Summary
このレポートは、具体的には、哺乳動物細胞において標的遺伝子のスプライシングを調節する新規な人工スプライシング因子（ASFS）を設計および構築する生物工学の方法を記載しています。この方法はさらに、RNA代謝の他の側面を操作するための様々な人工的な要因を設計するために拡張することができます。
Abstract
ほとんどの真核生物RNAの処理は、具体的プレmRNA標的およびエフェクタードメインに結合するRNA認識モジュールを含むモジュラー構成とRNA結合タンパク質（RBPs）によって媒介されます。以前、我々は、RNA代謝を操作するために、様々な人工RBPsを操作するために使用されたプログラム可能なRNA結合足場を生成するために、ヒトPumilio 1にPUFドメインのユニークなRNA結合モードの利点をとっています。ここでは、詳細なプロトコルは、具体的には、標的遺伝子の選択的スプライシングを調節するように設計されたエンジニアースプライシング因子（のESF）を構築することが記載されています。プロトコル設計および構築物特定のRNA標的に対するカスタマイズPUF足場を、デザイナーPUFドメインおよびエフェクタードメインを融合させることによってESF発現プラスミドを構築する方法、およびどのように標的遺伝子のスプライシングを操作するためのESFを使用する方法を含みます。この方法の代表的な結果では、我々はまた、一般的なアッセイを記載していますスプライシングレポーターを用いたESF活性の測定、培養ヒト細胞におけるESFの適用、およびその後のスプライシング変化の影響が含まれる。このレポートの詳細なプロトコールに従うことにより、異なるタイプのオルタナティブスプライシング（AS）の調節のためのESFを設計および生成し、スプライシング調節を研究する新しい戦略および異なるスプライシングアイソフォームの機能を提供することが可能である。さらに、異なる機能ドメインを設計されたPUFドメインと融合させることにより、研究者はRNAプロセシングの様々なステップを操作するために特異的RNAを標的とする人工因子を設計することができる。
Introduction
ほとんどのヒト遺伝子は、選択的スプライシング（AS）が大きくゲノム1,2の符号化の複雑さを増加している別個の活動で複数のアイソフォームを生成するために受けます。 ASは、遺伝子機能を調節するための主要なメカニズムを提供し、それはしっかり異なる細胞及び発達段階3において、多様な経路を介して調節される、4。スプライシング誤は、ヒト疾患5、6、7、8の一般的な原因であるので、スプライシング規制を標的とすることは、魅力的な治療の経路となってきています。
主にスプライシング規制によって制御されているような代替エキソンのスプライシングエンハンサーまたはサイレンサーとして機能するプレmRNA中（のSRE）は、シス -Elements、スプライシング調節の簡易モデルによります。目ESEのSREは、具体的には、種々のトランス -actingタンパク質因子促進またはスプライシング反応3,9を抑制（ すなわち、スプライシング因子）を募集します。ほとんどのトランス -actingのスプライシング因子は、スプライシングを制御するためにその標的とエフェクタードメインを認識するために別の配列特異的RNA結合ドメインを持っています。最もよく知られた例は、エキソン包含10を促進するN末端RNA認識エキソンスプライシングエンハンサーと結合モチーフさ（Rrms）、およびC末端RSドメインを含むセリン/アルギニンリッチ（SR）タンパク質ファミリーのメンバーであります。逆に、のhnRNP A1は、RRMドメインを介しエキソンスプライシングサイレンサーに結合し、C末端グリシンリッチドメイン11を介しエキソン包含を阻害します。そのようなモジュラー構成を使用して、研究者らは、異なるeffecと特異的RNA結合ドメイン（RBD）を組み合わせることにより、人工的なスプライシング因子を設計することができなければなりませんスプライシングを活性化または阻害するドメインを含む。
そのような設計の鍵は、プログラム可能なRNA結合特異性を有する所定の標的を認識するRBDを使用することであり、これはTALEドメインのDNA結合様式に類似している。しかしながら、ほとんどの天然スプライシング因子は、弱い親和性で短いRNAエレメントを認識し、したがって予測RNA-タンパク質認識「コード」 12を欠くRRMまたはKホモロジー（KH）ドメインを含む。 PUFリピートタンパク質（ すなわち 、PUFドメイン）のRBDは、異なるRNA標的を特異的に認識するためのPUFドメインの再設計を可能にする独自のRNA認識モードを有する13,14。カノニカルPUFドメインは3つのα-ヘリックスの8つのリピートを含み、それぞれ8-nt RNA標的の単一塩基を認識する。第2のα-ヘリックスのある位置にあるアミノ酸の側鎖は、tのワトソン - クリック端と特異的な水素結合を形成するそのRNA塩基は、各リピートのRNA結合特異性を決定する（ 図1A ）。 PUF反復のRNA塩基認識のコードは、驚くほど単純であり（ 図1A ）、可能な8塩基の組み合わせを認識するPUFドメインの生成を可能にする（WeiおよびWang 15によって総説された）。
このモジュラー設計原理により、カスタマイズされたPUFドメインとスプライシング変調ドメイン（ すなわち 、SRドメインまたはGlyリッチドメイン）からなるエンジニアリングスプライシングファクター（ESF）の生成が可能になります。これらのESFは、スプライシングアクチベーターとして、または様々なタイプのスプライシング事象を制御するインヒビターとして機能することができ、ヒト疾患に関連する内因性遺伝子のスプライシングを操作するためのツールとして有用であることが判明している16,17 。一例として、Bcl-x遺伝子のスプライシングを特異的に改変するPUF-Gly型ESFを構築した抗アポトーシス長イソ型（Bcl-xL）をアポトーシス促進性の短いアイソフォーム（Bcl-xS）に変換する。 Bcl-xアイソフォームの比をシフトさせることは、いくつかの癌細胞を複数の抗癌化学療法薬16に感作させるのに十分であり、これらの人工因子が潜在的な治療薬として有用である可能性があることを示唆している。
既知のスプライシングエフェクタードメイン（ 例えば、 RSまたはGlyリッチドメイン）によるスプライシングの制御に加えて、改変されたPUF因子を用いて、新しいスプライシング因子の活性を調べることもできる。例えば、このアプローチを用いて、いくつかのSRタンパク質のC末端ドメインが異なるプレmRNA領域18に結合する場合、RBM4のアラニンに富むモチーフがスプライシング19を阻害し得ること、およびDAZAP1のプロリンが豊富なモチーフは、スプライシングを促進することができる20,21 </ SUP>。これらの新しい機能ドメインは、微調整のスプライシングには人為的な要因の追加タイプを構築するために使用することができます。
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Protocol
オーバーラップPCRによってカスタマイズされたRNA結合特異性を有するPUF骨格の1建設
- 具体的には、各位置12において異なるRNAヌクレオチドを認識PUF配列を含むPCRプライマーのシリーズを設計し（プライマー配列については表1を参照し、RNAについては、図1 のA参照 ：PUF認識コード）。各PUFの反復のために、各位置に異なる塩基を認識するために四つの異なるプライマーを設計します。
注：これらのプライマーは、互いに接合されるPUF断片（ 図1 B）を生成するために、PCR反応の4回の連続して使用されます。 - 代替スプライス部位の近くに標的遺伝子の認識部位を選択します。
注：このサイトは、ユーザによって決定することができ、それは通常10内で選択される - 代替スプライス部位から50ヌクレオチド。 - ラウンド1：コード配列を生成します4つのPUFリピート、ユニバーサルブリッジフラグメント、およびキャップフラグメントについては、
- ターゲットサイトを使用して、カスタマイズされたPUFの各リピートの認識コードを定義します。 PUFリピート1〜8のためのPCRプライマーのセットを選択する。以下に記載するように、カスタマイズされたPUFドメインを生成するためにPCRを4回連続して行う（ 図 1B ）。
- PCRの第1ラウンドでは、標準PCR反応混合物（2.5μLの10×緩衝液、0.5μLの10mM dNTP、0.5μLの10μMフォワードおよびリバースプライマー、50ngのDNA鋳型（ヒトcDNAまたは発現ベクターWT PUFドメイン）、および0.5U高忠実度DNAポリメラーゼ（最終容量25μL中）。
注：これらの反応は、各PUFリピート、ユニバーサルブリッジフラグメント、および異なる制限部位を有する2つのキャップフラグメント（ 図 1B ）に対応するDNA配列を生成する。テンプレート、プライマーの簡単なリストこの工程で用いたPCR産物を表2に示す。 - PCRプログラムを次のように設定します：95℃で5分間; 95℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で15秒間の28サイクル; 72℃で5分間のインキュベーション。高忠実度のDNAポリメラーゼを使用して、PCR中の点突然変異を最小限に抑えます。
- ラウンド2：R1 / R2 / R3 / R4（R1 - 4）とR5 / R6 / R7 / R8（R5 - 8）のコードシーケンスを生成する。
- ステップ1.3.3で得られたPCR産物を、1.5％アガロースゲル電気泳動（120Vの定電圧で25分間）を用いて分離する。ゲル精製キットを使用して、予想されるサイズのすべての製品をゲル精製します。次のラウンドのPCRで、これらの産物の異なる混合物をテンプレートとして使用してください。
注：3つのPCR産物をおおよそ1：1：1の比率で混合する。それらは、各製品の強度がゲル中で類似している限り、通常は定量化する必要はない。 - 精製PCR産物の約5％を温度PCRの次のラウンドでプレート。あるいは、精製されたPCR産物をUV-Vis分光光度計を用いて定量し、テンプレート混合物中の15ngの各PCR産物を使用する。
- 精製PCR産物R1 / R2、R3 / R4、およびBridge 2/3を混合テンプレートとして使用し、R1-FおよびR4-Rをプライマーとして使用する。重複PCR産物R1-4を得るために、ステップ1.3に記載のようにPCR反応をセットアップする。
- R5 / R6、R7 / R8、およびBridge 6-7を混合テンプレートとして使用し、R5-FおよびR8-Rをプライマーとして使用して、重複PCR産物R5-8（ 図 1B ）を得る。 PCRプログラムを次のように設定します：95℃で5分間; 95℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で30秒間の28サイクル; 72℃で5分。ゲル精製（R1-4およびR5-8）。
- ステップ1.3.3で得られたPCR産物を、1.5％アガロースゲル電気泳動（120Vの定電圧で25分間）を用いて分離する。ゲル精製キットを使用して、予想されるサイズのすべての製品をゲル精製します。次のラウンドのPCRで、これらの産物の異なる混合物をテンプレートとして使用してください。
- 第3ラウンド：R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8（R1 - 8は大文字なし）のコードシーケンスを生成する。
- 第3ラウンドのPCRでは、精製されたR1-4、R5-8、およびブリッジ4/5を混合テンプレートとして使用し、R1-FおよびキャップなしでPCR産物R1-8を重複取得するためにステップ1.3で説明したようにR8-Rをプライマーとして、PCR反応をセットアップします。
- 次のようにPCRプログラムを設定：95°Cで5分間。 95℃で30秒の28サイクル、55℃で30秒、及び72℃で55秒;そして72°Cで5分。キャップなしR1-8をゲル精製し。
- ラウンド4：完全PUFドメインのコード配列を生成します。
- ステップ1.3に記載のようにPCRの最終ラウンドで、プライマーとして混合テンプレートとキャップFとキャップ-Rのようにキャップと5 '末端及び3'末端キャップなしで精製されたR1-8を用いて、PCR反応をセットアップします最終変異したPUFドメインを取得します。
- 次のようにPCRプログラムを設定：95°Cで5分間。 95℃で30秒の28サイクル、55℃で30秒、及び72℃で1分;そして72°Cで5分。
- 最終的な再プログラムPUFドメインのPCR産物をゲル精製します。後工程でのESF発現プラスミドの構築のためにこれらの製品を使用してください。 SEQUPUFドメインの再プログラミングされた配列を確認するために、最終的な構築物をENCE。
注：キャップ-Fは、 をBamH IおよびXba I部位の間NLS（PPKKKRKV）をコードし、キャップ-Rは、（制限部位は、 図1 C、のESFの発現ベクターを構築するために設計された）停止コドンおよびSalI部位をコードします。
ESFの機能モジュールの2建設
- 2つの戦略は、一般のESFの機能モジュール（RSドメインまたはGlyでリッチドメイン）をクローニングするために使用される：テンプレート（ステップ2.2）として全ヒトcDNAを用いたPCRにより、これらのドメインを増幅するために、または直接、異なるRSのコードDNAフラグメントを合成しますまたはGlyでリッチドメイン（ステップ2.3）。
- 9G8（NP001026854）の238残基SRP40（NP008856）の180から272、または残基117 - - SC35（NP003007）の221使用PCRは、残基123からRSドメインをクローニングします。 hnRNP A1（NP_002127）の320、残基 - 残基195からのGlyリッチドメインをクローニングhnRNP A3（NP919223）の378 - S 203 - のhnRNP A2（NP112533）、または残基211の353。
- 以下のためのプライマーを設計するためにNCBIプライマー設計ツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）またはプライマー3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）を使用しますRSドメインまたはGlyでリッチドメイン（のESFの機能モジュール）をクローニングします。
注：フォワードプライマーのNheIサイトの後にN末端FLAGタグを含みます。逆方向プライマーは、発現ベクターへのクローニングのためのBamHI部位（ 図1 C）を含有します。 - ステップ1.3で説明したようにRSまたはGlyでリッチドメインを増幅するために、標準的なPCR反応をセットアップします。次のようにPCRプログラムを設定：95°Cで5分間。 95℃で30秒の28サイクル、55℃で30秒、及び72℃で30秒。そして72°Cで5分。
- 以下のためのプライマーを設計するためにNCBIプライマー設計ツール（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）またはプライマー3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）を使用しますRSドメインまたはGlyでリッチドメイン（のESFの機能モジュール）をクローニングします。
- クローンRSドメインまたは直接DNA合成を通じてのGlyリッチドメイン。代わりSyntheの、ステップ2.2において、エフェクタードメインをコードするPCR産物を生成しますサイズ短断片RSドメイン（RSRSRSRSRSRS）又はDNAオリゴヌクレオチドの商業的供給源を使用してのGlyリッチドメイン（GYGGGGPGYGNQGGGYGGG）をコードするオリゴヌクレオチド。
ESFの発現プラスミドの構築3。
- 任意の発現ベクターを使用してESF発現プラスミドを構築します。
注：C末端FLAGエピトープにN-からコードする発現構築物にpGL-のGly-MS2（研究所デBiologie-CHR 11からのDr. R. Breathnachからの贈り物）を最初に使用した、GlyでリッチのhnRNP A1のドメイン、およびMS2コートタンパク質。したがって、この発現構築物は、次の工程で例として使用されます。
注：複数のクローニング部位を持つ他の発現ベクターも使用することができ、かつ標準的クローニング手順は一緒断片を結合するために適用されます。 - MS2コートタンパク質の断片を除去するために、ステップ3.1で述べた発現プラスミド1.5μgのダイジェスト（にpGL-のGly-MS2）。 restricを使用してくださいBamHIおよびSalIで37℃で1時間インキュベートした。同じ条件でBamH IおよびSal IでESFの認識モジュール（ステップ1.5で生成したNLSおよび再プログラムPUFドメインをコードする）を消化する。
- 制限消化反応に5倍のローディング色素を加え、DNAゲル染色を含む1.5％アガロースゲルで120Vで40分間ゆっくり電気泳動します。消化産物をゲル精製します。
- ESFインサートと発現ベクターDNAを3：1の比で精製した認識モジュール、1μLのDNAリガーゼ、および1μLの10×ライゲーションバッファーで10μLのライゲーション反応を準備します。ライゲーション反応を4℃で一晩インキュベートする。得られた構築物は、CMVプロモーターの制御下でGly-PUF型ESF（pGL-Gly-PUF）を発現する（ 図 1C ）。
- FLAG / Glyリッチドメインをコードするフラグメントを、 NheIおよびBamHI消化で3時間で1時間消化する7°C。 RSドメインをコードする断片と交換し（ステップ2.2で発生ものNhe IおよびBamHI Iによって消化）。得られた構築物は、RS-PUF型ESF（ 図1 C）を表します。
スプライシングレポーターの4建設
- Xho Iおよびアパ IサイトまたはのXho IおよびEcoRI部位に隣接する候補配列（PUFドメインの、すなわち標的配列）を含むオリゴヌクレオチドを合成します。 Xho Iおよびアパ IまたはのXho IおよびEcoRI部位の付着末端により隣接PUFドメインの認識部位を含む二本鎖インサートを得るために55℃で5分間のオリゴヌクレオチドをアニールします。
- 前述のモジュラースプライシングレポーター試験エクソン（ヒトIGF2BP1、EnsemblのID ENSG000001のエクソン12によって分離された2つのGFPエキソンが含ま22、pGZ3から開始59217）およびそのフランキングイントロン。
注：試験エキソンを合成候補配列を含むオリゴヌクレオチド（PUFドメインの標的配列）を挿入するために使用することができるのXho Iおよびアパ I部位で操作しました。このモジュールスプライシングレポーター（pGZ3）は、プラスミドリポジトリの追加遺伝子を介して提供されます。 - 37℃で1時間のXho IとのApaI制限エンドヌクレアーゼで基地レポーターpGZ3（ステップ4.2で調製した）を消化します。
- ステップ3.3で説明したように消化物をゲル精製します。
- 1のモル比で、DNAリガーゼの1μL、および10Xライゲーションバッファーの1μL：3のステップ4.4で生成され、ステップ4.1で生成された二本鎖挿入および消化pGZ3ベクターをライゲーション反応液10μlを調製します。構築スプライシングレポーターベクトルpGZ3を得るために、4℃で一晩ライゲーション反応をインキュベートします。
- 以前にステップ4.1で生成された二本鎖のインサートを挿入手順に記載したようにレポーター、PEZ-1Bは、競合5' SSレポーターと競合する3' SSレポーターを取得し、PEZ-2F（ のXho Iおよびアパ I部位を用いて）23、（ のXho IおよびEcoRI部位を用いて）公開4.3から4.5まで。
注：スプライシングレポーターの両方のタイプは、Add-遺伝子を通じて利用できるようになります。
ESFのためのレンチウイルス発現ベクターの構築5。
- 元の発現ベクター（にpGL-Glyを-PUFもしくはにpGL-RS-PUF） のMlu I / のSpe I部位を含むプライマーを用いての全長のESFを増幅するために、ステップ1.3で説明したように、標準的なPCR反応をセットアップします。次のようにPCRプログラムを設定：95°Cで5分間。 95℃で30秒の28サイクル、55℃で30秒、及び72℃で1.5分。そして72°Cで5分。
- 消化反応、ゲル精製し、ライゲーション反応を介して、 のMlu間、レンチウイルス発現ベクター、pWPXLdへのESFを統合Spe Iサイトを参照してください。
- pWPXLd-Gly-PUF（Bcl-x）、pWPXLd-Gly-PUF（pWPXLd-Gly-PUF）のベクターでpsPAX2およびpMD2.GをパッケージングすることによってHEK293T細胞を同時トランスフェクションすることによりレンチウイルスを生成するために、 wt）（特異性対照として）、またはpWPXLd-GFP（模擬）である。
- 5×10 6個の HEK293T細胞を10cm皿に播種し、37℃および5％CO 2の加湿インキュベーター内で皿あたり10％ウシ胎仔血清（FBS）を補充した10mLのダルベッコ変法イーグル培地（DMEM） 。細胞が70〜90％コンフルエントである場合、トランスフェクションを行う。
- pWPXLd-Gly-PUF（Bcl-x）、pWPXLd-Gly-PUF（wt）または10μgのpWPXLd-Gly-PUFのいずれかの10μgを3つのプラスミド（7.5μgのパッケージングベクター、psPAX2;2.5μgのpMD2.G; 、またはpWPXLd-GFP）を2mLチューブに添加する。
- 0.25M CaCl560μLを加える。2mLチューブへの2×BBS溶液2μLおよび560μL。穏やかに数回混合し、RTで15分間インキュベートして、トランスフェクション混合物を調製する。
- すべてのトランスフェクション混合物を10cmディッシュに加えます。穏やかに皿を振り、3％CO 2および37℃で一晩インキュベートする。
- 培地を除去し、2％FBSを含む新鮮なDMEM 10 mLを各皿に加え、10％CO 2および37°CO / Nでインキュベートする。
- 皿から最初の上清を集める。各ディッシュに2％FBSを含む10mLの新鮮なDMEMを加える。皿O / Nを10％CO 2および37℃でインキュベートする。 4℃で上清を保存する。
- 皿から2番目の上清を集める。 1回目と2回目の収穫の上清をプールする。 0.4μmフィルターでろ過して細胞破片の上清を除去する。清澄な上清を直接使用するか、-80℃で保存してください。
- HEK2を感染させることによりレンチウイルスの力価を決定するウイルス調製物の連続希釈液と93T細胞を、以前のように25を報告しました。
6.具体的に変調するエクソンの包含とのESFとスプライスサイトの代替使用
- シード2×10 24ウェルプレートの各ウェルに5個の HEK293T細胞。 DMEM500μlの一晩細胞を成長させるには、37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中、10％FBSを補充しました。
- 使用前に穏やかにボトルを反転させることによって、リポソームトランスフェクション試薬を混ぜます。低血清培地50μlのリポソームトランスフェクション試薬の2μLに希釈します。穏やかに混合し、室温で5分間、それらをインキュベートします。
- 滅菌チューブに減少血清培地50μlにpGZ3レポータープラスミドのにpGL-のGly-PUF発現ベクター0.04μgの0.2μgの希。 pGL-RS-PUF発現ベクター及び滅菌チューブ中の還元血清培地50μlにpGZ3レポータープラスミド0.2μgの0.4μgの希。 D0.4μgのpGL-RS-PUF発現ベクターおよび0.2μgのpEZ-1BまたはpEZ-2Fレポータープラスミドを、滅菌チューブ中の50μLの還元血清培地に希釈する。
- 室温で5分間インキュベートした後、ステップ6.2で調製した希釈リポソームトランスフェクション試薬をステップ6.3で調製した希釈プラスミドと穏やかに混合する。混合物をRTで20分間インキュベートする。
- ステップ6.4で調製した発現ベクターおよびトランスフェクション試薬を含むトランスフェクション混合物全体を各ウェルに加え、37℃および5％CO 2の加湿インキュベーター内で少なくとも12時間インキュベートする。
- 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターで12時間後、各ウェルから培地を捨て、500μLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）/ウェルで洗浄する。
- PBSを捨て、各ウェルに200μLのトリプシンを加える。プレートを37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターで5分間インキュベートする。 1 mLの培地を添加してdiを停止させる。細胞を滅菌1.5mLチューブに移す。
- チューブを5,000 xgで3分間遠心分離し、培地を捨てる。チューブ当たり0.5mLのRNA抽出バッファーを加えて、繰り返しピペッティングにより細胞を溶解する。ホモジナイズしたサンプルを5分間インキュベートする。
- RNA抽出バッファーで処理したサンプルごとに、0.5 mLのRNA抽出バッファーに0.1 mLのクロロホルムを加えます。チューブを15秒間反転させ、室温で3分間インキュベートする。
- 12,000 xgおよび4℃で15分間チューブを遠心分離する。水相を新しいチューブに移す。最初の均質化のために使用した0.5mLのRNA抽出バッファーあたり0.25mLのイソプロパノールを添加する。
- ボルテックスで混合し、RTで10分間インキュベートする。 4℃で12,000 xgで10分間遠心分離する。遠心分離後、RNA沈殿物は通常チューブの底に見える。
- 上清を捨て、0.5 mLのRNA抽出バッファーにつき0.5 mLの75％エタノールでRNAペレットを洗浄する。
- 激しくボルテックスし、7,500 xgで5分間4℃で遠心します。上清を除去し、RNAペレットを乾燥させる。 50μLのRNaseフリー水にRNAを溶解する。
- 各50μLRNA溶液に5U /μLDNase I 2μL、10×バッファー7μL、H 2 O 11μLを加えます。チューブを37℃で1時間インキュベートする。 DNaseを不活性化するために、それらを70℃で15分間加熱する。
- 各サンプルについて、以下の成分を0.2 mLのヌクレアーゼフリーチューブに添加する：1μLの50μMオリゴdT、5μLの400 ng /μLRNA（2μg）、1μLの10 mM dNTP、および3μLのH逆方向PCRを行う。
- 混合物を65℃で5分間加熱し、氷上で少なくとも2分間インキュベートして、二次構造の改質を防止する。同じチューブに以下の成分を加えます：4μLの5倍ファーストストランド緩衝液、1μLの0.1M DTT、1μLの200U /μL逆転写酵素、および4μLのH 2 </サブ> O。穏やかに上下にピペッティングすることによって混合し、60分間50℃でインキュベートします。 70℃で15分間加熱することにより反応を停止させます。
- 10×PCR緩衝液、10 mMのdNTPミックス、10μMのフォワードプライマーの1μL、0.5μLの2.5μL、10μMの1μLの各サンプルについて、体標識されたPCRを完了するためにPCRチューブに以下の成分を追加リバースプライマー、5 U /μLのTaq DNAポリメラーゼ0.25μL、25 nMでのCy5-dCTPを0.5μL、ステップ6.15において調製されたcDNAの2μL。
- （30秒間94℃、60℃30秒、72℃30秒）PCRの25サイクルを行い、分子を変性するために2分間94℃で反応を加熱し、72℃で反応を維持7分、次いで4℃保持でそれを残します。
- 1Xトリス塩基、ホウ酸、およびEDTA（TBE）緩衝液で10％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によりPCR産物を解決します。蛍光スキャナーを使用してスキャンを実行します。計測デンシトメトリーソフトウェアを使用して、各スプライシングアイソフォームの量。
7. ESF内因性のBcl-Xのスプライシングを調節し、アポトーシスへの効果を測定するために
- 24ウェルプレートの各ウェルにプレート2×10 5 HeLa細胞。 DMEM500μlの一晩細胞を成長させるには、37℃、5％CO 2インキュベーター中、10％FBSを補充しました。
- 12時間後、（にpGL-のGly-PUF（WT）を2μgまたは0.2μgの、1μgの、及びにpGL-Glyを-PUF（531）の2μgののBcl-Xプレを認識する再プログラムPUFドメインを細胞にトランスフェクト高い親和性でmRNAを、 図2A を参照されたいです）。
- 24時間後、細胞を採取します。細胞の1/3はRNA単離およびPCR分析のためには、（6.8ステップ - 6.17）、および2/3タンパク質の単離のためのものです。
- ウェスタンブロット分析のために、2Xドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）10分間ローディング緩衝液中の全細胞ペレットを沸騰、その後、12％SDS-PAGEゲル中のタンパク質を解決します。ニトロセルロース膜上にタンパク質を転送します。
- RTで1時間、5％ミルクで膜をブロックし、（1：1,000）、カスパーゼ-3と膜のO / Nインキュベート、PARP（1：1,000）、またはβ-アクチン（1：5,000）で希釈した一次抗体（ 4℃で5％ミルク）。
- PBSは、ロッキングシェーカー上にてRT 3Xで5分間、0.1％のTween 20（PBS-T）を含有する膜を洗浄します。 RTで1時間（5％ミルクで希釈し5,000、1）HRP結合抗体で膜をインキュベートします。
- RTでPBS-Tで3回で膜を洗浄した後、ECLウェスタンブロッティング検出試薬を用いて膜を開発。
- 、カバーガラス上にポリ-L-リジン（PLL）の250μLを追加し、室温で15分間それをインキュベートし、そして液体を吸い上げます。 5分ごとにPBS 3XとPLLでコーティングしたカバーガラスを洗浄します。アポトーシスを測定する免疫アッセイのために、6ウェルプレート中のポリ-リジンでコーティングされたガラスカバースリップ上にシード5×10 5個の HeLa細胞。トランスフェクションのpGL-Gly-PUF（WT）またはpGL-Gly-PUF（531）プラスミドをリポソームトランスフェクション試薬（工程6.1〜6.5参照）を用いてHeLa細胞に導入した。
- トランスフェクションの24時間後、室温で20分間、1×PBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）1mLでカバースリップ上に細胞を固定する。注意：PFAは有毒です。ヒュームフードで注意して取り扱ってください。
- 静かに1x PBS 2mLを加えてカバースリップ上の細胞を洗浄する。それらを5分間インキュベートする。ピペットでPBSを除去する。洗濯を3回繰り返します。
- 0.2％Triton X-100で10分間1×PBSで細胞を透過させ、1×PBSで3回洗浄する。
- 10分間1×PBS中の3％ウシ血清アルブミン（BSA）で細胞をブロックし、それらを1×PBSで3回洗浄する。
- 3％BSA / PBSで1：1,000のFLAG抗体を希釈し、希釈したFLAG抗体30μLをパラフィルムシート上にピペッティングする。
- 細胞を含むカバースリップを取り出し、余分な緩衝液を実験室用ワイプで慎重に乾燥させ、30μLの抗FLAG sに逆さまに（細胞側を下に）置くolution。 RTで1時間のためにそれをインキュベートします。
- カバースリップは、溶液の上に浮かぶまで、一次抗体とインキュベートしたカバースリップの側に1×PBSの約500μLを追加します。ウェルに1×PBSで6ウェルプレートに戻します。
- それは5分ごとに1×PBSで3回洗浄します。
- 抗マウス二次抗体（1：500）希釈し、3％BSA / PBS中の、再び、各カバースリップのために30μLを使用しています。二次抗体溶液にカバーガラス逆さまに置き、室温で15分間静置します。
- ステップ7.15で説明したように、パラフィルムからカバースリップを削除します。 6ウェルプレートに戻し、それを入れて、5分毎に1×PBSで3回でそれを洗浄します。
- （DAPI付き）封入剤とカバーガラスをマウントし、過剰の培地を除去し、マニキュア液でエッジをシール。
- （100倍の倍率で）蛍光顕微鏡を用いて細胞を視覚化し、デジタルカメラを使って撮影します。
注：ESFの発現は、蛍光labeleにより可視化されますFLAGタグに対するD二次抗体、および核断片化は、DAPI染色を用いて可視化されます。
8. ESFを表現異なる癌細胞のアポトーシスを測定
- プロピジウムでアポトーシスを検出するDMEM mLの、37℃および5％CO 2インキュベーター中、10％FBSを補充した4と60-mmディッシュに2×10個の6個のHeLa細胞、MDA-MB-231細胞、およびA549細胞を分割ヨウ化物（PI）染色。
- 24時間後、培地をリフレッシュし、先に24を報告したように、レンチウイルスを調製します。
- 5に等しい細胞数へのウイルスの比率を作るために、新鮮な培地4mlに10×10 6レンチpWPXld-のGly-PUF（WT）、pWPXld-のGly-PUF（531）、又はpWPXld-GFPストックを希釈します。
- ステップ8.3で調製したウイルス含有培地4mlに、プレート中の培地を変更して、37℃、5％CO 2のインキュベーターでプレートをインキュベートします。感染の12時間後、培地を変えます。
- 感染の24時間後、収集し、2 / mlのPIの最終濃度を含むPBS溶液で5分間細胞を染色。
- 以前に16のように、フローサイトメーターでのPI染色細胞を分析します。
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Representative Results
この報告書は、ESFおよびスプライシングレポーターの設計および構築のための完全なプロトコールを記載する。また、内在性遺伝子のASを操作する際のESFのさらなる応用についても概説している16 。 ESFを介したスプライシングの変化の典型的な結果を説明するために、前の研究のデータを例として使用します。異なる機能ドメインを有するESFを用いて、標的カセットエキソンの包含を促進または阻害することができる（ 図 1DおよびE ）。 ESFはまた、レポーターシステム（ 図 1F ＆ G ）における代替の5 'および3'スプライス部位の使用に影響し得る。
内因性遺伝子の選択的スプライシングは、デザイナーESFで特異的に調節することもできる。我々は、このアプリケーションを仕様別の5 'スプライス部位を有する2つのアンタゴニストアイソフォームにスプライスすることができるBcl-xを意図的に標的とする。我々は、代替5 'スプライス部位間の8nt RNAエレメントを認識するESF、Gly-PUF（531）を設計した。このGly-PUF（531）はスプライシングを特異的にBcl-xSの産生にシフトした（ 図2A ）。 HeLa細胞にGly-PUF（531）をトランスフェクションした後、Bcl-xSアイソフォームおよびBcl-xSタンパク質のレベルは用量依存的に増加したが、対照ESF、Gly-PUF（WT） Bcl-xSのBcl-xLへの変換（ 図2の B ＆ C ）。さらに、デザイナーESFは、カスパーゼ3と、アポトーシスの2つのよく知られた分子マーカー（ 図 2D ）のポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）の切断を誘導することができる。予想通り、設計者のESFは、トランスフェクションされた細胞の核内に、主にデモとして局在する免疫蛍光顕微鏡によってnstrated（ 図2 E）。一貫して、のGly-PUF（531）によるスプライシングシフトは、これらの細胞がアポトーシス（ 図2 E）を受けていることを示し、核DNAの断片化を引き起こしました。アポトーシス細胞の増加がさらにランダムに選択されたフィールドから200個の以上の細胞を調べることによって、および断片化した核DNA（ 図2 F）を有する細胞の割合を定量することにより確認しました。
図1： のESFの設計および変調エクソンスキッピングにおけるそれらの活性。 PUFドメインとRNA標的との結合（A）特定のRNA-PUF構造及び概略図で示されています。のそれぞれについてPUF結合コード右側に異なる色で示された4つのRNA塩基は、PUF突然変異を設計するために使用される。 （ B ）カスタマイズされたPUFドメインを得るためのフローチャート。 「UGUAUAUA」を認識するPUFを例として用いた。カスタマイズされたRNA結合特異性（パネルAと同様にコードされた色）を有するPUF足場を組み立てるために、4ラウンドPCR戦略が使用される。第1ラウンドでは、2つの隣接PUFリピートに対する所望のRNA認識コードを組み込んだ一連のPCRプライマーを使用して、完全なPUFタンパク質（R1 / R2、R3 / R4）の8つのRNA認識コードを含む4つのフラグメントを生成する、R5 / R6、およびR7 / R8）。 N末端核局在化シグナル、C末端停止コドン、およびブリッジフラグメントをコードするキャップ断片も別々に産生される（5 '末端および3'末端キャップ、ブリッジ2/3、ブリッジ4/5およびブリッジ6 /7）。第2ラウンドでは、隣接するリピートを符号化するオーバーラップフラグメントを適切なブリッジと混合することによって新しいテンプレートが生成される（ 例えば、 R1 / R2、R3 / R4、およびブリッジ2/3はR1 - 4の鋳型を生成し、次いでDNAポリメラーゼで伸長してギャップを埋める。同様に、第3ラウンドはR1-4、R5-8、およびブリッジ4/5を結合する。最後に、第4ラウンドは、発現ベクターへのその後のクローニングのために、PUFドメインの5 '末端および3'末端キャップをクローニング部位とともに加える。 （ C ）ESFのモジュラードメイン組織。 ESFは、CMVプロモーター（矢印）によって駆動され、N-末端からC-末端にFLAGエピトープ（ESFの検出のため）、機能モジュール（Gly-リッチドメインまたはRSドメイン）、NLS （ESFの核局在化を促進する）、およびRNA認識ドメイン（PUFドメイン）を含む。 Nhe IおよびBamH Iは機能モジュールを挿入するように設計されているが、 Xba IおよびSal IはRNA認識ドメインを挿入するように設計されている。 （ D ）Gly-PUF ESFをエクソンスキッピングレポーターと同時発現させ、スプライシングパターンをRT-PCRによってアッセイする。修正されたPUF a B（具体的に同一の色で）は、それぞれ、8-merのターゲットAとBに結合します。異なる色のPUF - 標的対は対照として役立つように、すべての組み合わせが、使用されています。エクソンスキッピング（E）、競合5'スプライス部位（F）、または競合3'スプライス部位レポーター（G）上のRS-PUFの効果は、パネルDに類似の方法によりRT-PCRのデータをアッセイしました。 Wang らからのものです。 16。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2 のESFと内因性のBcl-XプレmRNAスプライシングの調節。 （A）内因性Bcのの選択的スプライシングの概略1xプレ-mRNA。 Bcl-xのエクソン2内の2つの別の5 'スプライス部位を用いて、異なるサイズの2つのアイソフォーム、Bcl-xLおよびBcl-xSを生成する。 2つの5 'スプライス部位間の配列UGUGCGUGがESF標的として選択され、WT PUFリピート1,3,5（Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S）がこの標的配列を認識するために再プログラムされる（アスタリスク）。得られたGlyリッチドメインを含むESFは、下流の5 's（赤い矢印で示される）の使用を阻害する。 （ B ）Bcl-x 5の使用の調節。異なる量のGly-PUF（531）発現構築物をHeLa細胞にトランスフェクトする。 Gly-PUF（WT）を対照として用いる。 Bcl-xの2つのアイソフォームは、Bcl-x遺伝子のエクソン1および3に対応するプライマーを用いてRT-PCRにより検出される。 Bcl-xSアイソフォームのパーセンテージを定量化し、下部に示す。 （ C ）ESFはBcl-xLおよびBcl-xSの発現レベルに影響を及ぼす。サンプルは、パネルBと同じ順序でロードされ、全てのタンパク質arウエスタンブロットによって検出される。 ESFの発現は抗FLAG抗体によって検出され、チューブリンレベルは対照として使用される。 （ D ）異なる量のESF発現構築物をHeLa細胞にトランスフェクトし、PARPおよびカスパーゼ3の切断をもたらす。サンプルは、トランスフェクションの24時間後にウエスタンブロットによって検出する。アクチンレベルは対照として検出される。 （ E ）トランスフェクトされたHeLa細胞におけるESFの細胞下局在は、抗FLAG抗体を用いた免疫蛍光顕微鏡法によって検出される。細胞をDAPIで共染色して核を示す。いくつかの核、特にGly-PUF（531）でトランスフェクトされた細胞では、アポトーシスのために断片化される。スケールバー：5μm。 （ F ）アポトーシス細胞（ すなわち 、断片化された核DNAを有する細胞）のパーセンテージは、蛍光顕微鏡画像のランダムに選択されたフィールドから測定される。バーは平均を示し、ドットは2つの実験からのデータを示す。図Wang らによる以前の報告書から変更されている。 Nature Publishing Groupの方針に従い、 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このレポートは、標的遺伝子の選択的スプライシングを操作できる人工的なスプライシング因子の設計と建設のための詳細な説明を提供します。この方法は、カスタマイズされた特異性を有するRNA結合足場を製造するために繰り返すPUFのユニークなRNA結合モードを利用します。それは、どちらかの活性化やスプライシングを抑制するために使用することができます。
このプロトコルにおける重要なステップでのESFの特異性を規定するreprogramed PUFドメインの生成です。 PCRステッチプロトコルが開発され、PUF足場の急速な生成のために最適化されています。 1：1：その成功の鍵は、1に異なる重複テンプレートの比率を調整することです。未精製の製品は、最後のラウンドからのプライマーの汚染を持っている可能性があるため、各ラウンド後のPCR産物の精製は、も重要です。もう一つの重要なステップは、半定量的RT-PCRを用いて、スプライシング比を分析することです。一般的に、あまりにも男PCR反応を飽和させる可能性があるので、増幅サイクルは避けるべきである。スプライシングレポーターの共発現を用いた我々の実験では、20〜25サイクルが日常的に使用されたが、これは内因性遺伝子のスプライシングを測定する際のmRNAの存在量に依存して変化し得る。新しいプライマー対を使用してスプライシングアイソフォームを定量する場合、以前に記載されたように、PCR実験を毎回較正することが推奨される（ 16） 。
特異性はPUFスカフォールド中の反復数によって決定されるため、デザイナーESFの潜在的な限界はオフターゲット効果である。 Wildtype PUFは、8-ntサイトを認識します。これは、「シードマッチ」によってそのターゲットを認識するsiRNAの特異性に匹敵します。しかし、任意の8-nt配列は転写産物65,000nt（ 4,8 = 65,536）で偶然に発生する可能性があるので、設計者PUFによって認識される他のオフターゲット転写物が存在する。オフターゲットエフェクト電気ショック療法は、追加の繰り返しでのPUFを使用することによって減少させることができます。しかし、まだ特異性とのESFのオフターゲット効果を評価するのに便利です。潜在的なオフターゲット効果を最小化するために、より低いレベルで、複数のデザイナーのESFの組み合わせの発現も行うことができます。実際のターゲットのスプライシングが相乗的に機能する複数のESFによって影響されるのに対し、このような場合には、オフターゲット遺伝子は、のESFの低い量に影響されなくてもよいです。この溶液は、研究者は、単一のmRNAの複数の部位を標的とするsiRNAプール（還元濃度でそれぞれ）がオフターゲット効果を減少させることができるのRNAiを用いて遺伝子サイレンシングに使用したものと同様です。
ASを操作する他の主要な方法は、プレmRNAの特定の領域と対アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することです。この既存の方法に比べ、のESFは、安定にトランスフェクトされた細胞において長期の効果を生じさせることができます。また、Eのin vivo送達アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビボ送達を制御することは非常に困難であるのに対し、SFは、遺伝子治療ベクターの増加武器を利用することができます。加えて、この方法は、オリゴヌクレオチドの複雑で高価な変更を回避することができます。種々の誘導性プロモーターを使用して、正しい細胞タイプにおける正しい時間にESF発現のより正確な制御も達成することができます。この方法の主な欠点は、比較的低い特異性（典型的なアンチセンスオリゴヌクレオチドで16〜20塩基の認識部位に対する8塩基認識部位）です。
選択的スプライシングの調節不全は、がん26、27を含む多くの疾患を引き起こします。ゲノムワイドな研究が癌28、29、30の様々なタイプで15,000以上の腫瘍関連スプライスバリアントを明らかにしました。例えば、イントロン腫瘍サプレッサー遺伝子のスプライス部位突然変異は、しばしばエキソンスキッピング事象を引き起こし、腫瘍発生に寄与し得る異常なタンパク質を産生する（26,31,32）。さらに、いくつかのスプライシング因子は、細胞形質転換33,34に寄与する多くの癌型において過剰発現されることが判明しており、スプライシング因子も癌の生命発生において重要な役割を果たすことができることが示されている。したがって、遺伝子機能を調節するための有用なツールを提供することに加えて、デザイナーESFを用いたスプライシングの操作は、癌における誤った調節されたスプライシング事象を回復し、潜在的な治療ツールを提供し得る。さらに、設計者のPUFドメインを異なる機能ドメインと融合させることにより、様々なRNA代謝プロセスを操作する複数の人工因子を設計することができる。例えば、翻訳アクチベーター（GLD2）または翻訳主体PUFドメインを有するレゾルサー（CAF1）は、mRNA翻訳を活性化または阻害する新規因子を産生した27 。同じデザインプリンシプルを使用して、DNA制限酵素17と同様に機能する人工部位特異的RNAエンドヌクレアーゼ（ASRE）を生成するために、非特異的RNAエンドヌクレアーゼドメイン（PIN）と一連のデザイナーPUFドメインを組み合わせました。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIH助成金R01-CA158283とNSFCによってサポートされていましたZWYWへの補助金31400726は若い千の才能プログラムと中国の国家自然科学基金（補助金31471235と81422038）によって運営されています。 XYは、中国のポスドク科学財団（2015M571612）によって運営されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
| DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
| Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
| Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
| RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
| PBS (1x) | Life Technologies | 10010-031 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) | Invitrogen | 18080044 | |
| Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
| PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
| beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
| FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
| Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
| ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
| Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
| Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) | BD Bioscience | FACSCalibur | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
| Triton-X100 | Promega | H5142 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P-4832 | Filter-sterilize and store at 4 °C |
| Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
| Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |
References
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