Abstract
o iç kulak ulaşabilir böylece orta kulağa spesifik ilaç verilmesi için kemirgenlerde iki minimal invaziv mikrocerrahi teknikler mevcut. İlk prosedür bullostomy olarak adlandırılan, timpanik bulla perforasyon oluşur; İkincisi bir transtimpanik enjeksiyon olduğunu. Her ikisi de insan klinik intratimpanik prosedürleri taklit.
Çitosan-gliserofosfat (CGP) ve Ringer's laktat tampon maddesi (RL) Yerel ilaç verilmesi için biyolojik olarak uyumlu araç olarak kullanılmıştır. CGP yaygın farmasötik uygulamalarda kullanılan, toksik olmayan bir biyolojik olarak parçalanabilir bir polimer. Bu, oda sıcaklığında viskoz bir sıvı ama vücut sıcaklığında yarı katı faza congeals. RL insanlarda intravenöz yönetimlerin için kullanılan bir izotonik bir çözümdür. bu araç bir küçük hacimli hassas bir şekilde bullostomy aracılığıyla Yuvarlak Pencere (RW) niş yerleştirilir. Bir transtimpanik enjeksiyon orta kulağı doldurur ve daha az kontrol ama iç kulağa daha geniş erişim sağlar.
transtimpanik enjeksiyon bullostomy kıyasla daha az invazif olduğunu kanıtladı rağmen iki prosedür, fare orta kulak içine ilaç verme yöntemleri olarak uygundur.
Introduction
Işitme bozukluğu (en sık insan duyu açığı ve dünya nüfusunun% 5,3 ve 65 yaş üstü bireylerin% 30'unu etkilemektedir http://www.who.int/topics/deafness/en 2016 güncelleme). İşitme kaybı çocuklarda dil edinimi etkiler ve yaşlı kişilerde bilişsel gerileme hızlandırır. Bu nedenle, büyük bir sosyo-ekonomik etkisi olan önemli bir sağlık sorunudur. Bu genetik bozukluklar, çevresel faktörler ya da sonunda salyangozu hasar ve saç hücreleri ve nöron ölümüne indüklemektedir 1 'e ait bir kombinasyonu ile kaynaklanabilir. Bu hücreler bu nedenle hücresel kaybı ve eşlik eden işitme kaybı geri alınamaz, memelilerde yeniden yoktur. Klinik seçenekler işitme cihazları ve koklear, orta kulak ve kemik iletim implantlar 2 olmak üzere protez dayanmaktadır. Ne yazık ki, hiçbir özel tıbbi restoratif trea vardırişitme için departmanlarında ve böylece çeşitli araştırma çizgileri önleyici ve onarıcı tedavilerin geliştirilmesi üzerinde duruldu. Yeni tedavi seçenekleri farmakolojik tedavi 2 gen ve hücre terapileri gibi küçük moleküllerin geliştirilmesini içerir.
koklear farmakolojik tedaviye en önemli zorluklardan biri ilaç dağıtım olduğunu. Sistemik tedavi nedeniyle kan labirent bariyer 3 kokleadaki sınırlı bir etkiye sahip, dolayısıyla iç kulağa madde geçişini sınırlayan, iç kulak sıvı homeostazı sürdürmek için fiziksel ve biyokimyasal bir bariyer gibi davranan koklear kan damarları ile temas halinde, sürekli endotelyum. geçirgenliği diüretik veya ozmotik maddelerin kullanımı ile koklear inflamasyon sırasında artmış ve yapıda olabilir ancak, sadece küçük bir yağda çözünen moleküllerine geçirgendir. Sonunda sistemik uygulama, indirgenmiş sonra koklea ulaşan ilaç miktarı;Bu nedenle, organik toksisiteye neden olabilir yüksek dozlarda gereklidir. Buna ek olarak, ilacın hepatik metabolizmasının toksik veya aktif olmayan metabolitleri 4, 5, 6, 7 üretebilir. Buna karşılık, lokal müdahaleler istenmeyen yan etkilere 4, 7, 8, 9 olmayan orta ve iç kulak içine ilacın bilinen bir sınırlı miktarda yerleştirilmesini sağlar. Mevcut klinik uygulamada, intratimpanik yönetimler gibi Meniere hastalığı 10 gentamisin gibi bazı koklear patolojiler, sınırlı, ani sağırlık içinde kortikosteroidler, Meniere hastalığı, immün aracılı, 1 13, 12, 11, ve gürültüye bağlı işitme kaybıAni sağırlık 4, 16, 17 4, 15 ve insülin-benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1).
Yerel uygulama için formülasyonlar koklear sıvıların hassas homeostazisini (pH ve osmolarite) muhafaza edilmelidir. Buna ek olarak, beyin-omurilik sıvısı bakteriyel kontaminasyonu önlemek için işlem boyunca sterilite sağlamak için çok önemlidir. ilaç verilmesi için kullanılan bir yardımcı nonototoxic, biyolojik olarak uyumlu ve uygun bir süreklilikle yapılmalıdır. Sıvı çözeltiler bağlı östaki borusu ile temizlenmesi için intrakoklear enjeksiyonlar için tavsiye edilir, ancak intratimpanik şekli için uygun değildir. Bu durumda, ilaçlar genellikle orta kulak 4, 18, 19 kalıcılığını artırmak için yarı-katı jeller tarafından taşınır. Alternatif dağıtım systeiç kulak ilaç geçişini artırmak için taşıyıcı olarak kullanılan ms nanopartiküller 20 ve Burada 21 adenovirüsler iki araç karşılaştırıldığında: CGP ve RL çözüm. CGP çitosan ile oluşturulan bir hidrojel, D-glukozamin ve kabuklu deniz elde edilen N-asetil-D-glukozamin ve β-gliserofosfat, kitosan zincirleri üzerinden su bir kalkan oluşturur ve bunu muhafaza eden bir poliol oluşan bir lineer polisakkarittir sıvı halini alır. CGP ısıya ve orta kulak 22, 23, 24, 25 sürekli bir ilaç salımı sağlayan lysozymes ile parçalanabilir. Kitosan bazlı hidrojellerin bağlı immunojenisite ve lokal iltihabik reaksiyonlara, 23, 24 aktivasyonu eksikliği bunların olmaması gibi ilaç verme gibi klinik uygulamalar için uygun araçlardır. oth üzerindeer El, RL tamponu, özellikle kan kaybı, travmalarda, su ve elektrolit bir kaynağı olarak insanlarda damar içine uygulama için amaçlanan bir pirojenik olmayan izotonik çözeltisi (273 mOsm / L, pH 6.5) ya da laktat metabolizmasının yan nedeniyle yanık karaciğerde asidozu karşı.
Burada tarif ve fare iç kulağa yerel uyuşturucu teslimat için rafine edilmiş iki cerrahi yöntemleri karşılaştırır. Her iki teknik güvenlilik profili, fonksiyonel morfolojik ve moleküler testleri kullanılarak değerlendirildi. İşitme İşitsel Beyin Sapı Yanıtı (ABR) 26, 27 öncesi ve farklı zamanlarda mikrocerrahi sonra gerçekleştirilen kullanılarak değerlendirildi. Uç nokta prosedürleri bu iki Mikrocerrahi prosedürleri, anatomik hücresel ve moleküler etkiye koklea incelemek ve karşılaştırmak için kullanıldı.
Protocol
hayvan taşıma prosedürleri uluslararası ve ulusal mevzuata uygun olduğundan emin olun. protokol sırasıyla, Avrupa Topluluğu 2010/63 / AB ve İspanyolca RD 53/2013 kuralları takip eder.
1. Genel Hayvan Taşıma
- Yem fareler ad libitum standart diyet ve içme suyu ile. Kontrol sağlığı ve Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri (FELASA) önerileri Federasyonu takip ederek refahı.
2. İşitme Değerlendirme
NOT: ABR 9 gibi non-invazif işlemler ile (bu işin 2, 7, 14 ve 28 g postmicrosurgery olarak) ameliyat öncesi test duruşma tarafından mikrocerrahi usul ve birçok kez Track fonksiyonel etkisi.
- ABR testi için, (periton ketamin enjeksiyonu (100 mg / kg vücut ağırlığı (BW) ve ksilazin yani 10 kısa süreli etkisi protokolleri ile fareler uyutmakmg / kg BW). Alternatif olarak, uçucu anestezi altında işitme testi gerçekleştirin.
NOT: ABR parametreleri anestezik protokolü 28 etkilemiş olabilir beri, deney boyunca aynı birini kullanın. - ayak-tutam refleks testi ile anestezi derinliğini kontrol edin.
NOT: geri çekilme refleksi kaybolduğunda, hayvan işitsel testler yapmak için anestezi uygun bir derinliğe ulaştı. - Hidroksipropil metilselüloz bazlı jeller olarak gözyaşı takviyeleri, topikal uygulama ile kurutulması ve ikincil kuru keratokonjonktivit gözleri korumak.
- Bütün işlem boyunca fizyolojik sıcaklıkta (37,5-38 ° C) fare tutun. Elektrik girişimi önlemek için, sıcak su pompası ve ısıtma pedleri kullanmayın. rektal prob ile vücut sıcaklığını izleyin. Her zaman hayvan yanmamasına özen gösterin.
NOT: fareler arasında bir yüzey dezenfektanı ile ısıtma yastığı temizlemenizi öneririz.0; anestezi indüksiyon ve derlenme, elektrikli ısıtma pedleri, akkor ya da kızılötesi ışıkları için kullanılabilir. - ABR prosedürü
NOT: ABR Kayıt için, dalga formlarını oluşturmak için bir iç ses kartı ile bir bilgisayar iş istasyonu kullanımı (analog Dijital DA çıkış, dönüşüm) ve elektrik tepki dalga formlarını dijital ortama aktarmak için, bir zayıflatıcı, bir osiloskop ve bir (dijital, AD girişine analog) düşük empedanslı amplifikatör. Modern işitsel iş istasyonları (yani Tucker Davis Teknolojiler) tek bir kompakt sistemindeki tüm bu bileşenleri içerir.- Ortam gürültüsü girişim ve yankılanma (Şekil 1) önlemek için bir ses azaltıcı odasının içinde ısıtma pedleri yüzükoyun pozisyonda anestezi fare yerleştirin.
- Dış kulak içine akustik uyaranlara sunun. Önceden ayarlanmış uyaranlara veya uygun yazılım ile tasarlanmış yeni sinyaller kullanın. Seçilen hoparlörün DA iş istasyonu çıkışını bağlayın.
NOT: Fredış kulak takılı E alanı ya da kapalı-alan hoparlör kullanılabilir. Çünkü kapalı sistemlerde prob yerleştirilmesi ve ses kalibrasyon zorluk fareler ile çalışırken eski tercih edilir. Serbest alan hoparlörleri iki kulağı teşvik etmek ve bir çift taraflı yanıtı ortaya. Serbest alan hoparlörler ile ağırlıklı olarak mono yanıtları elde etmek için, kontralateral aktivitesi (kulak fişleri ile yani) ya da gürültü maskeleyerek tıkanması ile ortadan kaldırılması vardır.- dış kulak yolu ile aynı hizada hoparlör merkezi ile baş veya seçilen kulak bakan sabit bir mesafeye (genellikle 5-20 cm) serbest alan hoparlör yerleştirin. herhangi bir engel hoparlör ve kulak arasındaki ve kepçesi tamamen açık olduğunu olduğundan emin olun.
- aşağıdaki gibi paslanmaz çelik subdermal iğne elektrotlar yerleştirin: i) kafatasının tepe üzerinde kulakları arasındaki kafa derisi aktif (pozitif) elektrot (), ii) referans (negatif) elektrot, parotiskepçesi altında bölge ve iii) geri, kuyruk veya arka bacak bölgesinde toprak elektrot (Şekil 1).
- Pozitif ve negatif elektrotlar elektriksel empedans kontrol edin. empedans az 3 kOhm (ideal 1 kOhm) olduğundan emin olun. daha yüksek ise, alkolle temiz, yeniden konumlandırmak ya da elektrotlar değiştirin.
- ABR kayıt için, 5-10 dB SPL 27, 29, 30 adımları ses basınç seviyesi (SPL) 90 ila 10 dB akrabadan yoğunlukları azaltmaya genişbant tıklamaları ve saf ses frekansları ve mevcut üretir.
- Mevcut kısa tıklama veya ton uyaranlara (1-5 ms) yüksek düzeyde (yani 80 ya da 90 dB SPL) ile başlayan ve 5-10 dB SPL adımlarla yoğunluğunu azaltarak patladı. uyarıldıktan sonra ilk 10 ms elektrik tepki Kayıt Ol (ABR yanıtları 6-8 ms görünür uyarılmış).
NOT: Bu nedenle, stimülasyon oranları50'den daha yüksek uyaranlar olmamalıdır / s (normal oran 20-50).
- Mevcut kısa tıklama veya ton uyaranlara (1-5 ms) yüksek düzeyde (yani 80 ya da 90 dB SPL) ile başlayan ve 5-10 dB SPL adımlarla yoğunluğunu azaltarak patladı. uyarıldıktan sonra ilk 10 ms elektrik tepki Kayıt Ol (ABR yanıtları 6-8 ms görünür uyarılmış).
- Yükseltmek, kayıt ve her uyarıcı ve yoğunluğu uyarılmış elektrik yanıtı ortalama. Düşük gürültü ve iyi bir sinyal-gürültü oranına sahip bir amplifikatör kullanın ve AD girişine bağlayın.
NOT: ABRS, tipik altında 1 mV (peak-tepe) çok düşük genlikleri var ve çok düşük gürültü ile bir amplifikatör kullanarak kaydedilmiş olması gerekir. Ancak yüksek kalite kayıtları elde etmek için, 200 yanıtları, ya da işitme durumunda, daha fazla tekrarlar (750-1,000) 27 tavsiye edilir - Normal işitme farelerde, açık ABR dalgalar 100 ortalama sonra ortaya çıkar. - Görme test sırasında ABR eşik belirler.
NOT: ABR eşik Ben IV açıkça görülebilir ve orta tepe-tepe gerilimi 2 SD ortalama zemin aktivitesi 31 üzerinde dalgalar ile kayıt güvenilir ABR ortaya çıkarır düşük ses uyaranlara yoğunluğudur. Bu veriler du teyit edilecek olantepe ve interpik gecikme dahil olmak üzere diğer parametreler ile birlikte, off-line analiz halka ve genlikleri dalga. - manuel ya da otomatik veri analizi yapın.
- Manuel analiz için (I, II, III ... vb.) Ve dorukları (P1, P2, P3 ...) ve vadiler dışarı işaretlemek 4-5 ABR dalgaları tespit (N1, N2, N3 ...) her dalga için. Analiz elektronik tablo veya metin dosyası, ihracat verileri tamamlandığında.
NOT: elektriksel tepki kayıt için özel yazılım genellikle otomatik analizini gerçekleştirir. Ek ölçümler sabit bir yoğunlukta (yani 70 ya da 80 dB SPL) ya da tek tek tıklama eşik (eşiğin, yani 15 dB SPL) göre yoğunluklarda yanıt olarak ABR kayıt belirlenebilir.
- Manuel analiz için (I, II, III ... vb.) Ve dorukları (P1, P2, P3 ...) ve vadiler dışarı işaretlemek 4-5 ABR dalgaları tespit (N1, N2, N3 ...) her dalga için. Analiz elektronik tablo veya metin dosyası, ihracat verileri tamamlandığında.
- Uygun yazılım kullanarak ABR Verilerin istatistiksel analizi yapın. Deneysel tasarım bağlı olarak, kullanım standart ana ABR parametrede karşılaştırmak için T-testi veya varyans (ANOVA) analizi eşleştirilmişFarklı gruplar 26, 30 içinde ters.
NOT: uzunlamasına çalışmalarda, birçok fonksiyonel veri (yani öncesi ve mikrocerrahi sonra) farklı zamansal noktalarda aynı hayvan tahsil edilir. Bu durumda, genel lineer model tekrarlayan tedbir testi ayrıntılı varyans analizi sağlar.
3. Araç Hazırlık
- Hazırlama ve steril koşullar altında araç çözümleri kullanın.
NOT: Sıvı çözümler genellikle östaki borusu yoluyla hızlı bir şekilde temizlenir. Farklı enjekte edilebilir uygulama sistemleri hidrojeller ve nanopartiküllerin 32 de dahil olmak üzere, orta kulak, ilacın kalma zamanını arttırmak için kullanılabilir.- , CGP-hidrojel hazırlanması a% 1.5-2 (ağırlık / ağırlık) sitozan solüsyonu elde edildi 0.2 M asetik asit içinde% 75 deasetile kitosan eritin. Bu çözeltiye 7-9% gliserofosfat (ağırlık / ağırlık) ekleyin. çözeltisi hazırlayınverilmesinden hemen önce, ve kullanılana kadar 4 ° C 'de hidrojel saklayın.
NOT: CGP-hidrojel bu sıcaklıkta orta viskoz ama hala enjektabl olduğunu. 4 ° C altında bu uygulanmasını bloke bir katı faza dönüşür. Uygulamadan sonra, CGP 37 ° C'de yaklaşık 15 dakika içinde, bir yarı-katı jel bir faz geçişi maruz kalır. - kullanılana kadar 4 ° C'de kısım (0.5 mL), ticari RL tamponu saklayın.
- , CGP-hidrojel hazırlanması a% 1.5-2 (ağırlık / ağırlık) sitozan solüsyonu elde edildi 0.2 M asetik asit içinde% 75 deasetile kitosan eritin. Bu çözeltiye 7-9% gliserofosfat (ağırlık / ağırlık) ekleyin. çözeltisi hazırlayınverilmesinden hemen önce, ve kullanılana kadar 4 ° C 'de hidrojel saklayın.
4. Mikrocerrahi Prosedürleri
- Uçucu madde ajanlar (örneğin, izofluran) ardından, sedatif ve analjezik ketamin göre kombinasyonlar (yani ketamin 100 mg / kg, medetomidin 0.05 mg / kg ve 0.025 mg / Kg phentanile) intraperitonal enjeksiyon yolu ile, genel anestezi neden.
- Enjekte maddelerin uygulanması sonra, fare burun anestezik facemask ayarlamak ve izofluran buharı O 2 kaynağı bağlayacak. sırasında inhalasyon anestezi korumakmikrocerrahi ve ayak tutam refleks ve solunum paterni ile anestezi uçağı izlemek. refleks tamamen mülga ve fare normal nefes sunduğunda cerrahi hazırlık başlar.
- Bütün işlem boyunca ısıtma yastıkları ile vücut ısısını korumak ve hidroksipropil metilselüloz bazlı jel ile kornea keratit gözleri korumak.
- Steril örtüler kullanarak temiz cerrahi zemin hazırlayın. cerrahi öncesi cam boncuk sterilizatör ile mikrocerrahi aletleri sterilize. Bütün cerrahi işlem sırasında steril koşullar (steril eldiven, örtüler, cerrahi aletler, vb) koruyun.
- Mikrocerrahi
- Bullostomy
Not: Bullostomy tek taraflı bir işlemdir. Fare bir kulağını işletmek ve kontrol olarak kontralateral kulak kullanın.- Bir dekübit yatar pozisyonda fare yerleştirin. için makası kullanarak boyun ventral yüzeyinde cerrahi alan hazırlayınkürk çıkarın. povidon iyot bazlı antiseptik solüsyon ile cilt temizlenir ve steril örtüler ile örtün.
- Bir neşter kullanılarak, köprücük kemiğinin için çeneden alınan 2 cm boyuna kesi yapmak.
- cerrahi mikroskop ile büyütme altında, submandibuler bezleri belirlemek ve forseps ile hem ayırın. submandibuler bezleri geri çekin ve digastricus'un kökeni ve yüz siniri lokalize.
- Timpanik bulla yatan alt-medial açığa bir makas ile digastricus'un kökenli bir kesi yapmak ve ventral onu geri çekin.
- 27 G iğne (Şekil 2A) ile içine delerek bül bir açıklık olun. Stapes arter ve RW membran kaudal ona (Şekil 2B) yerelleştirilmesine. emilebilir jelatin sünger ile delinmiş alanda kan temizleyin.
- 34 G kateter ve cam mikro şırınga kullanarak, yavaş yavaş 3-5 μ enjekteRW niş doğrudan bullostomy taşıtın çözeltisi (CGP hidrojel ya da R), L (şekil 2C) doldurulması suretiyle hazırlanabilir. doku yapıştırıcısı 1-2 damla ile bullostomy mühür.
- başlangıç pozisyonuna submandibuler bezleri dönün ve 5-0 ipek cerrahi dikiş ile cilt kesiler kapatın. Bir klorheksidin tabanlı önlemek için kesi çevresinde antiseptik yara enfeksiyonu uygulayın. Not: emilebilir ve emilemeyen dikiş kullanılabilir. Emilmeyen dikişlerle 2 hafta içinde uzaklaştırılmalıdır. kullanımı kesi enfeksiyonu ve lokal doku reaksiyonları ile ilişkili olduğundan ipek cilt kapatılması için tavsiye edilmez.
- İkili transtimpanik enjeksiyon
- Lateral dekübit pozisyonunda fare yerleştirin ve 4.3.1.1 de açıklandığı gibi dış kulak yolu altında aseptik cerrahi alanı hazırlamak.
- tragus ve s yakın dış kulak kanalının dikey kısmında 0.5 cm boyuna kesi yapmak(Isteğe bağlı) kulak kepçesi iç deri kat ection.
- Cerrahi mikroskop (Şekil 2E) kullanarak dış kulak kanalının sonunda kulak zarı bulun ve malleusun koldan anterior ve posterior bölümlere ayrılmıştır üst pars flaccida ve alt pars tensa tespit (Şekil 2F) .
- Pars flaccida kuyruk kısmında küçük bir myringostomy yapın. Enjeksiyon 33 sırasında hava tahliyesi sağlamak için, kulak zarının pars tensa ek kesi yapmak. Yavaşça aracın 10-15 uL (CGP hidrojel ya da R) orta kulak açık dolana kadar RW niş yakın pars flaccida ile 34 G kateter bağlı bir cam mikro şırınga ile çözelti enjekte edilir.
- 4.3.1.7 açıklandığı gibi 5-0 ipek cerrahi sütür ile cilt kesiler kapatın ve temiz.
- onun diğer tarafında ve oper üzerinde fare yerleştirinkontralateral kulak yedik (4.3.2.5 4.3.2.1-için adım).
- Bullostomy
- sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar bir ısıtma pedi üzerinde fare tutun. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan iade etmeyin.
- vücut durumu, aktivite ve ağrı ya da stres belirtileri varlığını izleyin. Gerekirse analjezikler sağlanması (yani, Buprenorfin 0.05 mg / kg, karprofen 5-10 mg / kg). günlük cerrahi yara gözden geçirin ve postoperatif yara iyileştikten olduğunu doğruladıktan sonra cilt kapanışları 7-14 gün kaldırın.
Koklear hücre mimarisini 5. Morfolojik Değerlendirilmesi
- Ameliyat uzun süreli etkilerini incelemek için intraperitoneal pentobarbital aşırı dozda (100 mg / kg) ile, (bu iş 28 gün postmicrosurgery olarak) deney sonunda fare öldürülür.
- Soğuk 0.1 M fosfat tamponlu bir transcardial perfüzyon gerçekleştirme0.1 M PBS içinde% 4 (ağırlık / hacim) paraformaldehid (PFA), ardından tuzlu su (PBS), pH 7.5, pH 7.5 26 tarif edildiği gibi.
DİKKAT: Paraformaldehyde çok zehirlidir; cilt, göz veya mukoza ile temasından kaçının. ölçme ve hazırlanması sırasında toz solumaktan kaçının. - Vestibüler ve iç kulak koklear bileşenlerini ayırmadan 34, 35 anlatıldığı gibi temporal kemik iç kulak dışarı incelemek için Stereomikroskopta kullanın.
- hafifçe çalkalanarak 12 saat boyunca 4 ° C'de 0.1 M PBS, pH 7.5 içinde% 4 (ağırlık / hacim) PFA izole iç kulak düzeltildi. 0.1 M PBS, pH 7.5 ile 5 dakika boyunca yıkama 3x.
- EDTA solüsyonu her 3 değiştirme D, sabit şekilde çalkalanarak 10 d, 4 ° C 'de 0.1 M PBS, pH 6.5 içinde hazırlanır,% 10, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile örnekleri kirecini.
- cochleae yumuşak kıvam elde zaman, EDTA çıkarın ve 0.1 M PBS, pH 7.5, wi ile 5 dakika süresince 3X yıkamaOda sıcaklığında çalkalanarak Th.
- Açıklanan 34 olarak parafin örnekleri embed ve 7 mikron kalınlığında koklear kesitler modiolus paralel olun.
- Koklear hücre mimarisini, hematoksilen ve eozin (H & E) 30 ile leke bölümleri değerlendirmek ve 4X ve 20X lensler ile görüntü yakalamak için bir dijital fotoğraf makinesine bağlı bir ışık mikroskobu kullanın.
6. Koklear Gen İfadesi
- RNAz dekontaminasyon solüsyonu ile çalışma yüzeyi ve cerrahi aletler temizleyin.
- Bir mikroskop kullanılarak temporal kemik, iç kulak teşrih hızla 5.1 anlatıldığı gibi fare Euthanize. Ribonükleik asit (RNA) koruyucu ve sabitleyici bir reaktif ihtiva eden bir cam tabak içinde iç kulak bırakın.
- Kuyumcu forseps ile kalan Petröz kemiği kaldırmak ve yavaşça Vanna göz makas 35 kullanılarak vestibülden koklea ayırın.
- hemen transfer 80 uL RNA koruyucusu ve stabilizatör çözeltisi ile 2 mL mikrosantrifüj tüpe koklea ve kuru buz tüpü yerleştirerek doku dondurma. kullanılana kadar -70 ° C 'de koklear örnekleri korur.
- 35 açıklandığı gibi koklear RNA izole ve spektrofotometrik kalitesini ve miktarını belirlemek.
- Bir ters transkripsiyon ticari kit kullanılarak toplam fare RNA eşit miktarda gelen koklear cDNA oluşturun.
- Gen transkript 35, 36 ölçmek için üç kopya halinde tamamlayıcı deoksiribonükleik asit (cDNA) amplifiye etmek için qRT-PCR gerçekleştirin.
NOT: Bu çalışma yanlısı ve IL1b, IL6, TGFb1, TNFa, IL10 ve DUSP1 anti-enflamatuar gen transkript ölçüldü. - Referans gen düzeyinde aritmetik ortalama ve normalize ederek göreceli ölçümü hedef transkript döngüsü eşiği (Ct) düzeyleri normale göre göreceli ifade oranları hesaplamakSorun grubu kalibratör grubunun 37 aritmetik ortalamaya transkript seviyeleri.
Representative Results
İşitme işitsel fonksiyon (Şekil 1A) üzerindeki etkisini değerlendirmek için mikrocerrahi sonra önce ABR tarafından ve birkaç kez test edildi. ABR kaydolur hayvan hareketi ve gerilim eserler önlemek ve bu nedenle tekrarlanabilirlik 27 artırmak için anestezi altında gerçekleştirildi. Intraperitoneal ketamin tabanlı kombinasyonları uygulanabilir veya inhalasyon izofluran genellikle ABR testleri sırasında hayvanların uyutmak için kullanılmıştır. ABR kayıtları yaparken ketamin / ksilazin kombinasyonu kısa etkili (2-3 dk) uyarma ve istikrarlı, güvenli bakım aşamasını sağlar. Izofluran ABR ölçme hassasiyetini 38 etkileyebilir unutulmamalıdır. ABR kayıtları için, deri altı elektrotlar belirli yerler (Şekil 1B) içine yerleştirilir ve elektriksel direnç ölçülür. empedans 3 kOhm veya daha yüksek ise, elektrot yerleştirme alt önlemek için kontrol edilmelidirABR dalga genlik denle.
İntratimpanik dağıtım iki mikro işlemler (Şekil 2) farelerde gerçekleştirilir. Bullostomy sırasında bül pozlama submandibuler bezleri ve digastricus'un geri çekilmesini gerektirir. Karotis arter ve vagus sinir çok yakın (Şekil 2A) çünkü bu işlem çok dikkatli yürütülür. Sonraki, bül stapes arter ve RW membran (Şekil 2B) lokalize delinir. kemik çatlamasını önlemek için, küçük bir 0.5 mm'lik bir açıklık delme önce 27 G iğne ile yapılır. 34 G kateter RW membran ve aracın küçük bir hacme doğru bullostomy boyunca yönlendirilir penceresi hücresi (Şekil 2C) üzerine verilir. Transtimpanik enjeksiyon pars bir kesi ile gerçekleştirilir 27 G iğne ile kulak zarı flaccida; de sebep olabilir büyük bir tekzar kulak. Enjeksiyon öncesinde, biz aracın (Şekil 2F) enjeksiyon sırasında havanın akışına izin vermek için pars tensa ek bir kesi yaparak öneririz. Yaşamı tehdit eden kanamaya yol açacak stapes arter, internal karotis arter dalı, bir hasarı önlemek için kritik öneme sahiptir.
Olmayan çalışan denetimleri (Şekil 3) benzer deney boyunca işitme korunmuş bullostomy veya transtimpanik ameliyatları ile fareler. tıklama ve ton patlamaları tepki ABR eşikleri bazal değerlere göre mikrocerrahi sonra önemli bir değişiklik olmadı. Anlamlı bir fark bullostomy ve transtimpanik yaklaşımlar arasında gözlenmiştir. Morfolojik çalışmalar orta kulak içine doğru araç teslim onaylamak ve koklear hücre mimarisini de işlemleri nedeniyle potansiyel değişiklikleri değerlendirmek için yapılmıştır. Ana koklear bölgeler s hiçbiriHer iki prosedürlerden howed morfolojik değişiklikler ve hayvanların tüm Kohleanın (Şekil 4A) benzer bir morfoloji sundu. Buna ek olarak, pro- ve anti-enflamatuar sitokinlerin gen ekspresyonu için koklear profilleri de incelenmiştir. Iki prosedür arasında ABR veri fonksiyonel farklılıklar olmamasına rağmen, bullostomy transtimpanik yaklaşımı (Şekil 4B) daha güçlü bir enflamatuvar yanıtı neden oldu.
Şekil 1. Deney Tasarımı ve İşitme Değerlendirme. Deneysel prosedür (A) Diyagram. İşitme önce ve mikrocerrahi sonrası ABR ile değerlendirildi. Koklear numuneler 28 gün mikrocerrahi sonra elde edildi. (B) deri altı elektrotlu bir ses zayıflatıcı bölmesi içindeki ısıtma pedi üzerinde yüzükoyun pozisyonda anestezi fare,Kafatasının (aktif, pozitif) ve tepe üzerinde kulağı arasında kafa derisi yerleştirilen es; kulak kepçesi (referans, negatif) altında parotis bölgesinde ve arka (toprak) olarak. serbest alan hoparlör sağ kulak bakan sabit bir mesafeye (5 cm) yerleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Araç Uygulaması için Şekil 2. Mikrocerrahi. (A) timpanik bulla alttan görünüşü. bullostomy 27 G iğne ile fasiyal sinirin için kaudal yapılır. (B) RWN ve stapedial arter perforasyonu vasıtasıyla gözlenebilir. (C), 34 g kateter RW niş doğru bullostomy boyunca yönlendirilir. (D) bullostomy bir ay sonra, küçük bir kemikskar açılış sitesinden (ok başı) mevcuttur. Dış kulak kanalına kesi ve kulak zarı (kare) gösteren (E) kulak Yanal görünümü. Kulak zarının (F) Detay. Bir ponksiyon (pars flaccida içinde, siyah yıldız) 27 G iğne kullanılarak kulak zarı kaudal üst kadranda yapıldı; Enjeksiyon 34 G kateter kullanılarak bu perforasyon ile yapıldı. Ek bir delik kulak basıncını dengelemek için enjeksiyondan önce (pars tensa olarak, beyaz yıldız) zar kranial alt kadranda yapıldı. Kulak zarı delik yoluyla 34 g kateterin (G) bakın. Mikrocerrahi sonrası koklear bölge 24 saat (H) Resmi. RWN araç solüsyonu (yıldız) ile doldurulmuş. Yanal, Lat; Ro, rostral; , Dorsal yapmak; Ma, malleus; Co, koklea; OW, Oval pencere; RWN, yuvarlak pencere niş. Ölçek çubukları = A, D, F, 200 um; Ölçek çubukları = 100 B, C, H um; Ölçek çubukları = E 1.000 mikron G. bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
3. İşitme Değerlendirme rakam. ABR eşikleri (dB SPL ± SEM, ortalama) yanıt olarak Evrimi tıklayın (A) ve sesi patlaması (B) uyaranlara, erkek sekiz haftalık C57BL / 6J mikro-cerrahi sonrası 14 ve 28 gün önce ve 7 fareler. Bullostomy (turuncu; n = 11); transtimpanik enjeksiyonu (mavi; n = 6); olmayan çalışan (gri; n = 11), bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
jpg "/>
Şekil 4. Koklear Morfoloji ve Gen İfadesi Analizi. Koklea dibinde ana Kohleanın (A) Morfoloji. Bir ay bullostomy ya transtimpanik enjeksiyon ile mikro müdahalesinden sonra orta modiolar parafın olmayan ameliyat farelerin kulak bölümlerine (7 um), ve farelerde Haematoxilin-eozin boyaması. Skala ortam bölmesi (a, b, c) tüm ana bileşenleri sunulur. Bu yapılar (numaralı kutular) her birinin bilgileri daha sonraki resimlerde gösterilmiştir: spiral ganglion (1), çorti organı (2), spiral ligaman (3) ve stria vaskularis (4). İç saç hücresi (yıldız); Dış saç hücreleri (ok başı). Ölçek çubukları = a, b, c, 100 um; Ölçek çubuklar-1,2,3,4 50 mikron =. (B) 28 gün mikrocerrahi sonrası inflamatuar belirteçlerin Koklear ifadesi. bullostomy (turuncu) ve transtimpanik enjeksiyon (mavi) arasında olan ve olmayan çalışan farelerin (beyaz) karşılaştırılması. *: Non-çalışan vsameliyat grupları; ^: Ameliyat gruplar arasında karşılaştırılması. ΔΔCt, ya da olmayan ameliyat group.Values n-kat fark göreceli durum başına 3 fare Havuzu örneklerinden Üçlü parçaların ortalama ± SEM olarak sunulmuştur - gen ekspresyonu seviyesi 2 olarak temsil edilir. İstatistiksel anlamlılık: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ S ≤0.01; ^^^ S ≤0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Iç kulağa lokal ilaç dağıtım orta kulak 4, 19, 39, ilacın yerleştirerek intratimpanik uygulama ile doğrudan intrakoklear enjeksiyonla ya da dolaylı olarak yapılabilir. Intrakoklear yönetim bazal-apikal konsantrasyon eğimleri ve boşluk östaki borusu yoluyla, pencere zarları aracılığıyla yayılmasını önlemek, kontrol ve cochlea'ya hassas ilaç dağıtım sağlar. Ancak, karmaşık ve hassas mikrocerrahi 7, 39 gerektiren son derece invaziv bir işlemdir genellikle. Bu bağlamda, endüstri sürekli ilaç salımı, 40, 41 için yeni, kaplamalı, implante edilebilir cihazlar geliştirmektedir. Diğer taraftan, İntratimpanik Yönetim d daha büyük hacimli enjeksiyon sağlayan bir minimal invaziv ve uygulaması kolay bir işlemdirfarmakokinetiği kontrol etmek kolay değildir, ancak, orta kulak içine halı. Ilacın çoğunun östaki borusu yoluyla temizlenir ve geri kalan kısmı koklea 18 ulaşmak için RW zar içinden difüze olması gerekmektedir. RW koklea 7 perilenf dolu timpanik kanal içine orta kulak maddelerin maksimum absorpsiyon sitedir. Geçirgenlik madde özellikleri (boyut, konsantrasyon, çözünürlük ve elektriksel yük) ve zar-ötesi taşıma sistemleri (difüzyon, aktif taşıma ve fagositoz) 42 bağlıdır, ancak bu, bir yarı-geçirgen, üç tabakalı bir yapıdır. Oval pencere ve otik kapsül koklea 43, 44 alternatif ama daha az etkili girişi vardır.
Burada göstermek ve hedefli ilaç fare orta kulak içine teslimat için iki mikrocerrahi yöntemleri karşılaştırmak: bullostomy ve transtympaNIC enjeksiyon işlemleri. Bu işlemlerin Ortak kritik adımlar şunlardır: i) işitme bir değerlendirme öncesinde ve mikrocerrahi sonrası, ii) steril koşullarda homojen bir araç çözeltisinin hazırlanması, iii) anestezik prosedür ve hayvan vücut sıcaklığı ve sabitler izlenmesi dikkatli denetim, iv moleküler ve morfolojik analiz tamamlamak için koklear numune almak) yavaş RW hedefleyen aracın uygun hacimde yerleştirme, ve iv).
Bullostomy için retroauriküler ve ventral yaklaşımlar, 45 7 tarif edilmiştir. Bizim deneyim daha az morbidite sonuçlandı ve RW 46 daha iyi erişim sağlanan çünkü ventral yaklaşım kullanılır. Transtimpanik enjeksiyonlar genellikle pars kulak zarı tensa üzerinden yürütülmektedir, malleus manubrium 12 anterior veya posterior. İçindeBu çalışma da enjeksiyon sırasında hava tahliyesi sağlamak için pars Tensa önceki bir ek delik ile malleusun ötesinde pars flaccida üzerinden teknik, bir enjeksiyon bir modifikasyonunu yapıldı.
Her iki microsurgeries hızlı (bullostomy ve sırasıyla transtimpanik yaklaşım kulağa başına 20 ve 5 dk) olmasına rağmen transtimpanik enjeksiyon kısa postoperatif iyileşme süreleri ve hiçbir morbidite ile, bullostomy daha az invaziv oldu. En önemlisi, her iki işlemler işitme sürdürdü ve ABR parametreleri mikrocerrahi önce tespit edilenlerle aynıydı. transtimpanik yaklaşım bullostomy daha az zaman alır ve aynı müdahale sırasında aynı hayvanın her iki kulakta gerçekleştirilebilir. transtimpanik enjeksiyon avantajları eğer istenirse, iki taraflı yapılmış ve tekrar edilebilir, böylece bulunmaktadır. Öte yandan, bullostomy RW membrana doğrudan görsel erişimi ve Filli sağlarRW niş ng. Bunun aksine, transtimpanik enjeksiyonu RW niş araç yerleştirme kontrolü için izin vermez.
Bu çalışmada bildirilen prosedürler gibi işitme kaybı ototoksisite ve etkinlik değerlendirilmesi değerlendirilmesi olarak klinik öncesi uygulamalar için orta kulağa yerel bir uyuşturucu araç teslimatı gerçekleştirmek açıklanmıştır. İki mikrocerrahi prosedürleri belirli avantajları ve dezavantajları ile alternatif yöntemler sağlamak tarif edilmiştir. Hem işitme korumak ve morfolojik değişikliklere neden olmaz. Yerel enflamasyon bullostomy potansiyel bir komplikasyonu olarak tarif edilmektedir. tamamlayıcı teknikler seti de işitme, morfolojik ve inflamatuar belirteç ifade değerlendirmeler de dahil olmak üzere ameliyat sonrası prosedürler için tarif edilmiştir. Bu tekniklerin Gelecek uygulamalar hayvan modellerinde, genetik hücresel ve farmakolojik yaklaşımlar da dahil olmak üzere kaybı, işitme yeni tedavilerin klinik öncesi değerlendirilmesini içermektedir. intratimpanik administratiyonları belirgin koklear zarar vermeden perilenf içine geçişini kolaylaştırmak, yuvarlak pencere membranı ile temas halinde, orta kulakta tedavi teslim edilmesini sağlamak.
Acknowledgments
Yazarlar, teknik destek için Genomik ve invaziv olmayan nörofonksiyonel Değerlendirme tesisleri (IIBM, CSIC-UAM) teşekkür etmek istiyorum. Bu eser İspanyol "Ministerio de Economia y Competitividad" (FEDER-SAF2014-53979-R) ve Avrupa Birliği (FP7-AFHELO ve FP7-PEOPLE-TARGEAR) IVN kadar hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
| Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
| Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
| Water pump | Gaymar | # TP472 | |
| Surface disinfectant | José Collado SA | # CR-36 | |
| Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
| Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
| Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
| System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
| Statistics software (SPSS) | IBM | ||
| Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
| Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer |
| Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
| Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
| Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
| Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h. |
| Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
| Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
| Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
| Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
| Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
| Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
| Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
| Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
| Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
| Microlance 27 G | Becton Dickinson | # 302200 | |
| Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
| Catheter (Microfil 34 G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
| Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
| Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
| Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
| Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
| Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
| Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
| Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
| RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
| RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
| Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
| cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
| Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
| Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |
References
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing impairment: a panoply of genes and functions. Neuron. 68 (2), 293-308 (2010).
- Muller, U., Barr-Gillespie, P. G. New treatment options for hearing loss. Nat Rev Drug Discov. 14 (5), 346-365 (2015).
- Okano, T. Immune system of the inner ear as a novel therapeutic target for sensorineural hearing loss. Front Pharmacol. 5, 205 (2014).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- Horie, R. T., et al. Stealth-nanoparticle strategy for enhancing the efficacy of steroids in mice with noise-induced hearing loss. Nanomedicine (Lond). 5 (9), 1331-1340 (2010).
- Kanzaki, S., et al. Novel in vivo imaging analysis of an inner ear drug delivery system: Drug availability in inner ear following different dose of systemic drug injections. Hear Res. 330 (Pt A), 142-146 (2015).
- Paulson, D. P., et al. A novel controlled local drug delivery system for inner ear disease). Laryngoscope. 118 (4), 706-711 (2008).
- Fetoni, A. R., Troiani, D., Eramo, S. L., Rolesi, R., Paludetti Troiani, G. Efficacy of different routes of administration for Coenzyme Q10 formulation in noise-induced hearing loss: systemic versus transtympanic modality. Acta Otolaryngol. 132 (4), 391-399 (2012).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Direct drug application to the round window: a comparative study of ototoxicity in rats. Otolaryngol Head Neck Surg. 141 (5), 584-590 (2009).
- Pullens, B., van Benthem, P. P. Intratympanic gentamicin for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (3), (2011).
- Lavigne, P., Lavigne, F., Saliba, I. Intratympanic corticosteroids injections: a systematic review of literature. Eur Arch Otorhinolaryngol. , (2015).
- Park, S. H., Moon, I. S. Round window membrane vibration may increase the effect of intratympanic dexamethasone injection. Laryngoscope. 124 (6), 1444-1451 (2014).
- Phillips, J. S., Westerberg, B. Intratympanic steroids for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (7), (2011).
- Trune, D. R., Canlon, B. Corticosteroid therapy for hearing and balance disorders. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1928-1943 (2012).
- Wei, B. P., Stathopoulos, D., O'Leary, S. Steroids for idiopathic sudden sensorineural hearing loss. Cochrane Database Syst Rev. 7, (2013).
- Varela-Nieto, I., Silvia, M. -C., Rodriguez-de la Rosa, L. ourdes, Lassaletta, L. uis, Contreras, J. ulio IGF-I deficiency and hearing loss: molecular clues and clinical implications. Pediatr Endocrinol Rev. 10 (4), 12 (2013).
- Nakagawa, T., et al. Audiometric outcomes of topical IGF1 treatment for sudden deafness refractory to systemic steroids. Otol Neurotol. 33 (6), 941-946 (2012).
- Liu, H., et al. Evaluation of intratympanic formulations for inner ear delivery: methodology and sustained release formulation testing. Drug Dev Ind Pharm. 40 (7), 896-903 (2014).
- Nakagawa, T., Ito, J. Local drug delivery to the inner ear using biodegradable materials. Ther Deliv. 2 (6), 807-814 (2011).
- Buckiova, D., et al. Minimally invasive drug delivery to the cochlea through application of nanoparticles to the round window membrane. Nanomedicine. 7 (9), 1339-1354 (2012).
- Stover, T., Yagi, M., Raphael, Y. Cochlear gene transfer: round window versus cochleostomy inoculation. Hear Res. 136 (1-2), 124-130 (1999).
- Ahmed, T. A., Aljaeid, B. M. Preparation, characterization, and potential application of chitosan, chitosan derivatives, and chitosan metal nanoparticles in pharmaceutical drug delivery. Drug Des Devel Ther. 10, 483-507 (2016).
- Bhattarai, N., Gunn, J., Zhang, M. Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 62 (1), 83-99 (2010).
- Rao, S. B., Sharma, C. P. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential. J Biomed Mater Res. 34 (1), 21-28 (1997).
- Supper, S., et al. Thermosensitive chitosan/glycerophosphate-based hydrogel and its derivatives in pharmaceutical and biomedical applications. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 249-267 (2014).
- Riquelme, R., et al. A comparative study of age-related hearing loss in wild type and insulin-like growth factor I deficient mice. Front Neuroanat. 4, 27 (2010).
- Willott, J. F. Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8 Unit8 21B (2006).
- Cederholm, J. M., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hear Res. 292 (1-2), 71-79 (2012).
- Cediel, R., Riquelme, R., Contreras, J., Diaz, A., Varela-Nieto, I. Sensorineural hearing loss in insulin-like growth factor I-null mice: a new model of human deafness. Eur J Neurosci. 23 (2), 587-590 (2006).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Insulin receptor substrate 2 (IRS2)-deficient mice show sensorineural hearing loss that is delayed by concomitant protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) loss of function. Mol Med. 18, 260-269 (2012).
- Ngan, E. M., May, B. J. Relationship between the auditory brainstem response and auditory nerve thresholds in cats with hearing loss. Hear Res. 156 (1-2), 44-52 (2001).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Grewal, A. S., Nedzelski, J. M., Chen, J. M., Lin, V. Y. Dexamethasone uptake in the murine organ of Corti with transtympanic versus systemic administration. J Otolaryngol Head Neck Surg. 42, 19 (2013).
- Camarero, G., et al. Delayed inner ear maturation and neuronal loss in postnatal Igf-1-deficient mice. J Neurosci. 21 (19), 7630-7641 (2001).
- Rodriguez-de la Rosa, L., et al. Comparative gene expression study of the vestibular organ of the Igf1 deficient mouse using whole-transcript arrays. Hear Res. 330 (Pt A), 62-77 (2015).
- Sanchez-Calderon, H., et al. RNA microarray analysis in prenatal mouse cochlea reveals novel IGF-I target genes: implication of MEF2 and FOXM1 transcription factors. PLoS One. 5 (1), e8699 (2010).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Ruebhausen, M. R., Brozoski, T. J., Bauer, C. A. A comparison of the effects of isoflurane and ketamine anesthesia on auditory brainstem response (ABR) thresholds in rats. Hear Res. 287 (1-2), 25-29 (2012).
- Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. J Control Release. 174, 171-176 (2014).
- Astolfi, L., et al. Cochlear implants and drug delivery: In vitro evaluation of dexamethasone release. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (2), 267-273 (2014).
- Roche, J. P., Hansen, M. R. On the Horizon: Cochlear Implant Technology. Otolaryngol Clin North Am. 48 (6), 1097-1116 (2015).
- Duan, M. -l, Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. Journal of Otology. 4 (1), 34-43 (2009).
- Mikulec, A. A., Plontke, S. K., Hartsock, J. J., Salt, A. N. Entry of substances into perilymph through the bone of the otic capsule after intratympanic applications in guinea pigs: implications for local drug delivery in humans. Otol Neurotol. 30 (2), 131-138 (2009).
- Kang, W. S., et al. Intracochlear Drug Delivery Through the Oval Window in Fresh Cadaveric Human Temporal Bones. Otol Neurotol. 37 (3), 218-222 (2016).
- Lajud, S. A., et al. A regulated delivery system for inner ear drug application. J Control Release. 166 (3), 268-276 (2013).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res. 151 (1-2), 106-114 (2001).
