4, 27 (2010).
- Willott, J. F. Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8 Unit8 21B (2006).
- Cederholm, J. M., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hear Res. 292 (1-2), 71-79 (2012).
- Cediel, R., Riquelme, R., Contreras, J., Diaz, A., Varela-Nieto, I. Sensorineural hearing loss in insulin-like growth factor I-null mice: a new model of human deafness. Eur J Neurosci. 23 (2), 587-590 (2006).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Insulin receptor substrate 2 (IRS2)-deficient mice show sensorineural hearing loss that is delayed by concomitant protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) loss of function. Mol Med. 18, 260-269 (2012).
- Ngan, E. M., May, B. J. Relationship between the auditory brainstem response and auditory nerve thresholds in cats with hearing loss. Hear Res. 156 (1-2), 44-52 (2001).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Grewal, A. S., Nedzelski, J. M., Chen, J. M., Lin, V. Y. Dexamethasone uptake in the murine organ of Corti with transtympanic versus systemic administration. J Otolaryngol Head Neck Surg. 42, 19 (2013).
- Camarero, G., et al. Delayed inner ear maturation and neuronal loss in postnatal Igf-1-deficient mice. J Neurosci. 21 (19), 7630-7641 (2001).
- Rodriguez-de la Rosa, L., et al. Comparative gene expression study of the vestibular organ of the Igf1 deficient mouse using whole-transcript arrays. Hear Res. 330 (Pt A), 62-77 (2015).
- Sanchez-Calderon, H., et al. RNA microarray analysis in prenatal mouse cochlea reveals novel IGF-I target genes: implication of MEF2 and FOXM1 transcription factors. PLoS One. 5 (1), e8699 (2010).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Ruebhausen, M. R., Brozoski, T. J., Bauer, C. A. A comparison of the effects of isoflurane and ketamine anesthesia on auditory brainstem response (ABR) thresholds in rats. Hear Res. 287 (1-2), 25-29 (2012).
- Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. J Control Release. 174, 171-176 (2014).
- Astolfi, L., et al. Cochlear implants and drug delivery: In vitro evaluation of dexamethasone release. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (2), 267-273 (2014).
- Roche, J. P., Hansen, M. R. On the Horizon: Cochlear Implant Technology. Otolaryngol Clin North Am. 48 (6), 1097-1116 (2015).
- Duan, M. -l, Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. Journal of Otology. 4 (1), 34-43 (2009).
- Mikulec, A. A., Plontke, S. K., Hartsock, J. J., Salt, A. N. Entry of substances into perilymph through the bone of the otic capsule after intratympanic applications in guinea pigs: implications for local drug delivery in humans. Otol Neurotol. 30 (2), 131-138 (2009).
- Kang, W. S., et al. Intracochlear Drug Delivery Through the Oval Window in Fresh Cadaveric Human Temporal Bones. Otol Neurotol. 37 (3), 218-222 (2016).
- Lajud, S. A., et al. A regulated delivery system for inner ear drug application. J Control Release. 166 (3), 268-276 (2013).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res. 151 (1-2), 106-114 (2001).
