Abstract
Vi præsenterer to minimalt invasive mikrokirurgiske teknikker i gnavere til specifik lægemiddeltilførsel ind i mellemøret, således at den kan nå det indre øre. Den første procedure består af perforation af trommehinden bulla, betegnet bullostomy; den anden er en transtympanic injektion. Begge emulere humane kliniske intratympanic procedurer.
Chitosan-glycerophosphat (CGP) og Ringers laktat puffer (RL) blev anvendt som biokompatible vehikler til lokal lægemiddeladministration. CGP er en ikke-toksisk bionedbrydelig polymer i vid udstrækning anvendes i farmaceutiske anvendelser. Det er en viskos væske ved stuetemperatur, men det størkner til en semi fast fase ved legemstemperatur. RL er en isotonisk opløsning, der anvendes til intravenøse administrationer i mennesker. En lille volumen af dette køretøj er præcist placeret på det runde vindues (RW) niche ved hjælp af en bullostomy. En transtympanic injektion fylder mellemøret og tillader mindre kontrol, men bredere adgang til det indre øre.
Begge procedurer er egnede som lægemiddelafgivelsessystemer metoder i musen mellemøret, selvom transtympanic injektion viste sig at være mindre invasiv end bullostomy.
Introduction
Nedsat hørelse er den hyppigste menneskelige sensoriske underskud og påvirker 5,3% af den samlede befolkning i verden, og 30% af personer over 65 år ( http://www.who.int/topics/deafness/en , opdateret 2016). Høretab påvirker sprogtilegnelse hos børn og accelererer kognitiv tilbagegang hos ældre mennesker. Derfor er det en betydelig sundhedspleje problem med en enorm samfundsøkonomiske konsekvenser. Det kan være forårsaget af genetiske defekter, miljømæssige faktorer eller en kombination af begge 1, som i sidste ende inducere skade og død hårceller og neuroner i cochlea. Disse celler ikke regenerere i pattedyr, derfor cellulære tab og samtidig høretab kan ikke vendes. Kliniske muligheder er baseret på proteser, herunder høreapparater og cochlear, mellemøret og knogle ledningsforstyrrelser implantater 2. Desværre er der ingen specifik medicinsk genoprettende skatments til nedsat hørelse og dermed flere forskningsprojekter linjer er fokuseret på udviklingen af forebyggende og reparative behandlinger. Nye terapeutiske muligheder omfatter gen- og celleterapi samt udvikling af små molekyler for farmakologisk terapi 2.
En af de vigtigste udfordringer i cochlear farmakologisk terapi er drug delivery. Systemiske behandlinger har begrænset virkningsfuldhed i cochlea grund af blod-labyrint barriere 3, kontinuerlig endotel i kontakt med cochlear blodkar, der fungerer som en fysisk og biokemisk barriere for at opretholde indre øre fluid homeostase, derfor begrænse drug passage til det indre øre. Det er permeabel kun små fedtopløselige molekyler, selv om der kan forøget permeabilitet under cochlear inflammation, og også med anvendelsen af diuretika eller osmotiske midler. Volumenet af lægemiddel, der når til sidst cochlea efter systemisk administration er reduceret;Derfor er høje doser, der kan forårsage økologiske toksicitet påkrævet. Desuden kan hepatisk metabolisme af lægemidlet toksisk eller inaktive metabolitter 4, 5, 6, 7. I modsætning hertil lokale interventioner tillade placering af en kendt begrænset mængde af lægemidlet i midten eller indre øre uden uønskede bivirkninger 4, 7, 8, 9. I nuværende klinisk praksis, er intratympanic forvaltninger begrænset til bestemte cochlear patologier, såsom gentamicin i Menières sygdom 10, kortikosteroider i pludselig døvhed, Menières sygdom, immun-medieret og støj høretab, 11, 12, 13, 14, 15 og insulin-lignende vækstfaktor 1 (IGF1) i pludselig døvhed 4, 16, 17.
Formuleringer til lokal administration bør bevare den fine homeostase (pH og osmolaritet) af cochlear væsker. Desuden er det meget vigtigt at opretholde sterilitet under hele processen for at undgå bakteriel forurening af cerebrospinalvæsken. Excipiensen anvendes til lægemiddelafgivelse skal være biokompatible, nonototoxic og af den passende konsistens. Flydende opløsninger anbefales til intracochlear injektioner, men er ikke egnede til den intratympanic rute på grund af clearance gennem det eustakiske rør. I dette tilfælde er lægemidler sædvanligvis båret af halvfaste geler til at øge deres bestandighed i mellemøret 4, 18, 19. Alternativ levering systems anvendt som bærere til at forøge passagen af lægemidlet til det indre øre er nanopartikler 20 og adenovira 21 Her vi sammenlignet to køretøjer: CGP og en RL-opløsning. CGP er en hydrogel dannet ved chitosan, et lineært polysaccharid sammensat af D-glucosamin og N-acetyl-D-glucosamin opnået fra skaldyrsskaller og β-glycerophosphat, en polyol, der danner et skjold af vand omkring chitosankæder og fastholder det i flydende form. CGP er varmefølsomt og kan nedbrydes af lysozymer, tillader en langvarig lægemiddelfrigivelse i mellemøret 22, 23, 24, 25. Chitosan-base hydrogeler er egnede vehikler til kliniske anvendelser, såsom lægemiddelafgivelse på grund af deres manglende immunogenicitet og manglende aktivering af lokale inflammatoriske reaktioner 23, 24. På othER hånd, RL-buffer er en ikke-pyrogen isotonisk opløsning (273 mOsm / l og pH 6,5) beregnet til intravenøs indgivelse til mennesker som en kilde til vand og elektrolytter, især i blodtab, traumer eller brandskader fordi biprodukter af lactat metabolisme i leveren modvirke acidose.
Her beskriver vi og sammenligne to kirurgiske metoder, der er blevet raffineret til lokal lægemiddeltilførsel til musen indre øre. Sikkerhedsprofilen for begge teknikker blev vurderet ved anvendelse af funktionelle, morfologiske og molekylære test. Hearing blev evalueret under anvendelse Auditory hjernestammen Response (ABR) 26, 27 udført før og efter mikrokirurgi på forskellige tidspunkter. End-point procedurer blev anvendt til at dissekere cochlea og sammenligne de anatomiske, cellulære og molekylære virkninger af disse to mikrokirurgiske procedurer.
Protocol
Sørg for, at procedurerne for håndtering dyret er i overensstemmelse med internationale og nationale regler. Protokollen følger Det Europæiske Fællesskab 2010/63 / EU og spansk RD 53/2013 retningslinjer, hhv.
1. Generelt Animal Handling
- Feed mus ad libitum med en standard diæt og drikkevand. Kontrol sundhed og trivsel ved at følge Federation for Laboratory Animal Science Associations (FELASA) henstillinger.
Vurdering 2. Høring
BEMÆRK: Spor funktionel virkning af mikrokirurgiske procedurer ved testning hørelse før og mange gange efter operationen (i dette arbejde 2, 7, 14 og 28 d postmicrosurgery) med non-invasive procedurer såsom ABR 9.
- For ABR testning, bedøver mus med kortvarige virkning protokoller dvs. intraperitoneal injektion af ketamin (100 mg / kg legemsvægt (BW) og xylazin (10mg / kg, BW). Alternativt udføre høreprøver under inhalant anæstesi.
BEMÆRK: Da ABR parametre kan påvirkes af den bedøvende protokol 28, skal du bruge den samme hele eksperimentet. - Check anæstesidybden ved at teste tå-pinch refleks.
BEMÆRK: Når tilbagetrækning refleks forsvinder, har dyret nået en passende dybde af bedøvelse for at udføre auditive test. - Beskytte øjnene mod udtørring og sekundær keratoconjunctivitis sicca ved topisk administration af tåre kosttilskud, såsom hydroxypropylmethylcellulose-baserede geler.
- Hold musen ved fysiologisk temperatur (37,5-38 ° C) under hele proceduren. For at undgå elektrisk interferens, skal du bruge en varm vandpumpe og varmepuder. Overvåg kropstemperaturen med rektale sonder. Altid passe på ikke at overophede dyret.
BEMÆRK: Vi anbefaler rengøring af varmepude med en overflade desinfektionsmiddel mellem mus.0; For anæstesi induktion og nyttiggørelse, elektriske varmepuder, glødelamper eller infrarødt lys, kan anvendes. - ABR procedure
BEMÆRK: ABR registrering bruge en computer arbejdsstation med en indenbords lydkort til at skabe kurver (digital til analog, DA output, konvertering) og at digitalisere elektriske respons kurver (analog til digital, AD indgang), en lyddæmper, et oscilloskop og en lavimpedant forstærker. Moderne auditive arbejdsstationer (dvs. Tucker Davis Techonologies) omfatter alle disse komponenter i en enkelt kompakt system.- Placer den bedøvede mus i bugleje på varmepuder inden for en lyd-dæmpende kammer for at undgå omgivende støj interferens og efterklang (figur 1).
- Levere akustiske stimuli ind i den ydre øregang. Brug forudindstillede stimuli eller nye signaler designet med den relevante software. Tilslut DA arbejdsstation output til den valgte højttaler.
BEMÆRK: Free-field eller lukket-field højttalere indsat i den ydre øregang kunne anvendes. Førstnævnte foretrækkes når der arbejdes med mus på grund af vanskeligheder i sonden indføring og lyd kalibrering i lukkede systemer. Frit felt højttalere stimulere begge ører og fremkalde en binaural respons. For at opnå overvejende mono reaktioner med frit felt højttalere, kontralateral aktivitet skal elimineres ved okklusion (dvs. med ørepropper), eller ved at skjule støjen.- Placer frit felt højttaler i en fast afstand (normalt 5-20 cm), som vender hovedet eller valgte øre med centrum af højttaleren linie med den ydre øregang. Sørg for, at ingen forhindringer er mellem højttaleren og øret, og at ydre øre er helt åben.
- Placer rustfrit stål subdermale nåleelektroder som følger: i) det aktive (positiv) elektrode i hovedbunden mellem ørerne (over toppunktet af kraniet), ii) referencen (negativ) elektrode, i parotidealeområdet under øreflippen, og iii) jordelektroden i ryggen, hale eller bagben region (figur 1).
- Kontrollér den elektriske impedans i de positive og negative elektroder. Sørg for, at impedans er mindre end 3 kOhm (ideelt en kOhm). Hvis den er højere, flytte, ren med alkohol eller udskift elektroderne.
- For ABR optagelse generere bredbånd klik og rene tone frekvenser og til stede ved faldende intensiteter 90-10 dB i forhold til lydtryksniveauet (SPL) i 5-10 dB SPL trin 27, 29, 30.
- Nuværende korte klik eller tone burst stimuli (1-5 ms) begynder med højt niveau (dvs. 80 eller 90 dB SPL) og reducere intensiteten i 5-10 dB SPL trin. Registrer den elektriske reaktion i de første 10 ms efter stimulering (fremkaldte ABR reaktioner vises 6-8 ms).
BEMÆRK: Af denne grund, stimulering satserbør ikke være højere end 50 stimuli / s (normale sats 20-50).
- Nuværende korte klik eller tone burst stimuli (1-5 ms) begynder med højt niveau (dvs. 80 eller 90 dB SPL) og reducere intensiteten i 5-10 dB SPL trin. Registrer den elektriske reaktion i de første 10 ms efter stimulering (fremkaldte ABR reaktioner vises 6-8 ms).
- Forstærk, registrere og gennemsnittet den fremkaldte elektriske respons på hver stimulus og intensitet. Brug en forstærker med lav støj og et godt signal-til-støj-forhold, og tilslut det til AD input.
BEMÆRK: ABR'er har meget lave amplituder, typisk under 1 μV (peak-to-peak) og skal registreres ved hjælp af en forstærker med meget lav støj. I normale hørelse mus, klare ABR bølger opstår efter gennemsnitligt 100 - 200 besvarelser, men for at få optagelser af høj kvalitet, eller i tilfælde af nedsat hørelse, er flere gentagelser anbefales (750-1,000) 27. - Visuelt bestemme ABR tærskel under testen.
BEMÆRK: ABR tærskelværdi er den laveste lydstimuli intensitet, som fremkalder en pålidelig ABR optagelse med bølger I-IV klart synlig og medium peak-to-peak spænding 2 SD over middelværdien baggrund aktivitet 31. Disse data har ikke bekræftet during off-line analyse, sammen med andre parametre, herunder peak og interpeak ventetid, og bølge amplituder. - Udfør dataanalyse enten manuelt eller automatisk.
- For manuel analyse, identificere de 4-5 ABR bølger (I, II, III ... osv.), Og markere toppene (P1, P2, P3 ...) og dale (N1, N2, N3 ...) for hver runde. Når analysen er færdig, eksportere data til regneark eller en tekstfil.
BEMÆRK: Specifik software til elektriske responstid optagelse udfører normalt analysen automatisk. Yderligere målinger kan bestemmes i ABR optagelse som svar på en fast intensitet (dvs. 70 eller 80 dB SPL) eller ved intensiteter i forhold til individuelle klik tærskler (dvs. 15 dB SPL løbet tærskel).
- For manuel analyse, identificere de 4-5 ABR bølger (I, II, III ... osv.), Og markere toppene (P1, P2, P3 ...) og dale (N1, N2, N3 ...) for hver runde. Når analysen er færdig, eksportere data til regneark eller en tekstfil.
- Statistisk analyse af ABR data ved hjælp af passende software. Afhængig af den eksperimentelle design, brug standard parret T-test eller variansanalyse (ANOVA) til at sammenligne vigtigste ABR ParameTERS i de forskellige grupper 26, 30.
BEMÆRK: I longitudinelle studier, er mange funktionelle data indsamlet fra det samme dyr ved forskellige tidsmæssige punkter (dvs. før og efter mikrokirurgi). I dette tilfælde en generel lineær model gentagen foranstaltning test giver en detaljeret variansanalyse.
3. Køretøjets Forberedelse
- Fremstille og anvende køretøjer opløsninger under sterile betingelser.
BEMÆRK: Flydende løsninger normalt ryddet hurtigt gennem det eustakiske rør. Forskellige injicerbare afgivelsessystemer vil kunne anvendes til at øge opholdstiden for lægemidlet i mellemøret, herunder hydrogeler og nanopartikler 32.- Til fremstilling CGP-hydrogel, opløses 75% deacetyleret chitosan i 0,2 M eddikesyre til opnåelse af en 1,5-2% (vægt / vægt) chitosanopløsning. Tilføj 9% glycerophosphat (vægt / vægt) til denne opløsning 7. Forbered løsningenlige før administration og opbevar hydrogelen ved 4 ° C indtil anvendelse.
BEMÆRK: CGP-hydrogel er moderat viskøs men stadig injicerbar ved denne temperatur. Under 4 ° C den bliver til en fast fase, blokerer dens anvendelse. Efter påføring CGP undergår en faseovergang til en halvfast gel i omkring 15 min ved 37 ° C. - Portion (0,5 ml) kommercielle RL buffer og opbevares ved 4 ° C indtil brug.
- Til fremstilling CGP-hydrogel, opløses 75% deacetyleret chitosan i 0,2 M eddikesyre til opnåelse af en 1,5-2% (vægt / vægt) chitosanopløsning. Tilføj 9% glycerophosphat (vægt / vægt) til denne opløsning 7. Forbered løsningenlige før administration og opbevar hydrogelen ved 4 ° C indtil anvendelse.
4. Mikrokirurgiske Procedurer
- Inducere generel anæstesi med ketamin baseret kombinationer af sedativer og analgetika (dvs. ketamin 100 mg / kg, medetomidin 0,05 mg / kg og phentanile 0,025 mg / kg) ved intraperitoneal injektion efterfulgt af inhalant midler (dvs. isofluran).
- Efter administration injicerbare stoffer, justere bedøvende ansigtsmasken til musen snude og tilslut O 2 levering til isofluran damp. Vedligehold indånding anæstesi undermikrokirurgi og overvåge bedøvelsesmiddel fly med tå-pinch refleks og vejrtrækning. Begynd kirurgisk forberedelse, når refleks er helt afskaffet, og musen præsenterer regelmæssig vejrtrækning.
- Oprethold kropstemperaturen med varmepuder under hele proceduren og beskytte øjnene mod hornhindens keratitis med en hydroxypropylmethylcellulose-baserede gel.
- Forbered en ren kirurgisk område ved hjælp af sterile forhæng. Sterilisere mikrokirurgiske instrumenter med en glas-perle sterilisator før operation. Oprethold sterile forhold under hele kirurgiske procedure (sterile handsker, gardiner, kirurgiske instrumenter, etc.).
- mikrokirurgi
- Bullostomy
BEMÆRK: Bullostomy er en ensidig procedure. Drive en øre af musen og bruge den kontralaterale øre som kontrol.- Placer musen på et decubitus liggende stilling. Forbered kirurgiske område på den ventrale overflade af halsen ved hjælp trimming tilfjerne pelsen. Rens huden med povidon jod baseret antiseptisk opløsning, og dække det med sterile forhæng.
- Ved hjælp af en skalpel en 2 cm længdesnit fra underkæben til kravebenet.
- Under forstørrelse med en kirurgisk mikroskop, identificere de submandibulære kirtler og adskille begge med pincet. Træk de submandibulære kirtler og lokalisere oprindelsen af digastric muskler og facial nerve.
- Lave et snit i oprindelsen af kan kæbe muskler med en saks, og trække det ventralt, og udsætter den underliggende inferior-mediale aspekt af den tympaniske bulla.
- Foretag en åbning i bulla ved at bore ind i det med en 27 G nål (figur 2A). Lokalisere stapedial arterie og RW membranen kaudalt for den (figur 2B). Rengør blod fra det borede område med en absorberbar gelatinesvamp.
- Ved hjælp af en 34 G kateter og et glas mikro sprøjte, langsomt injicere 3-5 μL Køretøjets opløsning (CGP-hydrogel eller RL) gennem bullostomy direkte på RW niche, udfylde det (figur 2C). Forsegl bullostomy med 1-2 dråber væv klæbemiddel.
- Returnér submandibulære kirtler til deres oprindelige position, og luk huden indsnit med 5-0 silke kirurgisk sutur. Påfør et chlorhexidin-baseret antiseptisk omkring indsnit for at undgå sårinfektion. BEMÆRK: Absorberbare og ikke-absorberbare suturer kan anvendes. Ikke-absorberbare suturer skal fjernes i 2 uger. Silke anbefales ikke til hud lukning, da dets anvendelse er forbundet med indsnit infektion og lokale vævsreaktioner.
- Bilateral transtympanic injektion
- Placer musen i den laterale decubitus position og forberede en aseptisk kirurgisk område under den ydre øregang som beskrevet i 4.3.1.1.
- Lav et 0,5 cm længdesnit i den lodrette del af den ydre øregang tæt tragus og sfdeling interne kutan fold af øreflippen (valgfrit).
- Find trommehinden ved enden af den ydre øregang ved anvendelse af et kirurgisk mikroskop (fig 2E) og identificere de øvre Pars flaccida og ringere pars Tensa, som er opdelt i anteriore og posteriore snit i håndtaget af malleus (figur 2F) .
- Lav en lille myringostomy i caudale del af pars flaccida. Få et ekstra snit i pars Tensa af trommehinden, så luften evakuering under injektion 33. Forsigtigt injicere 10-15 pi køretøj (CGP-hydrogel eller RL) opløsning med et glas mikro sprøjte forbundet til et 34 G kateter gennem pars flaccida, tæt på RW niche indtil mellemøret er klart fuld.
- Luk huden indsnit med en 5-0 silke kirurgisk sutur og ren som beskrevet i 4.3.1.7.
- Placer musen på sin anden side og operspiste den kontralaterale øre (trin 4.3.2.1-til 4.3.2.5).
- Bullostomy
- Hold musen på en varmepude, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
- Overvåg huld, aktivitet og tilstedeværelsen af tegn på smerte eller stress. Tilvejebringe analgetika hvis nødvendigt (dvs. Buprenorphin 0,05 mg / kg, Carprofen 5-10 mg / kg). Gennemgå operationssåret dagligt og fjerne lukninger hud 7-14 dage postoperativt efter at have kontrolleret, at såret er helet.
5. Morfologisk Evaluering af Cochlear Cytoarchitecture
- Aflive musen ved slutningen af forsøget (i dette arbejde 28 dage postmicrosurgery), med en intraperitoneal pentobarbital overdosis (100 mg / kg) for at studere de langsigtede virkninger af kirurgi.
- Udfør en transcardial perfusion med koldt 0,1 M fosfat-bufferSaltvand (PBS), pH 7,5, efterfulgt af 4% (vægt / volumen) paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M PBS, pH 7,5 som beskrevet 26.
ADVARSEL: Paraformaldehyd er meget giftig; undgå kontakt med hud, øjne eller slimhinder. Undgå at indånde pulveret under måling og forberedelse. - Brug et stereomikroskop at dissekere den indre øre fra den temporale knogle som beskrevet 34, 35 uden at adskille det vestibulære og cochleære bestanddele af det indre øre.
- Fastgør det isolerede indre øre med 4% (vægt / volumen) PFA i 0,1 M PBS, pH 7,5 ved 4 ° C i 12 timer under forsigtig omrystning. Wash 3x i 5 minutter med 0,1 M PBS, pH 7,5.
- Afkalk prøverne med 10% ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) fremstillet i 0,1 M PBS, pH 6,5 ved 4 ° C i 10 d med konstant omrystning, ændre EDTA-opløsning hver 3 d.
- Når cochleae erhverve en blød konsistens, fjerne EDTA og vask 3 x 5 min med 0,1 M PBS, pH 7,5, with rystning ved stuetemperatur.
- Integrer prøverne i paraffin som beskrevet 34 og gøre 7 um tykke cochlear snit parallelt med modiolus.
- At evaluere cochlear cytoarchitecture, bejdse sektioner med hæmatoxylin og eosin (H & E) 30 og bruge et lysmikroskop tilsluttet et digitalt kamera til at tage billeder med 4X og 20X objektiver.
6. Cochlear Gene Expression
- Rengør arbejdsfladen og kirurgiske instrumenter med RNAse dekontaminering løsning.
- Aflive musen, som beskrevet i 5.1 og hurtigt dissekere ud det indre øre fra tindingebenet ved hjælp af et mikroskop. Nedsænkes indre øre i en glasskål indeholdende ribonukleinsyre (RNA) beskytter og stabilisator reagens.
- Fjern den resterende petrous knogle med guldsmed pincet og forsigtigt adskille cochlea fra forhallen ved hjælp Vanna s eye saks 35.
- Umiddelbart transfis de cochlea i en 2 ml mikrocentrifugerør med 80 pi RNA beskytter og stabilisator opløsning og fryse vævet ved at placere røret i tøris. Bevare cochlear prøver ved -70 ° C indtil anvendelse.
- Isoler cochlear RNA som beskrevet 35 og bestemme dens kvalitet og mængde spektrofotometrisk.
- Generer cochlear cDNA fra lige store mængder af total mus RNA ved hjælp af en revers transkription kommercielt kit.
- Udfør QRT-PCR til amplifikation komplementær deoxyribonukleinsyre (cDNA) i tre eksemplarer til måling gentranskripter 35, 36.
BEMÆRK: I dette arbejde pro- og anti-inflammatoriske gen udskrifter af Il1b, IL6, Tgfb1, TNFa, IL10 og Dusp1 blev målt. - Beregn relative udtryk nøgletal ved at normalisere tærskel target udskrift cyklus (Ct) niveauer til det aritmetiske gennemsnit af henvisningen gen-niveau og den relative kvantificering ved at normalisereproblem gruppe transcript niveauer til det aritmetiske gennemsnit af kalibratoren gruppe 37.
Representative Results
Hearing blev testet af ABR før og på flere gange efter mikrokirurgi at evaluere indvirkningen på auditive funktion (figur 1A). ABR registre blev udført under bedøvelse for at undgå dyr bevægelse og spænding artefakter og dermed forbedre dens reproducerbarhed 27. Intraperitonealt administreret ketamin baserede kombinationer eller inhalering isofluran var normalt ansat til at bedøve dyr under ABR tests. Den ketamin / xylazin kombination giver en korttidsvirkende (2-3 min) induktion og en stabil, sikker fase vedligeholdelse, mens de udfører ABR registre. Det skal bemærkes, at isofluran kan påvirke ABR måling følsomhed 38. For ABR registre, er subdermale elektroder placeres bestemte steder (Figur 1B) og den elektriske impedans måles. Hvis impedansen er 3 kOhm eller højere, elektrode positionering skal kontrolleres for at undgå altrationer i ABR bølge amplitude.
Intratympanic levering udføres i mus ved to mikrokirurgiske procedurer (figur 2). Eksponering af bulla under bullostomy indebærer tilbagetrækning af de submandibulære kirtler og digastric muskel. Denne procedure udføres med største omhu, fordi halspulsåren og vagusnerven er meget tæt (figur 2A). Dernæst bulla boret at lokalisere stapedial arterie og RW membran (figur 2B). For at undgå revner knogle, er en lille 0,5 mm blænde lavet med en 27 G nål før boring. Den 34 G kateter ledes gennem bullostomy mod RW membran og et lille volumen køretøjet leveres på vindues fordybning (figur 2C). Den transtympanic injektion udføres gennem et snit i pars flaccida af trommehinden med en 27 G nål; en større kan provokere påøre i membranen. Før injektionen, anbefaler vi at gøre en ekstra indsnit i pars Tensa at tillade udstrømning af luft under injektion af køretøjet (figur 2F). Det er afgørende for at undgå beskadigelse af stapedial arterie, en gren af arteria carotis interna, hvilket ville føre til livstruende blødning.
Mus med bullostomy eller transtympanic operationer bevaret hørelse hele eksperimentet, svarende til ikke-opererede kontroller (Figur 3). ABR tærskelværdier i reaktion på klik og tone byger ændrede sig ikke væsentligt efter mikrokirurgi i forhold til baseline værdier. blev ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem bullostomy og transtympanic tilgange. Morfologiske undersøgelser blev udført for at bekræfte korrekt køretøj levering ind i mellemøret, og at vurdere de potentielle ændringer forårsaget af procedurerne i cochlear cytoarchitecture. Ingen af de vigtigste cochlear regioner showed morfologiske ændringer og dyr fra begge procedurer præsenteret en lignende morfologi alle cochleære strukturer (figur 4A). Desuden blev de cochleære profiler for genekspression af pro- og anti-inflammatoriske cytokiner også undersøgt. Trods mangel på funktionelle forskelle i ABR data mellem de to procedurer, bullostomy forårsagede en stærkere inflammatorisk respons end transtympanic tilgang (figur 4B).
Figur 1. Eksperimentel Design og Hearing Assessment. (A) Diagram over den eksperimentelle procedure. Hearing blev evalueret med ABR før og efter mikrokirurgi. Cochlear prøver blev opnået 28 dage efter mikrokirurgi. (B) Bedøvet mus i bugleje over varmepude inde i en lyd-dæmpende kammer, med subdermal electrodes placeret i hovedbunden mellem ørerne over toppunktet af kraniet (aktiv, positiv); i parotis området under øreflippen (reference, negativ) og i ryggen (jorden). De frie felter højttaler er placeret i en fast afstand (5 cm), der vender det højre øre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. mikrokirurgi for Vehicle Application. (A) ventrale visning af tympaniske bulla. Den bullostomy udføres kaudalt for facial nerve med en 27 G nål. (B) RWN og stapedial arterie kan iagttages gennem perforeringen. (C) Den 34 G kateter ledes gennem bullostomy mod RW niche. (D) En måned efter bullostomy, en lille knokletar er til stede i åbningen stedet (pilespids). (E) fra siden af øret, der viser snit i den ydre øregang og trommehinden (firkant). (F) Detalje af trommehinden. En punktering blev foretaget på den kaudale øvre kvadrant af trommehinden ved anvendelse af en 27 G nål (sort asterisk, i pars flaccida); injektionen blev foretaget gennem denne perforering ved hjælp af en 34 G kateter. En yderligere hul blev lavet i kranielle ringere kvadrant af membranen (hvid stjerne, i pars Tensa) forud for injektionen for at afbalancere tympaniske tryk. (G) Visning af 34 g kateteret gennem punkturen af trommehinden. (H) Udsigt til cochlear region 24 timer efter mikrokirurgi. RWN fyldt med vehikel-opløsning (asterisk). Lat, lateral; Ro, rostralt; Gør, dorsal; Ma, Malleus; Co, cochlea; OW, Oval vindue; RWN, runde vindues fordybning. Scale barer = 200 um i A, D, F; Scale barer = 100 um i B, C, H; Scale barer = 1000 um i E, G. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Hearing Assessment. Udviklingen i ABR tærskler (middel ± SEM, i dB SPL) som respons på klik (A) og tone burst (B) stimuli, før og 7, 14 og 28 dage efter mikro-kirurgi hos han- otte uger gamle C57BL / 6J mus. Bullostomy (orange, n = 11); transtympanic injektion (blå, n = 6); ikke-opererede (grå, n = 11), venligst klik her for at se en større version af dette tal.
jpg "/>
Figur 4. Cochlear Morfologi og Gene Expression Analysis. (A) Morfologi af de vigtigste cochlear strukturer på bunden af cochlea. Haematoxilin-eosin farvning af mid-modiolar paraffinsnit (7 um), af ører fra ikke-opererede mus og mus en måned efter mikrokirurgi indgriben fra bullostomy eller transtympanic injektion. Scala media rum (a, b, c) præsenterer alle de vigtigste komponenter. Detaljer for hver af disse strukturer (nummererede kasser) er vist i de efterfølgende billeder: spiral ganglion (1), cortiske organ (2), spiral ligament (3) og stria vascularis (4). Inner hår celle (asterisk); ydre hårceller (hoved af pil). Skalapanelerne = 100 um i a, b, c; Scale barer = 50 um i en-1,2,3,4. (B) Cochlear udtryk af inflammatoriske markører 28 d efter mikrokirurgi. Sammenligning mellem bullostomy (orange) og transtympanic injektion (blå) og til ikke-opererede mus (hvid). *: Ikke-opererede vs.opererede grupper; ^: Sammenligning mellem opererede grupper. Genekspressionsniveauer repræsenteres som 2 - ΔΔCt, eller n-fold forskel i forhold til ikke-opererede group.Values er præsenteret som gennemsnit ± SEM af triplikater fra pool prøver af 3 mus pr tilstand. Statistisk signifikans: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Lokal lægemiddeltilførsel til det indre øre kan udføres direkte ved intracochlear injektion eller indirekte af intratympanic administration, anbringelse lægemidlet i mellemøret 4, 19, 39. Intracochlear administration giver kontrolleret og præcis lægemiddeladministration til cochlea, undgå diffusion gennem vinduet membraner, basal-til-apikale koncentrationsgradienter og afregnes gennem det eustakiske rør. Det er imidlertid sædvanligvis som en meget invasiv procedure, der kræver en kompliceret og vanskelig mikrokirurgi 7, 39. I denne forbindelse er industrien at udvikle nye, overtrukne, implanterbare indretninger til vedvarende lægemiddelfrigivelse 40, 41. På den anden side, intratympanic administration er en minimalt invasiv og let at udføre procedure, som giver injektionen af større volumener af dtæppe ind i mellemøret, selvom farmakokinetikken er ikke let at kontrollere. Størstedelen af lægemidlet clearet gennem eustakiske rør og den resterende fraktion har at diffundere gennem RW membranen for at nå cochlea 18. RW er stedet for maksimal absorption af stoffer fra mellemøret til perilymfe fyldt tympaniske kanal af cochlea 7. Det er en semipermeabel tre lag struktur, selv om dens permeabilitet afhænger af narkotika egenskaber (størrelse, koncentration, opløselighed og elektrisk gebyr) og på transmembrane transportsystemer (diffusion, aktiv transport eller fagocytose) 42. Den ovale vindue og otiske kapsler er alternative, men mindre effektive indgange til cochlea 43, 44.
Her demonstrerer og sammenligne to mikrokirurgiske metoder til målrettet medicinafgivelse i musen mellemøret vi: bullostomy og transtympanic injektion procedurer. Fælles kritiske trin til disse procedurer omfatter: i) en evaluering af retsmøde før og efter mikrokirurgi, ii) udarbejdelse af en homogen køretøj løsning under sterile forhold, iii) nøje overvågning af anæstesiproceduren og overvågning af dyr kropstemperaturen og konstanter, iv ) langsom placering af det passende volumen af vehikel målretning RW, og iv) at tage cochleære prøver at fuldføre molekylære og morfologisk analyse.
Retroauricular og ventrale tilgange til bullostomy er blevet beskrevet 7, 45. Vi brugte den ventrale tilnærmelse fordi vores erfaring det har resulteret i mindre sygelighed og forudsat bedre adgang til RW 46. Transtympanic injektioner er normalt udføres gennem pars Tensa af trommehinden, forreste eller bagerste til malleus manubrium 12. Idette arbejde udførte vi en modifikation af teknikken, en injektion gennem pars flaccida ud over malleus med en tidligere supplerende punktur af pars Tensa at tillade luft evakuering under indsprøjtning.
Den transtympanic injektion var mindre invasiv end bullostomy, selv om begge microsurgeries var hurtig (20 og 5 min pr øre for bullostomy og transtympanic tilgang henholdsvis), med korte postoperative rekreation gange og ingen sygelighed. Vigtigst fastholdt begge procedurer hørelse og ABR parametre var identiske med dem, fastlægges inden mikrokirurgi. Den transtympanic tilgang tager mindre tid end bullostomy og kan udføres i begge ører af det samme dyr i samme intervention. Fordele ved transtympanic injektion er således at den kan udføres bilateralt og gentages, hvis det kræves. På den anden side, bullostomy giver direkte visuel adgang til RW membranen og tillader Filling af RW niche. Derimod finder transtympanic injektion ikke mulighed for styring af køretøjets placering i RW niche.
Procedurerne er rapporteret i dette arbejde beskriver, hvordan du udfører en lokal stof køretøj levering til mellemøret for prækliniske programmer såsom vurdering af ototoksicitet og evaluering af effekt i høretab. To mikrokirurgi procedurer beskrevet, at give alternative metoder med særlige fordele og ulemper. Både bevare hørelse og ikke forårsager morfologiske ændringer. Lokal inflammation er beskrevet som en potentiel komplikation ved bullostomy. Et sæt af komplementære teknikker er også beskrevet for postkirurgiske procedurer, herunder hørelse, morfologiske og inflammatoriske markør udtryk evalueringer. Fremtidige anvendelser for disse teknikker omfatter den prækliniske evaluering af nye terapier for høretab, herunder genetiske, cellulære og farmakologiske tilgange, i dyremodeller. Intratympanic administrationer sikre leveringen af behandlingen i mellemøret, i kontakt med det runde vindues membran, lette passage ind i perilymfe uden indlysende cochlear skade.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Genomics og Noninvasiv neurofunktionelle Evalueringsfaciliteter (IIBM CSIC-UAM) for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den spanske "Ministerio de Economia y Competitividad" (EFRU-SAF2014-53979-R) og Den Europæiske Union (FP7-AFHELO og FP7-PEOPLE-TARGEAR) til IVN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
| Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
| Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
| Water pump | Gaymar | # TP472 | |
| Surface disinfectant | José Collado SA | # CR-36 | |
| Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
| Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
| Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
| System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
| Statistics software (SPSS) | IBM | ||
| Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
| Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer |
| Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
| Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
| Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
| Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h. |
| Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
| Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
| Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
| Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
| Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
| Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
| Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
| Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
| Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
| Microlance 27 G | Becton Dickinson | # 302200 | |
| Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
| Catheter (Microfil 34 G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
| Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
| Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
| Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
| Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
| Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
| Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
| Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
| RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
| RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
| Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
| cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
| Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
| Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |
References
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing impairment: a panoply of genes and functions. Neuron. 68 (2), 293-308 (2010).
- Muller, U., Barr-Gillespie, P. G. New treatment options for hearing loss. Nat Rev Drug Discov. 14 (5), 346-365 (2015).
- Okano, T. Immune system of the inner ear as a novel therapeutic target for sensorineural hearing loss. Front Pharmacol. 5, 205 (2014).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- Horie, R. T., et al. Stealth-nanoparticle strategy for enhancing the efficacy of steroids in mice with noise-induced hearing loss. Nanomedicine (Lond). 5 (9), 1331-1340 (2010).
- Kanzaki, S., et al. Novel in vivo imaging analysis of an inner ear drug delivery system: Drug availability in inner ear following different dose of systemic drug injections. Hear Res. 330 (Pt A), 142-146 (2015).
- Paulson, D. P., et al. A novel controlled local drug delivery system for inner ear disease). Laryngoscope. 118 (4), 706-711 (2008).
- Fetoni, A. R., Troiani, D., Eramo, S. L., Rolesi, R., Paludetti Troiani, G. Efficacy of different routes of administration for Coenzyme Q10 formulation in noise-induced hearing loss: systemic versus transtympanic modality. Acta Otolaryngol. 132 (4), 391-399 (2012).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Direct drug application to the round window: a comparative study of ototoxicity in rats. Otolaryngol Head Neck Surg. 141 (5), 584-590 (2009).
- Pullens, B., van Benthem, P. P. Intratympanic gentamicin for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (3), (2011).
- Lavigne, P., Lavigne, F., Saliba, I. Intratympanic corticosteroids injections: a systematic review of literature. Eur Arch Otorhinolaryngol. , (2015).
- Park, S. H., Moon, I. S. Round window membrane vibration may increase the effect of intratympanic dexamethasone injection. Laryngoscope. 124 (6), 1444-1451 (2014).
- Phillips, J. S., Westerberg, B. Intratympanic steroids for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (7), (2011).
- Trune, D. R., Canlon, B. Corticosteroid therapy for hearing and balance disorders. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1928-1943 (2012).
- Wei, B. P., Stathopoulos, D., O'Leary, S. Steroids for idiopathic sudden sensorineural hearing loss. Cochrane Database Syst Rev. 7, (2013).
- Varela-Nieto, I., Silvia, M. -C., Rodriguez-de la Rosa, L. ourdes, Lassaletta, L. uis, Contreras, J. ulio IGF-I deficiency and hearing loss: molecular clues and clinical implications. Pediatr Endocrinol Rev. 10 (4), 12 (2013).
- Nakagawa, T., et al. Audiometric outcomes of topical IGF1 treatment for sudden deafness refractory to systemic steroids. Otol Neurotol. 33 (6), 941-946 (2012).
- Liu, H., et al. Evaluation of intratympanic formulations for inner ear delivery: methodology and sustained release formulation testing. Drug Dev Ind Pharm. 40 (7), 896-903 (2014).
- Nakagawa, T., Ito, J. Local drug delivery to the inner ear using biodegradable materials. Ther Deliv. 2 (6), 807-814 (2011).
- Buckiova, D., et al. Minimally invasive drug delivery to the cochlea through application of nanoparticles to the round window membrane. Nanomedicine. 7 (9), 1339-1354 (2012).
- Stover, T., Yagi, M., Raphael, Y. Cochlear gene transfer: round window versus cochleostomy inoculation. Hear Res. 136 (1-2), 124-130 (1999).
- Ahmed, T. A., Aljaeid, B. M. Preparation, characterization, and potential application of chitosan, chitosan derivatives, and chitosan metal nanoparticles in pharmaceutical drug delivery. Drug Des Devel Ther. 10, 483-507 (2016).
- Bhattarai, N., Gunn, J., Zhang, M. Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 62 (1), 83-99 (2010).
- Rao, S. B., Sharma, C. P. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential. J Biomed Mater Res. 34 (1), 21-28 (1997).
- Supper, S., et al. Thermosensitive chitosan/glycerophosphate-based hydrogel and its derivatives in pharmaceutical and biomedical applications. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 249-267 (2014).
- Riquelme, R., et al. A comparative study of age-related hearing loss in wild type and insulin-like growth factor I deficient mice. Front Neuroanat. 4, 27 (2010).
- Willott, J. F. Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8 Unit8 21B (2006).
- Cederholm, J. M., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hear Res. 292 (1-2), 71-79 (2012).
- Cediel, R., Riquelme, R., Contreras, J., Diaz, A., Varela-Nieto, I. Sensorineural hearing loss in insulin-like growth factor I-null mice: a new model of human deafness. Eur J Neurosci. 23 (2), 587-590 (2006).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Insulin receptor substrate 2 (IRS2)-deficient mice show sensorineural hearing loss that is delayed by concomitant protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) loss of function. Mol Med. 18, 260-269 (2012).
- Ngan, E. M., May, B. J. Relationship between the auditory brainstem response and auditory nerve thresholds in cats with hearing loss. Hear Res. 156 (1-2), 44-52 (2001).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Grewal, A. S., Nedzelski, J. M., Chen, J. M., Lin, V. Y. Dexamethasone uptake in the murine organ of Corti with transtympanic versus systemic administration. J Otolaryngol Head Neck Surg. 42, 19 (2013).
- Camarero, G., et al. Delayed inner ear maturation and neuronal loss in postnatal Igf-1-deficient mice. J Neurosci. 21 (19), 7630-7641 (2001).
- Rodriguez-de la Rosa, L., et al. Comparative gene expression study of the vestibular organ of the Igf1 deficient mouse using whole-transcript arrays. Hear Res. 330 (Pt A), 62-77 (2015).
- Sanchez-Calderon, H., et al. RNA microarray analysis in prenatal mouse cochlea reveals novel IGF-I target genes: implication of MEF2 and FOXM1 transcription factors. PLoS One. 5 (1), e8699 (2010).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Ruebhausen, M. R., Brozoski, T. J., Bauer, C. A. A comparison of the effects of isoflurane and ketamine anesthesia on auditory brainstem response (ABR) thresholds in rats. Hear Res. 287 (1-2), 25-29 (2012).
- Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. J Control Release. 174, 171-176 (2014).
- Astolfi, L., et al. Cochlear implants and drug delivery: In vitro evaluation of dexamethasone release. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (2), 267-273 (2014).
- Roche, J. P., Hansen, M. R. On the Horizon: Cochlear Implant Technology. Otolaryngol Clin North Am. 48 (6), 1097-1116 (2015).
- Duan, M. -l, Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. Journal of Otology. 4 (1), 34-43 (2009).
- Mikulec, A. A., Plontke, S. K., Hartsock, J. J., Salt, A. N. Entry of substances into perilymph through the bone of the otic capsule after intratympanic applications in guinea pigs: implications for local drug delivery in humans. Otol Neurotol. 30 (2), 131-138 (2009).
- Kang, W. S., et al. Intracochlear Drug Delivery Through the Oval Window in Fresh Cadaveric Human Temporal Bones. Otol Neurotol. 37 (3), 218-222 (2016).
- Lajud, S. A., et al. A regulated delivery system for inner ear drug application. J Control Release. 166 (3), 268-276 (2013).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res. 151 (1-2), 106-114 (2001).
