Abstract
Se presentan dos técnicas de microcirugía mínimamente invasivos en roedores para la administración de fármacos específica en el oído medio de modo que pueda alcanzar el oído interno. El primer procedimiento consiste en la perforación de la ampolla timpánica, denominado bullostomy; la segunda es una inyección transtimpánico. Ambos procedimientos emulan intratimpánicos clínicos humanos.
El quitosano-glicerofosfato (CGP) y el tampón de lactato de Ringer (RL) fueron utilizados como vehículos biocompatibles para la administración de fármacos local. CGP es un polímero biodegradable no tóxico ampliamente utilizado en aplicaciones farmacéuticas. Es un líquido viscoso a temperatura ambiente pero se congela a una fase sólida semi a la temperatura corporal. RL es una solución isotónica utilizado para administraciones intravenosas en los seres humanos. Un pequeño volumen de este vehículo se coloca precisamente en el nicho de la ventana redonda (RW) por medio de un bullostomy. Una inyección transtimpánica llena el oído medio, y permite un menor control pero un acceso más amplio al oído interno.
Ambos procedimientos son apropiados como los métodos de administración de fármacos en el oído medio del ratón, aunque la inyección transtimpánica resultó ser menos invasiva en comparación con bullostomy.
Introduction
La discapacidad auditiva es el déficit sensorial humana más frecuente y afecta a 5,3% de la población en todo el mundo, y el 30% de los individuos mayores de 65 años ( http://www.who.int/topics/deafness/en , actualizado 2016). La pérdida de audición afecta a la adquisición del lenguaje en niños y acelera el deterioro cognitivo en las personas mayores. Por lo tanto, es un problema importante de la salud con un tremendo impacto socioeconómico. Puede ser causada por defectos genéticos, factores ambientales o una combinación de ambos 1, que en el extremo inducir daño y muerte de las células ciliadas y neuronas en la cóclea. Estas células no se regeneran en los mamíferos, por lo tanto, la pérdida celular y la pérdida de audición concomitante no se pueden revertir. Opciones clínicas se basan en dispositivos protésicos, incluyendo audífonos y coclear en el oído medio, y los implantes de conducción ósea 2. Por desgracia, no hay trea restaurador médica específicatments para la discapacidad auditiva y así varias líneas de investigación se centran en el desarrollo de terapias preventivas y reparadoras. Opciones terapéuticas novedosas incluyen terapias génicas y celulares, así como el desarrollo de pequeñas moléculas para el tratamiento farmacológico 2.
Uno de los retos más importantes en la terapia farmacológica coclear es la administración de fármacos. Los tratamientos sistémicos tienen una eficacia en la cóclea limitado debido a la barrera 3-sangre laberinto, endotelio continuo en contacto con los vasos sanguíneos coclear, que actúa como una barrera física y bioquímica para mantener interior homeostasis líquido en el oído, por lo tanto, limitando el paso de drogas en el oído interno. Es permeable sólo para pequeñas moléculas liposolubles, aunque la permeabilidad se puede aumentar durante la inflamación coclear, y también con el uso de diuréticos o agentes osmóticos. El volumen de droga que finalmente llega a la cóclea se reduce después de la administración sistémica;Por lo tanto, se requieren dosis altas que podrían causar toxicidad orgánica. Además, el metabolismo hepático de la droga puede producir metabolitos tóxicos o inactivos 4, 5, 6, 7. En contraste, las intervenciones locales permiten la colocación de una cantidad limitada conocida de la droga en el oído medio o interno sin efectos secundarios indeseables 4, 7, 8, 9. En la práctica clínica actual, las administraciones intratimpánicos se limitan a ciertas patologías cocleares, tales como gentamicina en la enfermedad de Meniere 10, los corticosteroides en la sordera súbita, enfermedad de Meniere, de mediación inmune y la pérdida de audición inducida por ruido, 11, 12, 13, 1Factor de crecimiento de 4, 15 y insulínico tipo 1 (IGF-1) en la sordera súbita 4, 16, 17.
Las formulaciones para la administración local deben preservar la homeostasis delicada (pH y osmolaridad) de fluidos cocleares. Además, es muy importante para mantener la esterilidad durante el proceso para evitar la contaminación bacteriana del líquido cefalorraquídeo. El excipiente utilizado para la administración de fármacos debe ser biocompatible, nonototoxic y de la consistencia adecuada. Se recomiendan soluciones líquidas para inyecciones intracocleares, pero no son adecuados para la ruta intratimpánica debido a la distancia a través de la trompa de Eustaquio. En este caso, los medicamentos son generalmente llevadas por geles semi-sólidos para aumentar su permanencia en el oído medio 4, 18, 19. syste de entrega alternativams utilizados como portadores para aumentar el paso del fármaco en el oído interno son nanopartículas 20 y adenovirus 21 Aquí se compararon dos vehículos: CGP y una solución RL. CGP es un hidrogel formado por quitosano, un polisacárido lineal compuesto de D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina obtenido a partir de conchas de crustáceos, y β-glicerofosfato, un poliol que forma un escudo de agua alrededor de las cadenas de quitosano y la mantiene en forma liquida. CGP es termosensible y puede ser degradado por lisozimas, lo que permite una liberación sostenida del fármaco en el oído medio 22, 23, 24, 25. Hidrogeles de quitosano-base son vehículos adecuados para las aplicaciones clínicas tales como la administración de fármacos debido a su falta de inmunogenicidad y la falta de activación de las reacciones inflamatorias locales 23, 24. En la OTHer mano, tampón RL es una solución isotónica no pirogénica (273 mOsm / L y pH 6,5) destinado a la administración intravenosa en seres humanos como una fuente de agua y electrolitos, especialmente en la pérdida de sangre, trauma o lesiones por quemaduras porque los subproductos del metabolismo de lactato en el hígado contrarrestar acidosis.
Aquí describimos y comparar los dos métodos quirúrgicos que han sido refinados para la administración local de fármacos al oído interno de ratón. El perfil de seguridad de ambas técnicas se evaluó mediante el uso de pruebas funcionales, morfológicos y moleculares. Al oír se evaluó utilizando la respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) 26, 27 realizadas antes y después de la microcirugía en diferentes momentos. procedimientos de punto final se utilizaron para diseccionar la cóclea y comparar el impacto anatómico, celular y molecular de estos dos procedimientos de microcirugía.
Protocol
Asegúrese de que los procedimientos de manejo de animales están en conformidad con las regulaciones internacionales y nacionales. El protocolo sigue el RD Comunidad Europea 2010/63 / UE y española 53/2013 directrices, respectivamente.
Manipulación 1. Animal general
- Los ratones de alimentación ad libitum con una dieta estándar y agua potable. Control de la salud y el bienestar siguiendo Federación de Asociaciones de Animales de Laboratorio de Ciencias (FELASA) recomendaciones.
Evaluación 2. Audiencia
NOTA: Pista impacto funcional de los procedimientos de microcirugía de audiencia antes de la prueba y muchas veces después de la cirugía (en este trabajo 2, 7, 14 y 28 d postmicrosurgery) con procedimientos no invasivos como la ABR 9.
- Para la prueba de ABR, anestesiar los ratones con protocolos de efecto de corta duración, es decir, inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg / kg de peso corporal (BW) y xilazina (10mg / kg, BW). Alternativamente, realizar pruebas de audición bajo anestesia inhalante.
NOTA: Como parámetros ABR pueden ser influenciados por el protocolo anestésico 28, utilizar el mismo durante todo el experimento. - Comprobar la profundidad de la anestesia mediante el ensayo del reflejo del dedo del pie-pellizco.
NOTA: Cuando el reflejo de retirada desaparece, el animal ha alcanzado una profundidad apropiada de la anestesia para realizar la prueba de audición. - Proteger los ojos de la desecación y la queratoconjuntivitis sicca secundaria por la administración tópica de los suplementos de lágrimas, tales como geles a base de hidroxipropilmetilcelulosa.
- Mantenga el ratón a temperatura fisiológica (37,5-38 ° C) durante todo el procedimiento. Para evitar interferencias eléctricas, utilizar una bomba de agua caliente y calentadores. Monitorear la temperatura del cuerpo con sondas rectales. Siempre tenga cuidado de no sobrecalentar el animal.
NOTA: Se recomienda limpiar la almohada eléctrica con un desinfectante de superficies entre los ratones.0; Para la inducción de la anestesia y la recuperación, almohadillas eléctricas, luces incandescentes o infrarrojos se puede utilizar. - procedimiento ABR
NOTA: Para el registro ABR, utilice una estación de trabajo de ordenador con una tarjeta de sonido hacia el interior para crear formas de onda (de digital a analógico, salida de DA, conversión) y digitalizar formas de onda de respuesta eléctrica (analógica para, de entrada AD digital), un atenuador, un osciloscopio y una amplificador de baja impedancia. Estaciones de trabajo auditivos modernos (es decir, Tucker Davis Techonologies) incluyen todos estos componentes en un único sistema compacto.- Coloque el ratón anestesiado en posición boca abajo sobre las almohadillas de calor dentro de una cámara de atenuación de sonido para evitar la interferencia de ruido ambiente y la reverberación (Figura 1).
- Entregar estímulos acústicos en el conducto auditivo externo. Utilizar estímulos preestablecidas o nuevas señales diseñados con el software apropiado. Conectar la salida de la estación de trabajo DA para el altavoz seleccionado.
NOTA: Frealtavoces de campo E o-campo cerrado insertados en el conducto auditivo externo se podrían utilizar. El primero son los preferidos cuando se trabaja con los ratones debido a la dificultad en la inserción de la sonda y la calibración del sonido en sistemas cerrados. altavoces de campo libre estimulan ambos oídos y provocan una respuesta binaural. Para obtener respuestas predominantemente monoaural con altavoces de campo libre, la actividad contralateral tiene que ser eliminado por la oclusión (es decir, con tapones para los oídos) o enmascarando el ruido.- Coloque el altavoz de campo libre a una distancia fija (normalmente 5 a 20 cm) frente a la cabeza o la oreja seleccionado con el centro del altavoz alineado con el conducto auditivo externo. Asegúrese de que no hay obstáculos entre el altavoz y el oído y que el pabellón auricular está completamente abierta.
- Coloque electrodos de aguja subdérmicos de acero inoxidable de la siguiente manera: i) el activo) electrodo (positivo en el cuero cabelludo entre las orejas (sobre el vértice del cráneo), ii) el electrodo de referencia (negativo), en la parótidaregión por debajo del pabellón de la oreja, y iii) el electrodo de tierra en la región de la extremidad hacia atrás, cola o trasera (Figura 1).
- Compruebe la impedancia eléctrica en los electrodos positivos y negativos. Asegúrese de que la impedancia es inferior a 3 kOhm (idealmente 1 kOhm). Si es mayor, cambie de posición, limpia con alcohol o sustituir los electrodos.
- Para la grabación ABR, generar clics de banda ancha y frecuencias de tonos puros y presente en la disminución partir de intensidades el 90 a 10 dB con relación al nivel de presión sonora (SPL) de 5-10 dB SPL pasos 27, 29, 30.
- Presente breve clic o ráfaga de tono de estímulos (1-5 ms) que comienzan con alto nivel (es decir, 80 o 90 dB SPL) y la reducción de la intensidad de 5-10 dB SPL. Registrar la respuesta eléctrica en los primeros 10 ms después de la estimulación (ABR respuestas evocadas parecen a 6-8 ms).
NOTA: Para esta razón, las tasas de estimulaciónno debe ser mayor de 50 estímulos / s (velocidad normal 20-50).
- Presente breve clic o ráfaga de tono de estímulos (1-5 ms) que comienzan con alto nivel (es decir, 80 o 90 dB SPL) y la reducción de la intensidad de 5-10 dB SPL. Registrar la respuesta eléctrica en los primeros 10 ms después de la estimulación (ABR respuestas evocadas parecen a 6-8 ms).
- Amplificar, grabar y promediar la respuesta eléctrica evocada a cada estímulo e intensidad. Utilizar un amplificador con bajo nivel de ruido y una buena relación señal-ruido, y conectarlo a la entrada de AD.
NOTA: ABR tienen amplitudes muy bajas, típicamente por debajo de 1 mV (pico a pico) y deberán registrarse utilizando un amplificador con muy bajo nivel de ruido. En ratones con audición normal, las ondas ABR surgen claras después de un promedio de 100 - 200 respuestas, sin embargo para obtener grabaciones de alta calidad, o en el caso de la discapacidad auditiva, se recomiendan más repeticiones (750-1.000) 27. - determinar visualmente el umbral de ABR durante la prueba.
NOTA: El umbral de ABR es la más baja intensidad de los estímulos de sonido que provoca una ABR fiable de grabación con las ondas I a IV claramente visible y media tensión 2 SD-pico a pico por encima de la actividad de fondo media 31. Estos datos tienen que ser confirmadas dusonar análisis fuera de línea, junto con otros parámetros, incluyendo el pico y interpicos latencia, y la onda amplitudes. - Realizar análisis de datos, ya sea manual o automáticamente.
- Para el análisis manual, identificar las ondas 4-5 ABR (I, II, III, ... etc.) Y la marca de los picos (P1, P2, P3 ...) y los valles (N1, N2, N3 ...) para cada ciclo. Una vez que el análisis se ha completado, exportar datos a una hoja de cálculo o archivo de texto.
NOTA: El software específico para la grabación de respuesta eléctrica general lleva a cabo el análisis de forma automática. Mediciones adicionales se pueden determinar en la grabación ABR en respuesta a una intensidad fija (es decir, 70 o 80 dB SPL) o en las intensidades relativas a los umbrales clic individuales (es decir, 15 dB SPL por encima del umbral).
- Para el análisis manual, identificar las ondas 4-5 ABR (I, II, III, ... etc.) Y la marca de los picos (P1, P2, P3 ...) y los valles (N1, N2, N3 ...) para cada ciclo. Una vez que el análisis se ha completado, exportar datos a una hoja de cálculo o archivo de texto.
- Realizar el análisis estadístico de los datos ABR utilizando el software apropiado. Dependiendo del diseño experimental, el uso estándar emparejado T-test o análisis de la varianza (ANOVA) para comparar principal pará ABRtros en los diferentes grupos 26, 30.
NOTA: En los estudios longitudinales, muchos datos funcionales se recogen del mismo animal en diferentes puntos temporales (es decir, antes y después de la microcirugía). En este caso, un modelo de prueba repetida medida lineal general proporciona un análisis detallado de la varianza.
3. Preparación del vehículo
- Preparar y utilizar soluciones de vehículos en condiciones estériles.
NOTA: Las soluciones líquidas suelen desaparecer rápidamente a través de la trompa de Eustaquio. Diferentes sistemas de administración de inyectables se podrían utilizar para aumentar el tiempo de residencia del fármaco en el oído medio, incluyendo los hidrogeles y nanopartículas 32.- Para preparar CGP-hidrogel, se disuelven 75% quitosano desacetilado en ácido acético 0,2 M dando una solución de quitosano 1,5-2% (peso / peso). Añadir 9% glicerofosfato (peso / peso) a esta solución 7. Preparar la soluciónjusto antes de la administración y almacenar el hidrogel a 4 ° C hasta su uso.
NOTA: El CGP-hidrogel es moderadamente viscosa pero aún inyectable a esta temperatura. A continuación 4 ° C cambia a una fase sólida, el bloqueo de su aplicación. Después de la aplicación, CGP sufre una transición de fase a un gel semi-sólido en aproximadamente 15 min a 37 ° C. - Alícuota (0,5 ml) de tampón RL comercial y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
- Para preparar CGP-hidrogel, se disuelven 75% quitosano desacetilado en ácido acético 0,2 M dando una solución de quitosano 1,5-2% (peso / peso). Añadir 9% glicerofosfato (peso / peso) a esta solución 7. Preparar la soluciónjusto antes de la administración y almacenar el hidrogel a 4 ° C hasta su uso.
4. Los procedimientos de microcirugía
- Inducir la anestesia general con combinaciones a base de ketamina de sedantes y analgésicos (es decir, la ketamina 100 mg / Kg, medetomidina 0,05 mg / Kg y phentanile 0,025 mg / Kg) por inyección intraperitoneal, seguido de agentes inhalantes (es decir, isoflurano).
- Después de la administración de agentes inyectables, ajustar la máscara anestésica para el hocico del ratón y conecte el suministro de O2 al vapor de isoflurano. Mantener la anestesia por inhalación durante elmicrocirugía y supervisar el plano anestésico con el reflejo del dedo del pie-pellizco y patrón de respiración. Comenzar la preparación quirúrgica cuando el reflejo es totalmente abolida y el ratón presenta una respiración regular.
- Mantener la temperatura del cuerpo con almohadillas de calor durante todo el procedimiento y proteger los ojos de la queratitis corneal con un gel a base de hidroxipropilmetilcelulosa.
- Preparar un área quirúrgica limpia mediante el uso de paños estériles. Esterilizar los instrumentos de microcirugía con un esterilizador de cuentas de cristal antes de la cirugía. Mantener condiciones estériles durante todo el procedimiento quirúrgico (guantes estériles, cortinas, instrumentos quirúrgicos, etc.).
- Microcirugía
- Bullostomy
NOTA: Bullostomy es un procedimiento unilateral. Operar una oreja del ratón y utilizar el oído contralateral como control.- Coloque el ratón en una posición de decúbito supino. Preparar el área quirúrgica en la superficie ventral del cuello usando las podadoras dequitar la piel. Limpiar la piel con una solución antiséptica a base de povidona yodada, y se cubre con paños estériles.
- El uso de un bisturí, hacer una incisión longitudinal de 2 cm de la mandíbula hasta la clavícula.
- Bajo magnificación con un microscopio quirúrgico, identificar las glándulas submandibulares y separar ambos con fórceps. Retraer las glándulas submandibulares y localizar el origen del músculo digástrico y el nervio facial.
- Hacer una incisión en el origen del músculo digástrico con unas tijeras, y retractarse ventralmente, la exposición de la cara inferior-medial subyacente de la bulla timpánica.
- Hacer una abertura en la bulla mediante la perforación en ella con una aguja de 27 G (Figura 2A). Localizar la arteria estapedial y la membrana caudal RW a ella (Figura 2B). Limpiar la sangre de la zona de taladrado con una esponja de gelatina absorbible.
- El uso de un catéter G 34 y una jeringa de vidrio micro, inyectar lentamente 3-5 μL de solución de vehículo (CGP-hidrogel o RL) a través del bullostomy directamente en el nicho RW, llenándolo (Figura 2C). Sellar el bullostomy con 1-2 gotas de adhesivo tisular.
- Devolver las glándulas submandibulares a su posición inicial y cerrar las incisiones en la piel con sutura quirúrgica seda 5-0. Aplicar un antiséptico alrededor de la incisión para evitar la infección de la herida a base de clorhexidina. NOTA: Las suturas absorbibles y no absorbibles se podrían utilizar. Las suturas no absorbibles deben ser removidos en 2 semanas. Seda no se recomienda para el cierre de la piel ya que su uso está asociado con la infección de la incisión y las reacciones tisulares locales.
- transtimpánico inyección bilateral
- Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral y preparar un área quirúrgica aséptica por debajo del meato auditivo externo como se describe en 4.3.1.1.
- Hacer una incisión de 0,5 cm longitudinal en la parte vertical del conducto auditivo externo cerca del trago y sección del pliegue cutáneo interno del pabellón auricular (opcional).
- Ubicar la membrana timpánica en el extremo del canal auditivo externo utilizando un microscopio de operación (Figura 2E) e identificar la pars superiores flaccida y la pars inferiores tensa, que se divide en secciones anterior y posterior por el mango del martillo (Figura 2F) .
- Hacer un pequeño myringostomy en la porción caudal de los flaccida pars. Hacer una incisión adicional en la pars tensa de la membrana timpánica, para permitir la evacuación del aire durante la inyección 33. Inyectar suavemente 10 a 15 l de vehículo (CGP-hidrogel o RL) solución con una jeringa de vidrio micro conectado a un catéter 34 G a través de la pars flaccida, cerca del nicho RW hasta el oído medio es claramente lleno.
- Cerrar las incisiones en la piel con una sutura quirúrgica seda 5-0 y limpio como se describe en 4.3.1.7.
- Coloque el ratón sobre su otro lado y opercomió la oreja contralateral (pasos 4.3.2.1 a 4.3.2.5).
- Bullostomy
- Mantenga el ratón sobre una almohadilla caliente hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido a una cirugía para la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
- Supervisar la condición corporal, la actividad y la presencia de signos de dolor o el estrés. Proporcionar analgésicos si es necesario (es decir, buprenorfina 0,05 mg / kg, carprofeno 5-10 mg / kg). Revisar la herida quirúrgica diaria y retirar los cierres de la piel después de la operación 7-14 días después de verificar que la herida ha sanado.
5. Evaluación morfológica de Coclear arquitectura celular
- La eutanasia el ratón al final del experimento (en este trabajo 28 días postmicrosurgery), con una sobredosis de pentobarbital intraperitoneal (100 mg / kg) para estudiar los efectos a largo plazo de la cirugía.
- Realizar una perfusión transcardial de frío 0,1 M de fosfato bufferSaline (PBS), pH 7,5, seguido de 4% (v / p) de paraformaldehído (PFA) en PBS 0,1 M, pH 7,5 como se describe 26.
PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es altamente tóxico; evitar el contacto con la piel, los ojos o las membranas mucosas. Evitar respirar el polvo durante la medición y preparación. - Use un microscopio estereoscópico para diseccionar el oído interno del hueso temporal como se describe 34, 35 sin separar el vestibular y coclear componentes del oído interno.
- Fijar el oído interno aislado con 4% (p / v) PFA en 0,1 M PBS, pH 7,5 a 4 ° C durante 12 h con agitación suave. Lavar 3x durante 5 minutos con 0,1 M PBS, pH 7,5.
- Descalcificar las muestras con ácido etilendiaminotetraacético 10% (EDTA) preparado en 0,1 M PBS, pH 6,5 a 4 ° C durante 10 d, con agitación constante, el cambio de la solución de EDTA cada 3 d.
- Cuando cochleae adquirir una consistencia suave, eliminar el EDTA y lavar 3 veces durante 5 minutos con 0,1 M PBS, pH 7,5, wiTH agitación a RT.
- Incrustar las muestras en cera de parafina como se describe 34 y hacen 7 m de espesor secciones paralelas a la cocleares modiolo.
- Para evaluar la arquitectura celular coclear, secciones de tinción con hematoxilina y eosina (H & E) 30 y el uso de un microscopio de luz conectado a una cámara digital para capturar imágenes con 4X y 20X lentes.
6. Expresión Génica coclear
- Limpiar la superficie de trabajo y los instrumentos quirúrgicos con una solución de descontaminación ARNasa.
- La eutanasia el ratón como se describe en 5.1 y rápidamente diseccionar el oído interno del hueso temporal usando un microscopio. Sumergir el oído interno en un recipiente de vidrio que contiene ácido ribonucleico protector (RNA) y reactivo estabilizador.
- Retire el peñasco que queda con unas pinzas de joyero y separar suavemente la cóclea desde el vestíbulo con una tijera de los ojos de Vanna 35.
- inmediatamente transfer la cóclea en un tubo de microcentrífuga de 2 ml con 80 solución protector y estabilizador de ARN l y congelar el tejido colocando el tubo en hielo seco. Preservar muestras cocleares a -70 ° C hasta su uso.
- Aislar el ARN coclear como se describe 35 y determinar su calidad y cantidad por espectrofotometría.
- Generar cDNA coclear de cantidades iguales de RNA total de ratón utilizando un kit comercial de transcripción inversa.
- Realizar QRT-PCR para amplificar el ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) por triplicado para medir las transcripciones de genes 35, 36.
NOTA: En este pro- trabajo y las transcripciones de genes anti-inflamatorios de IL1B, IL6, TGFB1, TNFa, IL-10 y dusp1 se midieron. - Calcular los coeficientes relativos de expresión mediante la normalización de los niveles de umbral de ciclo objetivo transcripción (TC) a la media aritmética del nivel del gen de referencia y la cuantificación relativa mediante la normalización de laproblemas en grupo los niveles de transcripción a la media aritmética del grupo calibrador 37.
Representative Results
Al oír fue probado por la ABR antes y en varias ocasiones después de la microcirugía para evaluar el impacto en la función auditiva (Figura 1A). Registros de ABR se realizaron bajo anestesia para evitar el movimiento y tensión artefactos de animales y por lo tanto mejorar su reproducibilidad 27. administrado por vía intraperitoneal combinaciones a base de ketamina o inhalatoria con isoflurano se emplea usualmente para anestesiar a los animales durante las pruebas ABR. La combinación de ketamina / xilazina proporciona una inducción de acción corta (2-3 min) y una fase de mantenimiento estable, seguro en el desempeño de los registros de ABR. Cabe señalar que el isoflurano puede afectar a la sensibilidad de medición ABR 38. Para los registros de ABR, electrodos subdérmicos se colocan en lugares específicos (Figura 1B) y la impedancia eléctrica se mide. Si la impedancia es 3 kOhm o superior, el posicionamiento del electrodo tiene que ser comprobado para evitar altopera- en amplitud de la onda ABR.
La vía intratimpánica se lleva a cabo en ratones mediante dos procedimientos de microcirugía (Figura 2). La exposición de la bulla durante bullostomy implica la retracción de las glándulas submandibulares y músculo digástrico. Este procedimiento se lleva a cabo con extremo cuidado debido a que la arteria carótida y el nervio vagal están muy cerca (Figura 2A). A continuación, la bulla se perfora para localizar la arteria estapedial y la membrana RW (Figura 2B). Para evitar el agrietamiento de hueso, un pequeño 0.5 mm de abertura se hace con una aguja 27 G antes de perforar. El catéter 34 G se dirige a través de la bullostomy hacia la membrana RW y un pequeño volumen de vehículo se entrega en el nicho de la ventana (Figura 2C). La inyección transtimpánica se realiza a través de una incisión en la pars flaccida de la membrana timpánica con una aguja 27 G; uno más grande puede provocar enoído en la membrana. Antes de la inyección, se recomienda hacer una incisión adicional en la pars tensa para permitir que el flujo de salida de aire durante la inyección del vehículo (Figura 2F). Es de suma importancia para evitar el daño de la arteria estapedial, una rama de la arteria carótida interna, lo que llevaría a una hemorragia potencialmente mortal.
Los ratones con bullostomy o transtimpánicos cirugías audiencia durante todo el experimento, similar a los controles no operados (Figura 3) conservados. umbrales de ABR en respuesta a los clics y las ráfagas de tono no cambió significativamente después de la microcirugía en comparación con los valores basales. No se observaron diferencias significativas entre bullostomy y enfoques transtimpánicos. Los estudios morfológicos se llevaron a cabo para confirmar la entrega correcta del vehículo en el oído medio y para evaluar los cambios potenciales causados por los procedimientos en arquitectura celular coclear. Ninguna de las principales regiones s coclearesalteraciones morfológicas howed y animales de ambos procedimientos presentan una morfología similar de todas las estructuras cocleares (Figura 4A). Además, también se estudiaron los perfiles cocleares para la expresión de genes de citoquinas pro- y anti-inflamatorias. A pesar de la falta de diferencias funcionales en datos ABR entre los dos procedimientos, bullostomy provocó una respuesta inflamatoria más fuerte que el enfoque transtimpánico (Figura 4B).
Figura 1. Diseño experimental y Evaluación de la audición. (A) Diagrama del procedimiento experimental. Al oír se evaluó con ABR antes y después de la microcirugía. cocleares muestras se obtuvieron 28 días después de la microcirugía. (B) ratón anestesiado en posición boca abajo sobre el cojín eléctrico dentro de una cámara de atenuación del sonido, con electrod subdérmicoes colocado en el cuero cabelludo entre las orejas sobre el vértice del cráneo (activa, positiva); en la región parótida por debajo del pabellón auricular (referencia negativa) y en la parte posterior (tierra). El altavoz de campo libre se coloca a una distancia fija (5 cm) frente a la oreja derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La microcirugía para aplicaciones del vehículo. (A) Vista ventral de la bulla timpánica. El bullostomy se lleva a cabo en caudal del nervio facial con una aguja de 27 G. (B) RWN y la arteria estapedial se pueden observar a través de la perforación. (C) El catéter 34 G se dirige a través de la bullostomy hacia el nicho RW. (D) Un mes después de la bullostomy, una pequeña óseacicatriz está presente en el sitio de abertura (punta de flecha). (E) Vista lateral de la oreja, mostrando la incisión en el conducto auditivo externo y la membrana timpánica (cuadrado). (F) Detalle de la membrana timpánica. Una punción se realizó en el cuadrante superior caudal de la membrana timpánica usando una aguja de 27 G (asterisco negro, en la pars flaccida); la inyección se realiza a través de esta perforación usando un catéter de 34 G. Un orificio adicional se hizo en el cuadrante inferior craneal de la membrana (asterisco blanco, en la pars tensa) antes de la inyección para equilibrar la presión timpánica. (G) Vista del catéter 34 G a través de la punción de la membrana timpánica. (H) Vista de la región coclear 24 h después de la microcirugía. RWN llena con solución de vehículo (asterisco). Lat, lateral; Ro, rostral; Hacer, dorsal; Ma, martillo; Co, cóclea; OW, ventana oval; RWN, nicho de ventana redonda. Las barras de escala = 200 micras en A, D, F; Barras de escala = 100 micras de B, C, H; Las barras de escala = 1,000 m en E, G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Evaluación de la audición. Evolución de los umbrales de ABR (media ± SEM, en dB SPL) en respuesta al clic (A) y ráfaga de tono (B) estímulos, antes y 7, 14 y 28 días después de la microcirugía en el macho de ocho semanas de edad C57BL / 6J ratones. Bullostomy (naranja; n = 11); transtimpánico inyección (azul; n = 6); no operado (gris; n = 11), Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4. coclear Morfología y análisis de expresión génica. (A) Morfología de las principales estructuras cocleares en la base de la cóclea. tinción de hematoxilina-eosina de secciones mediados de modiolar parafina (7 m), de los oídos de los ratones no operados, y ratones un mes después de la intervención de microcirugía por bullostomy o inyección transtimpánico. El compartimiento de escala media (a, b, c) presenta todos los componentes principales. Los detalles de cada una de estas estructuras (cajas numeradas) se muestran en las imágenes siguientes: ganglio espiral (1), órgano de Corti (2), el ligamento espiral (3) y estría vascular (4). células ciliadas internas (asterisco); Las células ciliadas externas (cabeza de flecha). Barras de escala = 100 micras de a, b, c; Barras de escala = 50 micras en una 1,2,3,4. (B) la expresión de marcadores inflamatorios Coclear 28 d después de la microcirugía. Comparación entre bullostomy (naranja) y la inyección transtimpánico (azul) y con los ratones no operados (blanco). *: No operado vs.grupos operados; ^: Comparación entre los grupos operados. Los niveles de expresión génica se representan como 2 - ΔΔCt, o la diferencia de n veces en relación con group.Values no operados se presentan como media ± SEM de los triplicados de muestras de la piscina de 3 ratones por condición. La significación estadística: p ** ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ P ≤0.01; ^^^ ≤0.001 p. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Administración local de fármacos al oído interno puede realizarse directamente mediante inyección intracoclear o indirectamente por la administración intratimpánica, la colocación de la droga en el oído medio 4, 19, 39. administración intracoclear proporciona controlada y precisa la administración de fármacos a la cóclea, evitando difusión a través de las membranas de las ventanas, basal a apical gradientes de concentración y liquidación a través de la trompa de Eustaquio. Sin embargo, por lo general es un procedimiento muy invasivo que requiere de una microcirugía compleja y delicada 7, 39. En este contexto, la industria está desarrollando nuevos, con recubrimiento, dispositivos implantables para la liberación sostenida del fármaco 40, 41. Por otra parte, la administración intratimpánica es un procedimiento mínimamente invasivo y fácil de realizar que permite la inyección de volúmenes más grandes de la dque alfombra en el oído medio, aunque la farmacocinética no es fácil de controlar. La mayoría de la droga es limpiado a través de la trompa de Eustaquio y la fracción restante tiene que difundirse a través de la membrana RW para llegar a la cóclea 18. RW es el sitio de la máxima absorción de sustancias del oído medio en el conducto timpánica perilinfa lleno de la cóclea 7. Se trata de una estructura de tres capas semipermeable, aunque su permeabilidad depende de las características de la droga (tamaño, concentración, solubilidad y la carga eléctrica) y en los sistemas de transporte transmembrana (difusión, transporte activo o fagocitosis) 42. La ventana oval y cápsulas óticas son entradas alternativas pero menos eficaces a la cóclea, 43, 44.
Aquí demostramos y comparar los dos métodos de microcirugía para la administración dirigida de medicamentos en el oído medio del ratón: bullostomy y transtympalos procedimientos de inyección NIC. pasos críticos comunes a estos procedimientos incluyen: i) una evaluación de la audición antes y después de la microcirugía, ii) preparación de una solución de vehículo homogénea en condiciones estériles, iii) una cuidadosa supervisión del procedimiento y monitoreo de la temperatura corporal de los animales y las constantes de anestesia, iv ) la colocación lenta del volumen apropiado de vehículo dirigidas a la RW, y iv) la toma de muestras cocleares para completar el análisis molecular y morfológica.
Enfoques retroauricular y ventral para bullostomy se han descrito 7, 45. Se utilizó la aproximación ventral porque en nuestra experiencia que ha dado lugar a una menor morbilidad y proporcionó un mejor acceso a la RW 46. Transtimpánicos inyecciones se realizan generalmente a través de la pars tensa de la membrana timpánica, anterior o posterior al manubrio del martillo 12. Eneste trabajo se lleva a cabo una modificación de la técnica, una inyección a través de la pars flaccida más allá del martillo con una punción adicional anterior de la pars tensa para permitir la evacuación de aire durante la inyección.
La inyección transtimpánica era menos invasivo que el bullostomy, aunque ambos eran microcirugías rápida (20 y 5 min por oído para bullostomy y enfoque transtimpánico respectivamente), con tiempos de recuperación postoperatorio cortos y no morbilidad. Lo más importante, ambos procedimientos mantenidos oído y de los parámetros ABR eran idénticos a los determinados antes de la microcirugía. El enfoque transtimpánico toma menos tiempo que el bullostomy y se puede realizar en los dos oídos del mismo animal durante la misma intervención. Ventajas de la inyección transtimpánica son por lo tanto que puede ser realizado de forma bilateral y se repite, si es necesario. Por otro lado, bullostomy proporciona acceso visual directo a la membrana RW y permite que el Filling del nicho RW. En contraste, la inyección transtimpánica no permite el control de la colocación del vehículo en el nicho RW.
Los procedimientos descritos en este trabajo se describe cómo realizar una entrega de vehículo de la droga local para el oído medio para aplicaciones de pre-clínicos, tales como la evaluación de la ototoxicidad y la evaluación de la eficacia en la pérdida de audición. Dos procedimientos de microcirugía se describen métodos que proporcionan alternativas con ventajas y desventajas específicas. Tanto preservar la audición y no causan alteraciones morfológicas. La inflamación local es descrito como una complicación potencial de bullostomy. Un conjunto de técnicas complementarias también se describen procedimientos para la post-quirúrgicas, incluyendo la audición, evaluaciones de la expresión de marcadores morfológicos e inflamatorias. Las futuras aplicaciones de estas técnicas incluyen la evaluación preclínica de nuevas terapias para la pérdida, incluyendo enfoques genéticos, celulares y farmacológicos de la audición, en modelos animales. administrat intratympaniciones de garantizar la entrega del tratamiento en el oído medio, en contacto con la membrana de ventana redonda, lo que facilita el paso a la perilinfa sin daño coclear evidente.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los Genómica e instalaciones de evaluación no invasiva Neurofuncional (IIBM, CSIC-UAM) por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por becas de la española "Ministerio de Economía y Competitividad" (FEDER-SAF2014-53979-R) y la Unión Europea (FP7-AFHELO y FP7-PEOPLE-TARGEAR) para IVN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
| Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
| Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
| Water pump | Gaymar | # TP472 | |
| Surface disinfectant | José Collado SA | # CR-36 | |
| Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
| Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
| Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
| System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
| Statistics software (SPSS) | IBM | ||
| Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
| Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer |
| Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
| Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
| Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
| Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h. |
| Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
| Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
| Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
| Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
| Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
| Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
| Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
| Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
| Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
| Microlance 27 G | Becton Dickinson | # 302200 | |
| Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
| Catheter (Microfil 34 G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
| Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
| Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
| Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
| Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
| Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
| Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
| Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
| RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
| RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
| Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
| cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
| Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
| Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |
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