Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Ingeniør Kunstige Faktorer å Spesifikt Manipulere alternativ spleising i humane celler

doi: 10.3791/54967 Published: April 26, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Denne rapporten beskriver en bioengineeringsmetode for å designe og konstruere nye kunstige spleisningsfaktorer (ASFs) som spesifikt modulerer spleising av målgener i pattedyrceller. Denne metoden kan utvides ytterligere til å konstruere ulike kunstige faktorer for å manipulere andre aspekter av RNA-metabolisme.

Abstract

Behandlingen av de fleste eukaryote RNAer medieres av RNA-bindingsproteiner (RBPs) med modulære konfigurasjoner, inkludert en RNA-gjenkjenningsmodul, som spesifikt binder pre-mRNA-målet og et effektor-domene. Tidligere har vi benyttet den unike RNA-bindingsmodusen til PUF-domenet i humant Pumilio 1 for å generere et programmerbart RNA-bindingsstall, som ble brukt til å konstruere forskjellige kunstige RBP for å manipulere RNA-metabolisme. Her beskrives en detaljert protokoll for å konstruere Engineered Splicing Factors (ESFs) som er spesielt designet for å modulere den alternative spleising av målgener. Protokollen inkluderer hvordan man skal designe og konstruere et tilpasset PUF-stillas for et bestemt RNA-mål, hvordan man konstruerer et ESF-ekspresjonsplasmid ved å kombinere et designer-PUF-domene og et effektor-domene, og hvordan man bruker ESF til å manipulere spleising av målgener. I de representative resultatene av denne metoden har vi også beskrevet de felles analyseneAv ESF-aktiviteter ved hjelp av splitsingsreportere, anvendelsen av ESF i dyrkede humane celler, og den påfølgende effekten av spleising endringer. Ved å følge de detaljerte protokollene i denne rapporten, er det mulig å designe og generere ESFer for regulering av ulike typer Alternative Splicing (AS), og gi en ny strategi for å studere spleisregulering og funksjonen til forskjellige spleisisoformer. Videre kan forskere ved å kombinere forskjellige funksjonelle domener med et designet PUF-domene konstruere kunstige faktorer som målretter mot bestemte RNAer for å manipulere ulike trinn i RNA-behandling.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De fleste humane gener undergå alternativ spleising (AS) for å produsere flere isoformer med forskjellige aktiviteter, som i stor grad har økt kompleksiteten koding av genomet 1, 2. AS gir er en hovedmekanisme for å regulere gen-funksjon, og det er strengt regulert ved forskjellige baner i forskjellige cellulære og utviklingsstadier 3, 4. Fordi spleising misregulation er en vanlig årsak til human sykdom 5, 6, 7, 8, rettet spleising regulering blir et attraktivt terapeutisk rute.

I henhold til en forenklet modell av spleising regulering, AS er i hovedsak kontrollert av spleising Regulatory cis -Elements (SRE) i pre-mRNA som fungerer som spleise forsterkere eller dempere av alternative eksoner. thEse SREs rekrutterer spesifikt ulike transaktive proteinfaktorer ( dvs. spleisefaktorer) som fremmer eller undertrykker spleisereaksjonen 3 , 9 . De fleste transaktive spleisefaktorer har separate sekvensspesifikke RNA-bindende domener for å gjenkjenne deres mål og effektor-domener for å kontrollere spleising. De mest kjente eksemplene er medlemmene av den serine / argininrike (SR) proteinfamilien som inneholder N-terminale RNA-anerkjennelsesmotiver (RRMs), som binder exoniske spleiseforsterkere og C-terminale RS-domener, som fremmer exon-inklusjon 10 . Omvendt binder hnRNP A1 til exonic splice-silencers gjennom RRM-domenene og hemmer ekson-inkludering gjennom et C-terminalt glycinrikt domene 11 . Ved hjelp av slike modulære konfigurasjoner bør forskere kunne konstruere kunstige spleisningsfaktorer ved å kombinere et bestemt RNA-Binding Domain (RBD) med forskjellig effekttor domener som aktiverer eller hemmer spleising.

Nøkkelen av en slik konstruksjon er å bruke en RBD som gjenkjenner gitt mål med programmerbar RNA-bindende spesifisitet, som er analog med den DNA-bindende modusen for den TALE-domenet. Men de fleste naturlige spleise faktorer inneholder RRM eller K Homologi (KH) domener, som gjenkjenner korte RNA-elementer med svak affinitet og således mangler en prediktiv RNA-proteingjenkjennings "kode" 12. Den RBD av PUF vendende proteiner (dvs. PUF domene) har et unikt gjenkjennings RNA-modus, noe som tillater den nye utformingen av PUF domener til spesifikt å gjenkjenne forskjellige RNA er rettet mot 13, 14. Kanonisk PUF domene inneholder åtte gjentagelser av tre a-helikser, som hver gjenkjenner en enkelt base i et 8-nt RNA target. Sidekjedene til aminosyrene i visse posisjoner av de nest α-heliks skjema spesifikke hydrogenbindinger med Watson-Crick kant av tHan RNA base, som bestemmer den RNA bindende spesifisitet av hver repetisjon ( figur 1A ). Koden for RNA-base-anerkjennelse av PUF-gjenta er overraskende enkel ( figur 1A ), slik at generering av PUF-domener som gjenkjenner en mulig 8-basekombinasjon (gjennomgått av Wei og Wang 15 ).

Dette modulære designprinsippet tillater generering av en Engineered Splicing Factor (ESF) som består av et tilpasset PUF-domene og et splicing-modulasjonsdomene ( dvs. et SR-domene eller et Gly-rikt domene). Disse ESFene kan fungere som enten spleiseaktivatorer eller som inhibitorer for å kontrollere ulike typer spleisehendelser, og de har vist seg nyttige som verktøy for å manipulere spleising av endogene gener relatert til menneskers sykdom 16 , 17 . Som et eksempel har vi konstruert PUF-Gly-type ESFer for å spesifikt endre spleising av Bcl-x-genet, Konvertering av anti-apoptotisk lang isoform (Bcl-xL) til pro-apoptotisk kort isoform (Bcl-xS). Forandring av forholdet mellom Bcl-x isoformen var tilstrekkelig til å sensibilisere flere kreftceller til flere anti-kreft kjemoterapi-legemidler 16 , noe som tyder på at disse kunstige faktorene kan være nyttige som potensielle terapeutiske reagenser.

I tillegg til å kontrollere spleising med kjente spleiseffektor-domener ( f.eks. Et RS- eller Gly-rikt domene), kan de konstruerte PUF-faktorene også brukes til å undersøke aktivitetene til nye spleisningsfaktorer. Ved å bruke denne tilnærmingen har vi for eksempel vist at det C-terminale domenet til flere SR-proteiner kan aktivere eller hemme spleising ved binding til forskjellige pre-mRNA-regioner 18 , at det alaninrike motivet av RBM4 kan hemme spleising 19 og at Det prolinrike motivet til DAZAP1 kan forbedre spleising 20 , 21 </ Sup>. Disse nye funksjonelle domener kan brukes til å konstruere andre typer kunstige faktorer for å finjustere spleising.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Konstruksjon av en PUF-stillas med tilpasset RNA-bindende spesifisitet ved overlapping av PCR

  1. Design en serie PCR-primere som inneholder PUF-sekvensene som spesifikt gjenkjenner forskjellige RNA-nukleotider i hver posisjon 12 (se tabell 1 for primer-sekvensene og se figur 1A for RNA: PUF-gjenkjennelseskoden). For hver PUF-gjentakelse, utform fire forskjellige primere for å gjenkjenne en annen base på hver posisjon.
    MERK: Disse primere vil bli brukt i en serie på fire runder med PCR-reaksjoner for å generere PUF-fragmenter som er sammenføyt ( figur 1 B ).
  2. Velg anerkjennelsesstedet til målgenet i nærheten av det alternative spleisstedet.
    MERK: Dette nettstedet kan avgjøres av brukeren, og det er vanligvis valgt innen 10 - 50 nt fra de alternative spaltingsstedene.
  3. Runde 1: Generer kodende sekvenserfor 4 PUF gjentar, universelle bro-fragmenter og fragmenter cap.
    1. Bruk målområde å definere anerkjennelse kode for hver gjentakelse av den tilpassede PUF. Velge det sett av PCR-primere for PUF gjentar 1 - 8. oppførsel fire påfølgende runder med PCR for å produsere et tilpasset PUF domene, som beskrevet nedenfor (figur 1 B).
    2. I den første runden av PCR, konfigurert standardreaksjonsblandinger PCR (inneholdende 2,5 pl 10x buffer, 0,5 ul 10 mM dNTPs, 0,5 ul 10 uM forover og revers primere, 50 ng DNA-templat (humant cDNA eller ekspresjonsvektor av WT PUF domene), og 0,5 U hi-fi-DNA-polymerase i en 25 ul sluttvolum).
      MERK: Disse reaksjoner vil fremstille DNA-sekvenser som svarer til hver PUF gjenta, til universelle bro fragmenter, og til to cap fragmenter med forskjellige restriksjonsseter (figur 1 B). En kort liste over maler, primere, Og genererte PCR-produkter som anvendes i dette trinnet er vist i tabell 2.
    3. Still PCR-programmet som følger: 5 minutter ved 95 ° C; 28 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 15 s ved 72 ° C; og 5 minutters inkubering ved 72 ° C. Bruk Hi-Fi-DNA-polymerase for å minimalisere punktmutasjoner i løpet av PCR.
  4. Runde 2: Generer kodende sekvenser for R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) og R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
    1. Separer PCR-produktene oppnådd i trinn 1.3.3 ved hjelp av elektroforese med en 1,5% agarosegel (25 minutter ved en konstant spenning på 120 V). Gel-rense alle produkter av den forventede størrelse ved hjelp av en gelrensing kit. Bruk en annen blanding av slike produkter som templat i de etterfølgende runder med PCR.
      MERK: Bland de tre PCR-produkter i omtrent et 1: 1: 1-forhold. De vanligvis ikke trenger å være kvantifisert, så lenge intensiteten av hvert produkt ligner på gel.
    2. Bland omtrent 5% av det rensede PCR-produkter som en template i den neste runde av PCR. Alternativt kan kvantifisere de rensede PCR-produkter ved hjelp av en UV-VIS spektrofotometer og bruke 15 ng av hvert PCR-produkt i malen blanding.
    3. Bruk rensede PCR-produkter R1 / R2, R3 / R4, og bro 2/3 som blandede maler og R1-F og R4-R som primere. Sett opp PCR-reaksjonen som beskrevet i trinn 1.3 for å oppnå overlappende PCR-produkt R1 - 4.
    4. Bruk rensede PCR-produkter R5 / R6, R7 / R8, og broen 6-7 som blandede maler og R5-F og R8-R som primere for å oppnå overlappende PCR-produkt R5-8 (figur 1 B). Still PCR-programmet som følger: 5 minutter ved 95 ° C; 28 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 30 s ved 72 ° C; og 5 min ved 72 ° C. Gel-rense R1-4 og R5-8.
  5. Runde 3: generere kodesekvenser for R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 uten deksler).
    1. I den tredje runden av PCR, ved anvendelse av det rensede R1-4, R5-8, og broen 4/5 som blandede maler og R1-F ogR8-R som primere, sett opp PCR-reaksjonen som beskrevet i trinn 1.3 for å oppnå overlappende PCR-produkt R1-8 uten caps.
    2. Sett PCR-programmet som følger: 5 minutter ved 95 ° C; 28 sykluser på 30 s ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 55 s ved 72 ° C; Og 5 minutter ved 72 ° C. Gel-rens R1-8 uten caps.
  6. Runde 4: Generer kodende sekvenser for komplette PUF-domener.
    1. I den siste runden med PCR, ved å bruke det rensede R1-8 uten kapp og 5'-ende og 3'-endehettene som blandede maler og Cap-F og Cap-R som primere, sett opp PCR-reaksjonen som beskrevet i trinn 1.3 For å oppnå de endelige muterte PUF-domene.
    2. Sett PCR-programmet som følger: 5 minutter ved 95 ° C; 28 sykluser på 30 s ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 1 min ved 72 ° C; Og 5 minutter ved 72 ° C.
    3. Gel-rens PCR-produktene fra de endelige omprogrammerte PUF-domenene. Bruk disse produktene til konstruksjon av ESF ekspresjon plasmid i de etterfølgende trinnene. SequEnce den endelige konstruksjonen for å verifisere de omprogrammerte sekvensene av PUF-domener.
      MERK: Cap-F koder for NLS (PPKKKRKV) mellom BamH I og Xba I steder og Cap-R koder for en stoppkodon og Sal I-stedet (restriksjonsseter ble konstruert for å konstruere ekspresjonsvektorer av ESFs, figur 1C).

2. Konstruksjon av en funksjonsmodul av ESFer

  1. To strategier brukes vanligvis til å klone funksjonsmoduler av ESFer (RS-domener eller Gly-rich-domener): å amplifisere disse domenene ved PCR ved å bruke totalt humant cDNA som en mal (trinn 2.2) eller for å syntetisere DNA-fragmentene som kodes for forskjellige RS Eller Gly-rik domener (trinn 2.3).
  2. Bruk PCR til å klone RS-domener fra rester 123 - 238 av 9G8 (NP001026854), rester 180-272 av SRP40 (NP008856) eller rester 117-221 av SC35 (NP003007). Klon Gly-rike domener fra rester 195 - 320 av hnRNP A1 (NP_002127), rests 203-353 av hnRNP A2 (NP112533), eller rester 211 - 378 av hnRNP A3 (NP919223).
    1. Bruk NCBI primerutforming verktøyet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) eller Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) for å designe primere for kloning RS domener eller Gly-rike domener (funksjonell modul av ESFs).
      MERK: forover primer inneholder et N-terminalt FLAG tag etter Nhe I-sete. Den reverse primeren inneholder et BamH I-sete for kloning inn i ekspresjonsvektorer (figur 1C).
    2. Sett opp standard PCR-reaksjonen, som beskrevet i trinn 1.3, for å forsterke de RS eller Gly-rike domener. Still PCR-programmet som følger: 5 minutter ved 95 ° C; 28 sykluser på 30 sek ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 30 s ved 72 ° C; og 5 min ved 72 ° C.
  3. Klon RS domener eller Gly-rike domener gjennom direkte DNA-syntese. I stedet for å generere PCR-produkter som koder for effektorcellene domenene i trinn 2.2, Synthesisstørrelse av et oligonukleotid som koder for en kort-fragment RS domene (RSRSRSRSRSRS) eller en Gly-rikt domene (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) ved bruk av en kommersiell kilde for DNA-oligonukleotider.

3. Bygging av ESF ekspresjonsplasmider

  1. Konstruere ESF ekspresjonsplasmider ved hjelp av en hvilken som helst ekspresjonsvektor.
    MERK: En ekspresjonskonstruksjon PGL-Gly-MS2 (en gave fra Dr. R. Breathnach fra Institute de Biologie-CHR 11) ble opprinnelig brukt, som koder fra N- til C-terminal, en FLAG-epitop, en Gly -rike domenet av hnRNP A1, og MS2-kappeprotein. Derfor er denne ekspresjonskonstruksjon brukt som et eksempel i det etterfølgende trinn.
    MERK: Andre ekspresjonsvektorer med multiple kloningsseter kan også anvendes, og standard kloningstrinn vil bli brukt til å bli fragmentene sammen.
  2. Digest 1.5 pg av ekspresjonsplasmidene (PGL-Gly-MS2) som er nevnt i trinn 3.1 for å fjerne den MS2-kappeproteinfragment. Bruk RESTRICsjon endonukleasene BamHI og Sal I i 1 time ved 37 ° C. Fordøye identifikasjon modul av ESFs (som koder for et NLS og omprogrammeres PUF domener, genereres i trinn 1.5) med BamH I og Sal I i samme tilstand.
  3. Legg 5x lasting fargestoff til restriksjonsfordøyelse reaksjoner og langsomt electrophorese det totale volumet med en 1,5% agarosegel inneholdende en DNA-gel flekk i 40 minutter ved 120 V. Gel-rensing av spaltede produkter.
  4. Fremstilles 10 ul ligeringsreaksjoner med en renset erkjennelse modul av ESF innsatser og ekspresjonsvektor-DNA i et forhold 3: 1, 1 pl DNA-ligase, og 1 pl 10 x ligeringsbuffer. Inkuber ligeringsreaksjonene over natten ved 4 ° C; den resulterende konstruksjon uttrykker en Gly-PUF-type ESF (PGL-Gly-PUF) under kontroll av en CMV-promoter (figur 1C).
  5. Fjern det fragment som koder for FLAG / Gly-rik domene med Nhe I og BamH I-fordøyelse i 1 time ved 37 ° C. Erstatte det med et fragment som koder for RS-domenet (er generert i trinn 2.2, også spaltet med Nhe I og BamH I); Den resulterende konstruksjon gir uttrykk for en RS-PUF-type ESF (figur 1C).

4. Bygging av skjøte Reporter

  1. Syntetisere oligonukleotider som inneholder kandidatsekvenser (dvs. målsekvenser av PUF domener) flankert av Xho I og Apa I-seter eller Xho I- og EcoR I-seter. Annealere de oligonukleotider i 5 min ved 55 ° C for å oppnå dobbelt-trådet innsatser inneholdende gjenkjenningssetene av PUF domener flankert av de kohesive ender med Xho I og Apa I og Xho I og EcoR I-seter.
  2. Start fra en tidligere beskrevet modulær skjøting reporter 22, pGZ3, som inneholder to GFP eksoner atskilt med et test exon (exon 12 av den menneskelige IGF2BP1, Ensembl ID ENSG00000159217) og dens flankerende introner.
    MERK: Testexonet ble konstruert med Xho I og Apa I-steder, som kan brukes til å sette inn syntetiserte oligonukleotider som inneholder kandidatsekvensene (målsekvenser av PUF-domener). Denne modulære spleise-reporteren (pGZ3) er tilveiebragt gjennom plasmid-repository Add-gen.
  3. Fordel basisreporter pGZ3 (fremstilt i trinn 4.2) med Xho I og Apa I restriksjonsendonukleaser i 1 time ved 37 ° C.
  4. Gel-rense de fordøyede produktene som beskrevet i trinn 3.3.
  5. Forbered 10 μl ligeringsreaksjoner med de dobbeltstrengede innsatsene generert i trinn 4.1 og den fordøyede pGZ3-vektoren generert ved trinn 4.4 i et 3: 1 molforhold, 1 μl DNA ligase og 1 μl 10x ligeringsbuffer. Inkubere ligeringsreaksjonene over natten ved 4 ° C for å oppnå konstruksjonssplitningsreportervektor pGZ3.
  6. Sett inn de dobbeltstrengede innsatsene som ble generert i trinn 4.1 i det tidligerePubliserte reportere, pEZ-1B (ved hjelp av Xho I og EcoR I-steder) og pEZ-2F (ved hjelp av Xho I og Apa I-steder) 23 , for å få den konkurrerende 5's-reporteren og den konkurrerende 3's-reporteren, som beskrevet i trinn 04.03 til 04.05.
    MERK: Begge typer splicing-rapportører vil være tilgjengelige gjennom Add-gen.

5. Konstruksjon av lentivirale ekspresjonsvektorer for ESF

  1. Sett opp den vanlige PCR-reaksjonen som beskrevet i trinn 1.3 for å amplifisere ESF fra full lengde fra de originale ekspresjonsvektorer (pGL-Gly-PUF eller pGL-RS-PUF) med primere som inneholder Mlu I / Spe I-steder. Sett PCR-programmet som følger: 5 minutter ved 95 ° C; 28 sykluser på 30 s ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 1,5 minutter ved 72 ° C; Og 5 minutter ved 72 ° C.
  2. Gjennom en fordøyelsesreaksjon integrerer gelrensning og ligeringsreaksjon ESFene i den lentivirale ekspresjonsvektoren, pWPXLd, mellom Mlu Spe I nettsteder, som beskrevet i trinn 3.2-3.4.
  3. Bruk standardkalsiumfosfatutfellingsmetoden, som tidligere rapportert 24 , for å generere lentiviruser ved cotransfeksjon av HEK293T-celler ved å pakke vektorer, psPAX2 og pMD2.G, med enten pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF Wt) (som spesifisitetskontroll), eller pWPXLd-GFP (mock).
    1. Seed 5x10 6 HEK293T-celler i 10 cm-retter og dyrk cellene over natten i 10 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) per fat i en fuktig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 . Utfør transfeksjonen når cellene er 70 - 90% konfluente.
    2. Forbered plasmidblandingen ved å tilsette de tre plasmidene (7,5 μg emballasjevektoren, psPAX2, 2,5 μg pMD2.G og 10 μg av enten pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (wt) , Eller pWPXLd-GFP) til et 2 ml rør.
    3. Tilsett 560 μl 0,25 M CaCl2 og 560 ul av 2x BBS løsning på 2-ml tube. Bland forsiktig flere ganger og inkuberes det i 15 minutter ved RT for å fremstille transfeksjonsblandingen.
    4. Legg alle transfeksjonsstudier blandinger til 10 cm retter. Virvel retter forsiktig og inkuber dem over natten ved 3% CO2 og 37 ° C.
    5. Fjern medium, tilsett 10 ml frisk DMEM med 2% FBS til hver skål, og inkuber dem ved 10% CO2 og 37 ° CO / N.
    6. Samle den første supernatanten fra oppvasken. Tilsett 10 ml frisk DMEM med 2% FBS til hver skål. Inkuber retter O / N 10% CO2 og 37 ° C. Oppbevar supernatanten ved 4 ° C.
    7. Samle den andre supernatant fra retter. Pool supernatanten fra den første og andre avlinger. Fjerne supernatanten av celleavfall ved å filtrere den gjennom et 0,4 um filter. Bruk fjernet supernatanten direkte eller lagre det ved -80 ° C.
  4. Bestem titer av lentivirus ved å infisere HEK293T-celler med serielle fortynninger av viruspreparatet, som tidligere rapportert 25 .

6. Spesifikt Modulerende Exon Inkludering og Alternativ Bruk av Splice Sites med ESFs

  1. Seed 2 x10 5 HEK293T celler i hver brønn i en 24-brønn plate. Voks cellene over natten i 500 μl DMEM tilsatt 10% FBS i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Bland det liposomale transfeksjonsreagenset ved å forsiktig reversere flasken før bruk. Fortynn 2 μl liposomalt transfeksjonsreagens i 50 μl redusert serummedium. Bland forsiktig og inkuber dem i 5 min ved RT.
  3. Fortynn 0,04 μg pGL-Gly-PUF ekspresjonsvektorer og 0,2 μg pGZ3-reporterplasmider i 50 μl redusert serummedium i et sterilt rør. Fortynn 0,4 μg pGL-RS-PUF ekspresjonsvektorer og 0,2 μg pGZ3-reporterplasmider i 50 μl redusert serummedium i et sterilt rør. DIlute 0,4 μg pGL-RS-PUF ekspresjonsvektorer og 0,2 μg pEZ-1B eller pEZ-2F-reporterplasmider i 50 μl redusert serummedium i et sterilt rør.
  4. Etter 5 min inkubering ved RT blandes forsiktig det fortynnede liposomale transfeksjonsreagenset fremstilt i trinn 6.2 med de fortynnede plasmidene fremstilt i trinn 6.3. Inkuber blandingen i 20 min ved RT.
  5. Tilsett alle transfeksjonsblandingene som inneholder ekspresjonsvektorene og transfeksjonsreagenset fremstilt i trinn 6.4 til hver brønn og inkuber i minst 12 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  6. Etter 12 timer i en fuktet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2, kast mediet fra hver brønn og vask dem med 500 μl fosfatbuffert saltoppløsning (PBS) / brønn.
  7. Kast PBS og tilsett 200 μL trypsin til hver brønn. Inkuber platen i en fuktig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 5 minutter. Tilsett 1 ml mediet for å stoppe diGestion og overfør cellene til et sterilt 1,5 ml rør.
  8. Sentrifuger rørene i 3 minutter ved 5000 xg og kast mediumet. Tilsett 0,5 ml RNA-ekstraksjonsbuffer per rør for å lysere cellene ved repeterende pipettering. Inkubér de homogeniserte prøvene i 5 minutter.
  9. For hver RNA-ekstraksjonsbufferbehandlet prøve, tilsett 0,1 ml kloroform per 0,5 ml RNA-ekstraksjonsbuffer. Inverter rørene i 15 s og inkuber dem i 3 min ved RT.
  10. Sentrifuger rørene i 15 minutter ved 12.000 xg og 4 ° C. Overfør vannfasen til et friskt rør. Tilsett 0,25 ml isopropanol per 0,5 ml RNA-ekstraksjonsbuffer som ble brukt til den første homogenisering.
  11. Bland ved vortexing og inkuber dem ved romtemperatur i 10 minutter. Sentrifuger rørene ved 12.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Etter sentrifugering er RNA-utfellingen vanligvis synlig på bunnen av røret.
  12. Kast supernatanten og vask RNA-pellet med 0,5 ml 75% etanol per 0,5 ml RNA-ekstraksjonsbuffer.
  13. Vortex kraftig og sentrifuger det ved 7500 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten og tørk RNA-pelleten. Oppløs RNA i 50 ul RNase-fritt vann.
  14. Tilsett 2 mL av 5U / ul DNase I, 7 pl 10x buffer, og 11 ul H2O til hver 50 pl RNA-oppløsningen. Inkuber rørene ved 37 ° C i 1 time. Varme dem ved 70 ° C i 15 min for å inaktivere DNase.
  15. For hver prøve, tilsett av følgende komponenter til en 0,2 ml nuklease-fri rør: 1 pl av 50 pM oligo-dT, 5 ul av 400 ng / pl RNA (2 pg), 1 pl av 10 mM dNTP, og 3 ul H 2 O. Utfør revers PCR.
    1. Varm blandingen til 65 ° C i 5 minutter og inkuber den på is i minst 2 minutter for å forhindre gjendannelse av den sekundære struktur. Legg følgende komponenter til det samme røret: 4 ul 5x første-tråd buffer, 1 pl 0,1 M DTT, 1 pl av 200 U / pl revers transkriptase, og 4 pl H to </ Sub> O. Bland ved pipettering forsiktig opp og ned og inkuber ved 50 ° C i 60 min. Stopp reaksjonen ved oppvarming til 70 ° C i 15 min.
  16. For hver prøve, tilsett av følgende komponenter til en PCR-rør for å fullføre den kropps merket PCR: 2,5 ul 10 x PCR-buffer, 0,5 ul 10 mM dNTP-blanding, 1 ul 10 uM forover-primer, 1 pl av 10 pM reverse primer, 0,25 pl 5 U / pl Taq DNA polymerase, 0,5 ul 25 nM Cy5-dCTP, og 2 pl av cDNA fremstilt i trinn 6,15.
    1. Oppvarm reaksjonsblandingen til 94 ° C i 2 minutter for å denaturere molekylene, utføre 25 sykluser med PCR (94 ° C i 30 s, 60 ° C 30 s, og 72 ° C, 30 s), holder reaksjonsblandingen ved 72 ° C i 7 min, og deretter la det på et 4 ° C hold.
  17. Løs PCR-produktene ved elektroforese gjennom en 10% polyakrylamid-gel med en 1x Tris-base, Borsyre, og EDTA (TBE) buffer. Utfør et søk ved hjelp av en fluorescens skanner. MålMengden av hver spleis isoform ved hjelp av en densitometry programvare.

7. Bruk ESF til å modulere endogen Bcl-x Splicing og måle dens effekter på apoptose

  1. Plate 2 x 10 5 HeLa-celler til hver brønn i en brønn med 24 brønner. Voks cellene over natten i 500 μl DMEM tilsatt 10% FBS i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Etter 12 timer transfekterer cellene 2 μg pGL-Gly-PUF (WT) eller 0,2 μg, 1 μg og 2 μg pGL-Gly-PUF (531) (et omprogrammert PUF-domene som gjenkjenner Bcl-x pre- MRNA med høy affinitet, se figur 2A ).
  3. 24 timer senere, høst cellene. 1/3 av cellene er til RNA isolasjon og PCR analyse (trinn 6,8 - 6,17) og 2/3 er for proteinisolasjonen.
  4. For Western blot-analysen, koker de totale cellepelletsene i 2 x natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) påføringsbuffer i 10 minutter, Og deretter løse proteinene i en 12% SDS-PAGE-gel. Overfør proteinene på et nitrocellulosemembran.
  5. Blokkere membranen med 5% melk i 1 time ved RT og inkuber membranen O / N med Caspase-3 (1: 1000), PARP (1: 1000), eller beta-aktin (1: 5000) primære antistoff (fortynnet i 5% melk) ved 4 ° C.
  6. Vask membranen med PBS inneholdende 0,1% Tween 20 (PBS-T) i 5 min ved RT 3x på en gynge shaker. Inkuber membranen med HRP-bundne antistoff (1: 5000 fortynnet i 5% melk) i 1 time ved romtemperatur.
  7. Vask membranen med PBS-T 3x ved RT, og deretter utvikle membranen ved anvendelse av ECL Western-blotting påvisningsreagenser.
  8. Tilsett 250 ul av poly-L-lysin (PLL) på dekkglass, inkuber dem i 15 minutter ved RT, og sug av væsken. Vask de PLL-belagte dekkglass med PBS 3x i 5 minutter hver. For immunfluorescens-analyse som måler apoptose, frø 5 x 10 5 HeLa-celler på poly-lysin-belagte dekkglass i en 6-brønners plate. kotransfisere pGL-Gly-PUF (WT) eller pGL-Gly-PUF (531) plasmider i HeLa-cellene ved bruk av et liposomalt transfeksjonsreagens (se trinnene 6.1 - 6.5).
  9. 24 timer etter transfeksjonen, fikser cellene på dekslene med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 20 minutter ved RT. FORSIKTIG: PFA er giftig; Håndter det med forsiktighet i en avtrekksdeksel.
  10. Vask forsiktig cellene på dekslet ved å legge til 2 ml 1x PBS. Inkuber dem i 5 minutter. Fjern PBS med pipetter. Gjenta vasken 3x.
  11. Permeabiliser cellene med 0,2% Triton X-100 i 1x PBS i 10 minutter, og vask deretter 3x med 1x PBS.
  12. Blokker cellene med 3% Bovine Serum Albumin (BSA) i 1x PBS i 10 minutter og vask dem 3 ganger med 1x PBS.
  13. Fortynn FLAG-antistoffet 1: 1000 i 3% BSA / PBS og pipett 30 μl av det fortynnede FLAG-antistoffet på et parafilmark.
  14. Ta av dekselet med cellene, tørk overflødigbufferen forsiktig med labservietter, og legg den opp ned (celle-side ned) på 30 μL anti-FLAG solution. Inkuber det i 1 time ved RT.
  15. Tilsett ca. 500 mL av 1 x PBS til den side av dekkglasset inkubert med det primære antistoff til dekk flyter på toppen av oppløsningen. Returnere den til 6-brønns plate med 1 x PBS i brønnene.
  16. Vask den 3 ganger med 1 x PBS i 5 min hver.
  17. Fortynn den anti-muse-sekundært antistoff (1: 500) i 3% BSA / PBS; igjen ved å bruke 30 ul av hver dekkglass. Sett dekkglass opp-ned på det sekundære antistoff-løsning og inkuberes det i 15 minutter ved RT.
  18. Fjern dekkglass fra parafilmen som beskrevet i trinn 7,15. Sette den tilbake i 6-brønns plate og vask det med 1 x PBS 3x i 5 minutter hver.
  19. Monter glassene med monteringsmedium (med DAPI), fjerne overskudd av medium, og forsegle kanten med neglelakk.
  20. Visualisere celler ved hjelp av et fluorescens-mikroskop (ved 100X forstørrelse) og fotografere dem ved hjelp av et digitalt kamera.
    MERK: Ekspresjonen av ESF blir visualisert ved fluorescens-labeled sekundært antistoff mot FLAG tag, og den nukleære fragmentering blir visualisert ved anvendelse av DAPI farging.

8. Mål apoptose av forskjellige cancerceller som uttrykker ESF

  1. Splitte 2 x 10 6. HeLa-celler, MDA-MB-231-celler og A549-celler i 60-mm skåler med 4 ml DMEM supplert med 10% FBS i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 for å detektere apoptose med propidium jodid (PI) farging.
  2. 24 timer senere, oppdaterer medium og forberede lentivirus, som tidligere rapportert 24.
  3. Fortynn 10 x 10 6 lentivirus pWPXld-Gly-PUF (WT), pWPXld-Gly-PUF (531), eller pWPXld-GFP aksjer i 4 ml friskt medium for å gjøre forholdet mellom viruset til celle nummer lik 5.
  4. Skift medium i platene til 4 ml av den virusinneholdende medium ble fremstilt i trinn 8.3 og inkuber platene i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. 12 timer etter infeksjonen, endrer medium.
  5. Etter 24 timer infeksjon samles og flekker cellene i 5 minutter i en PBS-løsning som inneholder en sluttkonsentrasjon på 2 μg / ml PI.
  6. Analyser de PI-farvede cellene med et strømningscytometer, som beskrevet tidligere 16 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne rapporten beskriver fullstendige protokollen for design og bygging av ESFs og skjøte journalister. Den beskriver også den videre anvendelse av ESFs i manipulere AS av endogene gener 16. For å illustrere typiske resultater av ESF-mediert skjøting endringer, bruker vi data fra vår tidligere arbeid som et eksempel. De ESFs med forskjellige funksjonelle domener kan benyttes for å fremme eller hemme inkluderingen av målet kassetten ekson (figur 1 D og E). ESFs kan også påvirke bruken av alternative 5' og 3' spleiseseter i reportersystem (figur 1 F & G).

Den alternativ spleising av det endogene gen kan også være spesifikt regulert med designer ESFs. Vi har vist dette programmet ved specifically målretting Bcl-x, som kan spleises inn i to antagonistiske isoformer med alternative 5' spleisesetene. Vi har utviklet en ESF, Gly-PUF (531), som gjenkjenner en 8-nt RNA element mellom de alternative 5' spleisesetene. Dette Gly-PUF (531) spesifikt forskjøvet spleise mot produksjonen av Bcl-xS (figur 2 A). Etter transfeksjon av de Gly-PUF (531) inn i HeLa-celler, nivået av Bcl-XS isoformer og Bcl-xs-proteiner økte på en doseavhengig måte, mens kontrollen ikke ESF, Gly-PUF (WT), ikke påvirker forholdet Bcl-xS til Bcl-xL (fig 2B og C). I tillegg kan designeren ESF induserer spaltning av kaspase 3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), to kjente molekylære markører for apoptose (figur 2D). Som forventet, er designer ESFs hovedsakelig lokalisert i kjernen av transfekterte celler, som demoNstrert ved immunfluorescensmikroskopi ( Figur 2E). Konsekvent forårsaket spleiseforskyvningen av Gly-PUF (531) fragmenteringen av nukleært DNA, hvilket indikerer at disse cellene gjennomgår apoptose ( figur 2 E ). Økningen av apoptotiske celler ble ytterligere bekreftet ved å undersøke mer enn 200 celler fra tilfeldig utvalgte felt og ved å kvantifisere prosentandelen av celler med fragmentert nukleært DNA ( figur 2 F ).

Figur 1
Figur 1 : Design av ESF og deres aktivitet i modulerende Exon-hopp. ( A ) Spesifikk binding mellom PUF-domene og RNA-målene er illustrert med RNA-PUF-strukturen og et skjematisk diagram. PUF-bindings-koden for hver avFire RNA-baser, vist til høyre med forskjellige farger, brukes til å designe PUF-mutasjoner. ( B ) Flytdiagram for å skaffe et tilpasset PUF-domene. PUF som gjenkjenner "UGUAUAUA" ble brukt som et eksempel. En 4-run PCR-strategi brukes til å montere en PUF-stillas med tilpasset RNA-bindingsspecifikitet (fargekodet tilsvarende panel A). I første runde brukes en rekke PCR-primere som innlemmer de ønskede RNA-gjenkjennelseskoder for to tilstøtende PUF-gjentagelser for å generere fire fragmenter som inkluderer de åtte RNA-gjenkjenningskoder av et fullt PUF-protein (R1 / R2, R3 / R4 , R5 / R6 og R7 / R8). Cap-fragmenter som koder for et N-terminalt nukleært lokaliseringssignal, en C-terminal stoppkodon og brofragmenter, blir også produsert separat (5'-ende og 3'-ende, bro 2/3, bro 4/5 og bro 6 / 7). I andre runde genereres nye maler ved å blande overlappende fragmenter som koder for tilstøtende gjentakelser med den aktuelle broen ( f.eks. Blanding av R1 / R2,R3 / R4 og bro 2/3 genererer malen for R1-4) og deretter strekker seg med DNA-polymerase for å fylle hullene. På samme måte slutter den tredje runden R1-4, R5-8 og broen 4/5. Til slutt legger fjerde runde 5'-enden og 3'-enden på PUF-domenet sammen med kloningsstedene for etterfølgende kloning til ekspresjonsvektorer. ( C ) Modulære domene organisering av ESFs. ESF er drevet av CMV-promotorer (pil) og koder, fra N- til C-terminalen: en FLAG-epitop (for påvisning av ESFer), en funksjonsmodul (et Gly-rikt domene eller et RS-domene), en NLS (Forenkling av nukleær lokalisering av ESFer), og et RNA-gjenkjenningsdomene (et PUF-domene). Nhe I og BamH Jeg er designet for å sette inn en funksjonsmodul, mens Xba I og Sal I er utformet for å sette inn et RNA-anerkjennelsesdomene. ( D ) Gly-PUF ESFer er co-uttrykt med exon-hoppende reportere, og spleisemønsteret analyseres ved RT-PCR. Den modifiserte PUF a b spesifikt bindes til 8-mer mål A og B, henholdsvis (i de samme farger). Alle kombinasjoner er anvendt slik at PUF-målparene av forskjellig farge tjene som kontroller. Virkningene av RS-PUF på exon hopper (E), ble det konkurrerende 5' spleisesete (F), eller den konkurrerende 3' spleisesete reporter (G) analyseres ved hjelp av metoder som ligner panelet D. Data av RT-PCR er fra Wang et al. 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Regulering av endogen Bcl-x pre-mRNA-skjøting med ESFs. (A) Skjematisk av alternativ spleising av endogent BcLx pre-mRNA. To alternative 5 'spleisningssteder i exon 2 av Bcl-x brukes til å generere to isoformer av forskjellige størrelser, Bcl-xL og Bcl-xS. Sekvensen UGUGCGUG mellom de to 5'-spaltestedene er valgt som ESF-mål, og WT PUF-gjentatte 1, 3 og 5 (Q867E / Q939E / C900S / Q1011E / C1007S) omprogrammeres (asterisker) for å gjenkjenne denne målsekvens. Den resulterende ESF som inneholder et Gly-rik domene, hemmer bruken av nedstrøms 5-ss (indikert med den røde pilen). ( B ) Modulasjon av Bcl-x 5 's bruk. Ulike mengder av Gly-PUF (531) ekspresjonskonstruksjonen transfekteres i HeLa-celler. Gly-PUF (WT) brukes som en kontroll. To isoformer av Bcl-x detekteres med RT-PCR ved bruk av primere som svarer til exons 1 og 3 av Bcl-x-genet. Prosentdelen av Bcl-xS isoformen er kvantifisert og vist nederst. ( C ) ESFer påvirker ekspressionsnivåene av Bcl-xL og Bcl-xS. Prøver lastes i samme rekkefølge som i panel B, og alle proteiner erE oppdaget av Western blots. Ekspresjonen av ESFs detekteres av anti-FLAG-antistoffet, og tubulinnivået brukes som en kontroll. ( D ) Ulike mengder ESF-ekspresjonskonstruksjoner transfekteres i HeLa-celler, som resulterer i spaltning av PARP og caspase 3. Prøver påvises ved Western blot 24 timer etter transfeksjon. Actin-nivået oppdages som en kontroll. ( E ) Den subcellulære lokalisering av ESF'er i transfekterte HeLa-celler påvises ved immunofluorescensmikroskopi med anti-FLAG-antistoffet. Cellene er co-stained med DAPI for å vise kjernene. Noen kjerne, spesielt i celler transfektert med Gly-PUF (531), er fragmentert på grunn av apoptose. Skalbjelke: 5 μm. ( F ) Prosent av apoptotiske celler ( dvs. celler med fragmentert nukleært DNA) måles fra tilfeldig utvalgte felt av fluorescensmikroskopi-bilder. Barene angir gjennomsnittet, mens punktene indikerer dataene fra de to forsøkene. FigurenS er modifisert fra vår tidligere rapport av Wang et al. 16 i samsvar med politikken for Nature Publishing Group. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne rapporten gir en detaljert beskrivelse av utformingen og konstruksjonen av kunstige spleise faktorer som spesifikt kan manipulere alternativ spleising av et målgen. Denne fremgangsmåten utnytter fordelene av den unike RNA-bindende modusen for PUF gjentas for å produsere et RNA-bindende stillas med tilpassede spesifisitet. Den kan brukes til enten å aktivere eller undertrykke skjøting.

Det kritiske trinnet i denne protokollen er genereringen av den reprogramed PUF domene som definerer spesifisiteten av ESFs. Et PCR-protokoll søm har blitt utviklet og optimalisert for den hurtige dannelse av den PUF stillaset. Nøkkelen for dens suksess er å regulere forholdet mellom forskjellige overlappende maler til 1: 1: 1. Rensingen av PCR-produktene etter hver runde er også kritisk, fordi urensede produkter kan ha primer forurensning fra den siste runden. Et annet viktig trinn er å bestemme skjøteforholdet ved hjelp av semi-kvantitativ RT-PCR. Generelt, også menneskety amplifikasjonscykler bør unngås, da de kan mette PCR-reaksjonen. I våre eksperimenter med ko-ekspresjon av et spleise reporter, 20 - 25 sykler ble rutinemessig brukes, men dette kan variere avhengig av mengde av mRNA ved måling av spleising av endogene gener. Når kvantifisere skjøte isoformer ved anvendelse av et nytt par av primere, foreslår vi kalibrering av PCR-eksperimentet hver gang, som tidligere beskrevet 16.

En potensiell begrensning med designer ESFs er deres off-target effekter, fordi spesifisiteten bestemmes av antallet av gjentakelser i PUF stillaset. Villtype PUF gjenkjenner en 8-nt stedet, som kan sammenlignes med det spesielle ved en siRNA som erkjenner sitt mål gjennom "seed kamp." Men siden noen 8-nt sekvens kan skje en gang ved en tilfeldighet i en transkripsjon 65000 nt lang (4 8 = 65 536), vil det være andre off-target transkripsjoner anerkjent av designeren PUF. Den off-target effect kan reduseres ved anvendelse av pufs med flere gjentagelser; Imidlertid er det fortsatt nyttig for å evaluere spesifisiteten og off-target effekter av ESFs. For å minimalisere potensielle off-target effekter, kan ekspresjonen av en kombinasjon av flere design ESFs på et lavere nivå også utføres. I et slikt tilfelle kan off-målrettede gener ikke bli påvirket av den lave mengden av ESFs, mens spleising av det virkelige målet vil bli påvirket av de multiple ESFs som fungerer synergistisk. Denne løsningen er i likhet med det som forskere brukt i genet Slå sammen med RNAi, hvor de samlede sirnas (hver med en redusert konsentrasjon) som er rettet mot flere områder av et enkelt mRNA kan redusere off-target effekter.

Den andre hovedmetode for å manipulere AS er å bruke antisense-oligonukleotider som parer med visse områder av pre-mRNA. Sammenlignet med denne eksisterende fremgangsmåte, kan de ESFs forårsake forlengede effekter i stabilt transfekterte celler. I tillegg er det in vivo-avlevering av ESF kan dra nytte av det økende arsenet av genterapi-vektorer, mens in vivo- levering av antisense-oligonukleotider er svært vanskelig å kontrollere. I tillegg kan denne metoden unngå kompliserte og kostbare modifikasjoner av oligonukleotider. Ved å bruke forskjellige inducerbare promotorer kan også en mer presis kontroll av ESF-ekspresjonen i de riktige celletyper og på de riktige tidspunktene oppnås. Den største ulempen ved denne metoden er den relativt lave spesifisiteten (et 8-nt-gjenkjenningssete versus et 16- til 20-nt-gjenkjenningssete i typiske antisense-oligonukleotider).

Dysreguleringen av alternativ spleising forårsaker mange sykdommer, inkludert kreft 26 , 27 . Gjennomsøkende studier har avslørt mer enn 15 000 svulsterassosierte spleisvarianter i ulike typer kreft 28 , 29 , 30 . For eksempel, introniskSpleis-sted mutasjoner av tumor-suppressor gener ofte forårsake exon-hoppende hendelser og produsere avvikende proteiner som kan bidra til tumorgenesis 26 , 31 , 32 . Videre er noen spleisningsfaktorer funnet å være overuttrykt i mange kreftformer, noe som bidrar til celletransformasjon 33 , 34 , noe som indikerer at spleisningsfaktorer også kan spille viktige roller i kreftbiogenese. Derfor, i tillegg til å gi et nyttig verktøy for å modulere genfunksjonen, kan manipulering av spleising med designer ESFer gjenopprette misregulerte spleisehendelser i kreft, og dermed gi et potensielt terapeutisk verktøy. I tillegg, ved å kombinere et designer PUF-domene med forskjellige funksjonelle domener, kan flere kunstige faktorer som manipulerer ulike RNA-metabolisme prosesser utformes. For eksempel, fusjonen av en translasjonsaktivator (GLD2) eller en translasjonsrepRessor (CAF1) med PUF-domenet produserte nye faktorer som kan aktivere eller inhibere mRNA-oversettelse 27 . Ved å bruke samme designprinsipper kombinerte vi et ikke-spesifikt RNA endonuklease-domene (PIN) med en serie designer PUF-domener for å generere artificielle stedsspesifikke RNA-endonukleaser (ASREs) som fungerer analogt med DNA-restriksjonsenzymer 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend R01-CA158283 og NSFC gi 31400726 til ZWYW er finansiert av Young tusen talenter Program og Natural Science Foundation National of China (tilskudd 31471235 og 81422038). XY er finansiert av postdoktor Science Foundation of China (2015M571612).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14, (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18, (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8, (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352, (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17, (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72, (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1, (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19, (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34, (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286, (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7, (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6, (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6, (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20, (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186, (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19, (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23, (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64, (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4, (3), 4732 (2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68, (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7, (8), 1002218 (2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24, (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14, (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60, (1), 105-117 (2015).
Ingeniør Kunstige Faktorer å Spesifikt Manipulere alternativ spleising i humane celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).More

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter