Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

doi: 10.3791/54967 Published: April 26, 2017
* These authors contributed equally

Summary

يصف هذا التقرير طريقة الهندسة الحيوية لتصميم وبناء عوامل الربط الاصطناعي الجديدة (أسفس) التي تعدل على وجه التحديد الربط بين الجينات المستهدفة في خلايا الثدييات. ويمكن توسيع هذه الطريقة لمواصلة هندسة العوامل الاصطناعية المختلفة لمعالجة جوانب أخرى من عملية التمثيل الغذائي للحمض النووي الريبي.

Abstract

وتوسطت تجهيز معظم الرنا RNA حقيقية النواة من البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) مع تكوينات وحدات، بما في ذلك وحدة الاعتراف RNA، الذي يربط على وجه التحديد الهدف قبل مرنا ومجال المستجيب ملزم. سابقا، وقد استفدنا من الحمض النووي الريبي طريقة فريدة ملزم المجال PUF في Pumilio البشرية 1 لتوليد سقالة RNA ملزم للبرمجة، والتي كانت تستخدم لمهندس مختلف الممارسات التجارية التقييدية الاصطناعية للتلاعب استقلاب الحمض النووي الريبي. هنا، يوصف بروتوكول مفصلة لبناء عوامل الربط هندسة (كلية العلوم التربوية) التي تم تصميمها خصيصا لتعديل الربط البديلة من الجينات المستهدفة. ويتضمن البروتوكول كيفية تصميم وبناء سقالة PUF مخصصة لهدف معين RNA، وكيفية بناء تعبير البلازميد ESF عن طريق دمج مجال PUF مصمم ومجال المستجيب، وكيفية استخدام كلية العلوم التربوية لمعالجة الربط من الجينات المستهدفة. في نتائج تمثيلية لهذه الطريقة، التي وصفناها أيضا فحوصات مشتركةأنشطة كلية العلوم التربوية باستخدام صحفيين الربط، تطبيق ESF في الخلايا البشرية المستزرعة، وتأثير لاحق من التغييرات الربط. عن طريق اتباع بروتوكولات مفصلة في هذا التقرير، فمن الممكن لتصميم وتوليد كلية العلوم التربوية لتنظيم أنواع مختلفة من البديل الربط (AS)، وتوفير استراتيجية جديدة لدراسة تنظيم الربط وظيفة الإسوية الربط مختلفة. وعلاوة على ذلك، من خلال دمج مجالات وظيفية مختلفة مع مجال PUF تصميم، يمكن للباحثين مهندس العوامل المصطنعة التي تستهدف الرنا محددة لمعالجة مختلف مراحل معالجة RNA.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

معظم الجينات البشرية تخضع البديلة الربط (أس) لإنتاج الأشكال الإسوية متعددة مع أنشطة متميزة، مما زاد كثيرا من تعقيد الترميز من الجينوم 1 ، 2 . أس يوفر آلية رئيسية لتنظيم وظيفة الجينات، وينظم بإحكام من خلال مسارات متنوعة في مختلف مراحل الخلوية والتنموية 3 ، 4 . لأن الربط سوء التنظيم هو سبب شائع للمرض البشري 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، استهداف تنظيم الربط أصبح طريقا علاجيا جذابا.

وفقا لنموذج مبسط لتنظيم الربط، يتم التحكم أس أساسا عن طريق الربط التنظيمية سيس -Elements (سريس) في مرحلة ما قبل الرنا المرسال التي تعمل كما تعزيز الربط أو كاتمات الصوت من إكسونس البديلة. ثإيس سريس على وجه التحديد تجنيد مختلف العوامل عبر البروتين المتفاعلة ( أي عوامل الربط) التي تعزز أو قمع رد فعل الربط 3 ، 9 . معظم معاملات الربط عبر ترانزلاتينغ لها نطاقات تسلسل رنا منفصلة تسلسل محددة للاعتراف أهدافها ومجالات المستجيب للسيطرة على الربط. الأمثلة الأكثر شهرة هي أعضاء عائلة البروتين سيرين / أرجينين الغنية (سر) التي تحتوي على N- محطة رنا التعرف على الزخارف (رمز)، التي تربط تعزيز الربط إكسونيك، والمجالات C- محطة رس، التي تعزز إدراج اكسون 10 . على العكس من ذلك، يرتبط هنرنب A1 كواتم الصوت الربط إكسونيك من خلال مجالات رم ويمنع إدراج اكسون من خلال C- محطة غلايسين الغنية المجال 11 . باستخدام هذه التكوينات وحدات، يجب أن يكون الباحثون قادرين على هندسة عوامل الربط الاصطناعي من خلال الجمع بين مجال محدد رنا ملزمة (ربد) مع مختلف إفيكتور المجالات التي تنشط أو تثبط الربط.

مفتاح مثل هذا التصميم هو لاستخدام RBD التي تعترف نظرا أهداف مع خصوصية ملزمة RNA للبرمجة، والتي هي مماثلة لوضع الحمض النووي ملزم المجال حكاية. ومع ذلك، فإن معظم عوامل الربط الأم تحتوي على RRM أو K التماثل (KH) المجالات، والتي تعترف عناصر RNA قصيرة مع ضعف تقارب وبالتالي تفتقر إلى التنبؤي RNA البروتين الاعتراف "كود" (12). وRBD من البروتينات تكرار PUF (أي المجال PUF) لديه واسطة الاعتراف RNA فريدة من نوعها، والسماح لإعادة تصميم المجالات PUF الاعتراف تحديدا RNA مختلفة تستهدف 13 و 14. يحتوي المجال PUF الكنسي ثمانية تكرارات لثلاث α-اللوالب، كل الاعتراف قاعدة واحدة في RNA الهدف 8 الإقليم الشمالي. سلاسل الجانب من الأحماض الأمينية في مواقع معينة من ثاني شكل α حلزون روابط هيدروجينية معينة مع حافة واطسون كريك-رقال النووي الريبي قاعدة، والذي يحدد خصوصية ملزم RNA من كل تكرار (الشكل 1A). رمز للاعتراف قاعدة RNA من تكرار PUF بسيط من المستغرب (الشكل 1A)، والسماح لتوليد المجالات PUF التي تعترف أي مزيج 8-قاعدة ممكن (التي استعرضتها وي وانغ 15).

هذا المبدأ تصميم وحدات يسمح للجيل من المهندسة الربط عامل (ESF) التي تتكون من مجال PUF مرغوب و مجال الربط تعديل (أي مجال SR أو مجال الغليسين الغنية). ويمكن لهذه كلية العلوم التربوية تعمل إما تفعيل الربط أو مثبطات للسيطرة على أنواع مختلفة من الأحداث الربط، وأنها أثبتت مفيدة كأدوات لمعالجة الربط الجينات الذاتية المتعلقة الأمراض التي تصيب البشر 16 و 17. وكمثال على ذلك، ونحن قد شيدت PUF-الغليسين من نوع كلية العلوم التربوية لتغيير وجه التحديد الربط للبي سي إل س الجين، وتحويل إسوفورم طويلة موت الخلايا المبرمج (بكل-زل) إلى إسوفورم قصيرة الموالية المبرمج (بكل-شس). كان تحويل نسبة إيسوفورم بكل-x كافية لتوعية العديد من الخلايا السرطانية للعديد من الأدوية المضادة للسرطان العلاج الكيميائي 16 ، مما يشير إلى أن هذه العوامل الاصطناعية قد تكون مفيدة ككواشف العلاجية المحتملة.

بالإضافة إلى التحكم في الربط مع النطاقات المعروفة المستجيب الربط (على سبيل المثال، رس أو المجال غلي الغنية)، ويمكن أيضا أن تستخدم عوامل بوف المهندسة لفحص أنشطة عوامل الربط الجديدة. على سبيل المثال، باستخدام هذا النهج، أثبتنا أن المجال C- محطة من عدة بروتينات سر يمكن تفعيل أو تمنع الربط عند ربط لمختلف مناطق ما قبل مرنا 18 ، أن عزر ألانين من RBM4 يمكن أن تمنع الربط 19 ، وأن يمكن لعزر البرولين الغنية DAZAP1 تعزيز الربط 20 ، 21 </ سوب>. هذه المجالات وظيفية جديدة يمكن استخدامها لبناء أنواع إضافية من عوامل مصطنعة إلى الربط صقل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. بناء سقالة بوف مع تخصيص رنا ملزم خصوصية من خلال تداخل ير

  1. تصميم سلسلة من الاشعال ير تحتوي على تسلسل بوف التي تعترف على وجه التحديد النوكليوتيدات رنا مختلفة في كل موقف 12 (انظر الجدول 1 لتسلسل التمهيدي ورؤية الشكل 1 A ل رنا: رمز الاعتراف بوف). لكل تكرار بوف، تصميم أربعة الاشعال مختلفة للاعتراف قاعدة مختلفة على كل موقف.
    ملاحظة: سيتم استخدام هذه الاشعال في سلسلة من أربع جولات من ردود الفعل ير لتوليد شظايا بوف التي انضمت معا ( الشكل 1 B ).
  2. حدد موقع التعرف على الجينات المستهدفة بالقرب من موقع لصق بديل.
    ملاحظة: هذا الموقع يمكن أن يقرر من قبل المستخدم، وعادة ما يتم اختياره في غضون 10 - 50 نت من مواقع لصق بديلة.
  3. الجولة 1: توليد تسلسل الترميزل 4 يكرر بوف، شظايا جسر عالمية، وشظايا غطاء.
    1. استخدم الموقع المستهدف لتحديد رمز التعرف لكل تكرار من بوف المخصص. حدد مجموعة من الاشعال ير ل بوف يكرر 1 - 8. إجراء أربع جولات متتالية من ير لإنتاج مجال بوف حسب الطلب، كما هو موضح أدناه ( الشكل 1 ب ).
    2. في الجولة الأولى من ير، إعداد مخاليط تفاعل ير القياسية (التي تحتوي على 2.5 ميكرولتر من العازلة 10X، 0.5 ميكرولتر من 10 دنتبس ملي، 0.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس الاشعال، 50 نانوغرام من قالب الحمض النووي (كدنا البشري أو ناقلات التعبير من مجال وت بوف)، و 0.5 U البلمرة الحمض النووي عالية الدقة في 25 ميكرولتر الحجم النهائي).
      ملاحظة: هذه التفاعلات سوف تنتج تسلسل الحمض النووي المقابلة لكل تكرار بوف، لشظايا جسر عالمية، وشظايا كاب اثنين مع مواقع تقييد مختلفة ( الشكل 1 B ). قائمة مختصرة من القوالب، الاشعال، وتنتج ير المنتجات المستخدمة في هذه الخطوة هي مبينة في الجدول 2 .
    3. تعيين برنامج ير على النحو التالي: 5 دقائق في 95 درجة مئوية. 28 دورة من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية، و 30 ثانية عند 55 درجة مئوية، و 15 ثانية عند 72 درجة مئوية؛ و 5 دقائق من الحضانة عند 72 درجة مئوية. استخدام عالية الدقة البلمرة الحمض النووي لتقليل الطفرات نقطة خلال ير.
  4. الجولة 2: توليد متواليات ترميز R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) و R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
    1. فصل المنتجات ير التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.3 باستخدام الكهربائي مع هلام الاغاروز 1.5٪ (25 دقيقة في الجهد المستمر من 120 V). هلام تنقية جميع المنتجات من الحجم المتوقع باستخدام مجموعة تنقية هلام. استخدام خليط مختلف من هذه المنتجات كقالب في الجولات التالية من ير.
      ملاحظة: مزيج من ثلاثة منتجات ير في تقريبا 1: 1: 1 نسبة. وعادة ما لا تحتاج إلى أن تكون كمية، طالما شدة كل منتج تبدو مشابهة في هلام.
    2. مزيج حوالي 5٪ من المنتجات ير المنقى باعتباره تيملوحة في الجولة القادمة من PCR. بدلا من ذلك، تحديد المنتجات PCR النقاء باستخدام مطياف أشعة فوق البنفسجية فيس واستخدام 15 نانوغرام لكل منتج PCR في خليط قالب.
    3. استخدام المنتجات PCR النقاء R1 / R2، R3 / R4، وجسر 2/3 القوالب مختلطة كما وR1-F وR4-R كما الاشعال. إعداد رد فعل PCR كما هو موضح في الخطوة 1.3 للحصول تداخل المنتج PCR R1 - 4.
    4. استخدام المنتجات PCR النقاء R5 / R6، R7 / R8، وجسر 6-7 كقوالب المختلطة وR5-F وR8-R كما الاشعال للحصول تداخل PCR المنتج R5-8 (الشكل 1 B). ضبط البرنامج PCR على النحو التالي: 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية؛ 28 دورات من 30 ثانية في 95 ° C، 30 ثانية في 55 ° C، و30 ثانية في 72 ° C. و5 دقائق عند 72 درجة مئوية. هلام تنقية R1-4 R5-8 و.
  5. الجولة 3: إنشاء الترميز متواليات لR1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 بدون أغطية).
    1. في الجولة الثالثة من PCR، وذلك باستخدام R1-4 تنقيته، R5-8، وجسر 4/5 القوالب مختلطة كما وR1-F وR8-R كما الاشعال، إعداد رد فعل PCR كما هو موضح في الخطوة 1.3 للحصول تداخل PCR المنتج R1-8 دون مباراة دولية.
    2. ضبط البرنامج PCR على النحو التالي: 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية؛ 28 دورات من 30 ثانية في 95 ° C، 30 ثانية في 55 درجة مئوية، و 55 ق في 72 ° C. و5 دقائق عند 72 درجة مئوية. هلام تنقية R1-8 دون مباراة دولية.
  6. الجولة 4: إنشاء الترميز متواليات لنطاقات PUF كاملة.
    1. في الجولة الأخيرة من PCR، وذلك باستخدام R1-8 تنقيته من دون القبعات و5'نهاية و3'نهاية مباراة دولية كقوالب مختلطة وكاب-F وكاب-R كما الاشعال، إعداد رد فعل PCR كما هو موضح في الخطوة 1.3 للحصول على المجالات PUF تحور النهائية.
    2. ضبط البرنامج PCR على النحو التالي: 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية؛ 28 دورات من 30 ثانية في 95 ° C، 30 ثانية في 55 ° C، و 1 دقيقة في 72 ° C. و5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
    3. هلام تنقية المنتجات PCR من المجالات PUF برمجتها النهائية. استخدام هذه المنتجات لبناء البلازميد التعبير كلية العلوم التربوية في الخطوات اللاحقة. Sequسينعقد التركيبة النهائية للتحقق من تسلسل برمجتها من المجالات PUF.
      ملاحظة: كاب-F يشفر NLS (PPKKKRKV) بين BamH أنا والمواقع Xba I وكاب-R يشفر كودون وقف وموقع سال I (صممت تقييد مواقع لبناء ناقلات التعبير من كلية العلوم التربوية، الشكل 1 C).

2. بناء وحدة وظيفية من كلية العلوم التربوية

  1. يتم استخدام استراتيجيتين عادة لاستنساخ وحدات وظيفية من كلية العلوم التربوية (المجالات RS أو المجالات الغليسين الغنية): لتضخيم هذه المجالات عن طريق PCR باستخدام الكلي [كدنا البشري كنموذج (الخطوة 2.2) أو لتجميع مباشرة شظايا الحمض النووي الذي رمز لمختلف RS أو المجالات الغليسين الغنية (الخطوة 2.3).
  2. استخدام PCR لاستنساخ RS المجالات من بقايا 123-238 من 9G8 (NP001026854)، وبقايا 180-272 من SRP40 (NP008856)، أو بقايا 117-221 من SC35 (NP003007). استنساخ المجالات الغليسين الغنية من بقايا 195-320 من hnRNP A1 (NP_002127)، بقاياالصورة 203-353 من hnRNP A2 (NP112533)، أو بقايا 211-378 من hnRNP A3 (NP919223).
    1. استخدام NCBI التمهيدي أداة تصميم (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) أو Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) لتصميم الاشعال ل استنساخ RS المجالات أو المجالات الغليسين الغنية (وحدة وظيفية من كلية العلوم التربوية).
      ملاحظة: التمهيدي إلى الأمام يحتوي على FLAG العلامة-N المحطة الطرفية بعد الموقع NHE I. يحتوي التمهيدي العكسي موقع BamH I للاستنساخ في ناقلات التعبير (الشكل 1 C).
    2. إعداد رد فعل PCR القياسية، كما هو موضح في الخطوة 1.3، لتضخيم RS أو المجالات الغليسين الغنية. ضبط البرنامج PCR على النحو التالي: 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية؛ 28 دورات من 30 ثانية في 95 ° C، 30 ثانية في 55 ° C، و30 ثانية في 72 ° C. و5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
  3. المجالات أو المجالات الغليسين الغنية من خلال تخليق DNA المباشر RS استنساخ. بدلا من توليد منتجات PCR التي تكود للمجالات المستجيب في الخطوة 2.2، سينتحجم والنوكليوتيد الذي يشفر مجال القصير جزء RS (RSRSRSRSRSRS) أو مجال الغليسين الغنية (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) باستخدام مصدر تجاري من أليغنوكليوتيد DNA.

3. البناء من البلازميدات ESF التعبير

  1. بناء البلازميدات التعبير كلية العلوم التربوية باستخدام أي ناقلات التعبير.
    ملاحظة: تعبير بناء PGL-الغليسين-MS2 (هدية من الدكتور R. Breathnach من 11 معهد دي البيولوجيا-CHR) كان يستخدم في الأصل، الذي يشفر من N- إلى C-المحطة، حاتمة FLAG، والغليسين نطاق الغنية من hnRNP A1، والبروتين معطف MS2. لذلك، يتم استخدام هذا التعبير بناء كمثال في الخطوة التالية.
    ملاحظة: يمكن أيضا ناقلات التعبير الأخرى مع مواقع الاستنساخ متعددة يمكن استخدامها، وسيتم تطبيق خطوات الاستنساخ القياسية للانضمام إلى شظايا معا.
  2. هضم 1.5 ميكروغرام من البلازميدات التعبير (PGL-الغليسين-MS2) المذكورة في الخطوة 3.1 لإزالة MS2 البروتين معطف شظية. استخدام restricنشوئها نوكلياز داخلي BamH الأول وسال I لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. هضم حدة الاعتراف كلية العلوم التربوية (ترميز لNLS وبرمجتها المجالات PUF، ولدت في الخطوة 1.5) مع BamH الأول وسال أنا في حالة نفسه.
  3. إضافة 5X صبغ تحميل لتقييد هضم ردود الفعل وelectrophorese ببطء الحجم الكلي مع هلام الاغاروز 1.5٪ تحتوي على هلام وصمة عار DNA لمدة 40 دقيقة في 120 V. جل تنقية المنتجات هضمها.
  4. إعداد 10 ميكرولتر ردود الفعل ربط مع وحدة الاعتراف النقاء من إدراج كلية العلوم التربوية وDNA ناقلات التعبير في نسبة 3: 1، 1 ميكرولتر من يغاز DNA، و 1 ميكرولتر من العازلة 10X ربط. احتضان ردود الفعل ربط بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. التركيبة الناتجة يعبر عن الغليسين، PUF من نوع ESF (PGL-الغليسين، PUF) تحت سيطرة المروج CMV (الشكل 1 C).
  5. إزالة جزء ترميز FLAG / نطاق الغليسين الغنية مع NHE الأول وBamH I الهضم لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية. استبدالها مع جزء الذي يشفر مجال رس (ولدت في الخطوة 2.2، هضمها أيضا من قبل نهي I و بامه I). ويعبر عن بناء الناتجة رس-بوف ​​من نوع إسف ( الشكل 1 C ).

4. بناء مراسل الربط

  1. تجميع أوليغونوكلأوتيدس تحتوي على تسلسل المرشح ( أي تسلسل الهدف من المجالات بوف) يحيط بها مواقع شو I و أبا I أو مواقع شو I و إكور I. أنيل أوليغونوكلأوتيدس لمدة 5 دقائق في 55 درجة مئوية للحصول على إدراج مزدوج تقطعت بهم السبل التي تحتوي على مواقع الاعتراف من المجالات بوف يحيط بها نهايات متماسكة من شهو I و أبا I أو شو I و إكور I المواقع.
  2. بدء من وصفها مسبقا مراسل الربط وحدات 22 ، pGZ3، الذي يحتوي على اثنين من إكسونات غفب مفصولة اختبار إكسون (اكسون 12 من IGF2BP1 الإنسان، إنزمبل إد ENSG00000159217) و إنترونس المرافقة لها.
    ملاحظة: تم تصميم إكسون اختبار مع شو I و أبا I المواقع، والتي يمكن استخدامها لإدراج أوليغونوكليوتيدس توليفها تحتوي على تسلسل المرشح (تسلسل الهدف من المجالات بوف). يتم توفير هذا المراسل الربط وحدات (pGZ3) من خلال مستودع إضافة البلازميد.
  3. هضم pGZ3 مراسل قاعدة (أعدت في الخطوة 4.2) مع شو الأول وأبا I إندونوكليسيس تقييد لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  4. جل تنقية المنتجات هضمها كما هو موضح في الخطوة 3.3.
  5. إعداد 10 ميكرولتر من ردود الفعل ربط مع إدراجات مزدوجة تقطعت بهم السبل ولدت في الخطوة 4.1 وناقلات pGZ3 هضمها ولدت في الخطوة 4.4 في نسبة مولر 3: 1، 1 ميكرولتر من ليغاز الحمض النووي، و 1 ميكرولتر من العازلة ربط 10X. احتضان ردود الفعل ربط بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية للحصول على بناء الربط مراسل ناقلات pGZ3.
  6. إدراج إدراج مزدوج تقطعت بهم السبل ولدت في الخطوة 4.1 في السابقبيز-1B (باستخدام شو I و إكور I المواقع) و بيز-2F (باستخدام شهو I و أبا I مواقع) 23 ، للحصول على 5 'مراسل سس المتنافسة و 3' مراسل سس المنافسة، كما هو موضح في الخطوات 4.3-4.5.
    ملاحظة: كلا النوعين من صحفيين الربط سيكون متاحا من خلال إضافة الجينات.

5. بناء ناقلات التعبير لنتيفيرال ل إسف

  1. إعداد رد فعل ير القياسية كما هو موضح في الخطوة 1.3 لتضخيم إسفس كامل طول من ناقلات التعبير الأصلي (بغل-غلي-بوف أو بغل-رس-بوف) مع الاشعال التي تحتوي على مواقع I / سبو ملو . تعيين برنامج ير على النحو التالي: 5 دقائق في 95 درجة مئوية. 28 دورة من 30 ثانية في 95 درجة مئوية، 30 ثانية عند 55 درجة مئوية، و 1.5 دقيقة عند 72 درجة مئوية. و 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
  2. من خلال رد فعل الهضم، وتنقية هلام، وربط رد فعل، ودمج إسفس في ناقلات التعبير لنتيفيرال، بوبسد، بين مولو
  3. استخدام طريقة الهطول الفوسفات الكالسيوم القياسية، كما ذكرت سابقا 24 ، لتوليد لنتيفيروسيس بواسطة كوترانزفكتينغ خلايا HEK293T عن طريق تعبئة ناقلات، psPAX2 و pMD2.G، مع إما بوكسلد-غلي-بوف (بكل-X)، بوبلكسد-غلي-بوف بالوزن) (كسيطرة خصوصية)، أو بوبلكسد-غفب (وهمية).
    1. البذور 5x10 6 خلايا HEK293T في 10 سم الأطباق وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 10 مل من دولبيكو في النسر المعدل دولمكو تكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) لكل طبق في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 . أداء ترنسفكأيشن عندما تكون الخلايا 70-90٪ متموجة.
    2. إعداد خليط البلازميد عن طريق إضافة البلازميدات الثلاثة (7.5 ميكروغرام من ناقلات التعبئة والتغليف، PSPAX2؛ 2.5 ميكروغرام من pMD2.G؛ و 10 ميكروغرام من بوكسلد-غلي-بوف (بكل-x)، بوبلكسد-غلي-بوف (بالوزن) ، أو بوبلكسد-غفب) إلى أنبوب 2 مل.
    3. إضافة 560 ميكرولتر من 0.25 M كاكل2 و 560 ميكرولتر من 2X بس الحل إلى أنبوب 2 مل. مزيج بلطف عدة مرات واحتضان لمدة 15 دقيقة في رت لإعداد خليط ترنسفكأيشن.
    4. إضافة جميع مخاليط ترنسفكأيشن إلى الأطباق 10 سم. دوامة الأطباق بلطف واحتضان لهم بين عشية وضحاها في 3٪ كو 2 و 37 درجة مئوية.
    5. إزالة المتوسطة، إضافة 10 مل من دمم جديدة مع 2٪ فبس إلى كل طبق، واحتضان لهم في 10٪ كو 2 و 37 ° كو / N.
    6. جمع طاف الأول من الأطباق. إضافة 10 مل من دمم الطازجة مع 2٪ فبس إلى كل طبق. احتضان الأطباق O / N عند 10٪ كو 2 و 37 درجة مئوية. تخزين طاف في 4 درجات مئوية.
    7. جمع طاف الثاني من الأطباق. بركة طاف من الحصاد الأول والثاني. مسح طاف من الحطام الخلية عن طريق تصفية من خلال مرشح 0.4 ميكرون. استخدام طاف مسح مباشرة أو تخزينه في -80 درجة مئوية.
  4. تحديد عيار الفيروس العدسي عن طريق إصابة HEK2خلايا 93T مع التخفيفات المسلسل لإعداد الفيروس، كما ذكرت سابقا 25 .

6. على وجه التحديد تحوير إدراج اكسون والاستخدام البديل لمواقع لصق مع إسفس

  1. البذور 2 X10 5 خلايا HEK293T في كل بئر من لوحة 24 جيدا. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 500 ميكرولتر من دمم تستكمل مع 10٪ فبس في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
  2. مزيج كاشف ترنسفكأيشن الليبوسومات عن طريق قلب بلطف الزجاجات قبل الاستخدام. تمييع 2 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن الليبوسومات في 50 ميكرولتر من انخفاض مصل الدم. مزيج بلطف واحتضان لهم لمدة 5 دقائق في رت.
  3. تمييع 0.04 ميكروغرام من ناقلات التعبير بغل-غلي-بوف و 0.2 ميكروغرام من البلازميدات pGZ3 مراسل في 50 ميكرولتر من انخفاض مصل الدم في أنبوب معقمة. تمييع 0.4 ميكروغرام من ناقلات التعبير بغل-رس-بوف ​​و 0.2 ميكروغرام من البلازميدات مراسل PGZ3 في 50 ميكرولتر من انخفاض مصل الدم في أنبوب معقمة. دإيليوت 0.4 ميكروغرام من ناقلات التعبير بل-رس-بوف ​​و 0.2 ميكروغرام من بيز-1B أو بيز-2F مراسل البلازميدات في 50 ميكرولتر من انخفاض مصل الدم في أنبوب معقمة.
  4. بعد 5 دقائق من الحضانة في رت، خلط بلطف كاشف ترنسفكأيشن الليبوسوماتي المخفف أعدت في الخطوة 6.2 مع البلازميدات المخففة أعدت في الخطوة 6.3. احتضان الخليط لمدة 20 دقيقة في رت.
  5. إضافة خليط ترنسفكأيشن كامل يحتوي على ناقلات التعبير وكاشف ترنسفكأيشن أعدت في الخطوة 6.4 إلى كل بئر واحتضان لمدة 12 ساعة على الأقل في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
  6. بعد 12 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 ، تجاهل المتوسطة من كل بئر وغسلها مع 500 ميكرولتر من محلول ملحي الفوسفات مخزنة (بس) / جيدا.
  7. تجاهل برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من التربسين إلى كل بئر. احتضان لوحة في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة 5 دقائق. إضافة 1 مل من وسيلة لوقف ديGESTION ونقل الخلايا إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب.
  8. أنابيب الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 5000 x ج وتجاهل المتوسطة. إضافة 0.5 مل من الحمض النووي الريبي استخراج العازلة في أنبوب لليز الخلايا قبل pipetting المتكررة. احتضان عينات متجانسة لمدة 5 دقائق.
  9. لكل استخراج الحمض النووي الريبي عينة المعالجة العازلة، إضافة 0.1 مل من الكلوروفورم في 0.5 مل من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي. عكس الأنابيب لمدة 15 ق واحتضان لهم لمدة 3 دقائق على RT.
  10. أنابيب الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج و 4 ° C. نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد. إضافة 0.25 مل من الأيزوبروبانول في 0.5 مل من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي المستخدمة في التجانس الأولي.
  11. مزيج من قبل vortexing واحتضان لهم في RT لمدة 10 دقيقة. أنابيب الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي، ويعجل RNA عادة ما يكون وضوحا في الجزء السفلي من الأنبوب.
  12. تجاهل طاف ويغسل بيليه RNA مع 0.5 مل من الايثانول 75٪ في 0.5 مل من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي.
  13. دوامة بقوة وأجهزة الطرد المركزي أنه في 7500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف وتجفيف بيليه RNA. حل RNA في 50 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه.
  14. إضافة 2 ميكرولتر من 5U / ميكرولتر الدناز I، 7 ميكرولتر من 10X العازلة، و 11 ميكرولتر من H 2 O إلى كل حل 50 ميكرولتر RNA. احتضان الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تسخينها عند 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لإبطال نشاط الدناز.
  15. لكل عينة، إضافة العناصر التالية إلى nuclease خالية من أنبوب 0.2 مل: 1 ميكرولتر من 50 ميكرومتر بنسبة ضئيلة DT، 5 ميكرولتر من 400 نانوغرام / ميكرولتر RNA (2 ميكروغرام)، 1 ميكرولتر من 10 ملي dNTP، و 3 ميكرولتر من H 2 O. نفذ PCR عكسي.
    1. حرارة الخليط إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق واحتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة على الأقل لمنع إعادة تشكيل هيكل الثانوي. إضافة المكونات التالية لنفس أنبوب: 4 ميكرولتر من 5X العازلة حبلا الأول، 1 ميكرولتر من 0.1 M DTT، 1 ميكرولتر من 200 U / ميكرولتر عكس الناسخ، و 4 ميكرولتر من H 2 </ سوب> O. مزيج بواسطة بيبتينغ بلطف صعودا وهبوطا واحتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. وقف رد فعل عن طريق تسخينه في 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  16. لكل عينة، إضافة المكونات التالية إلى أنبوب ير من أجل استكمال ير المسمى الجسم: 2.5 ميكرولتر من العازلة ير 10X، 0.5 ميكرولتر من 10 ملي مزيج دنتب، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 1 ميكرولتر من 10 ميكرومتر عكس التمهيدي، 0.25 ميكرولتر من 5 U / ميكرولتر تاق دنا البلمرة، 0.5 ميكرولتر من 25 نانومتر Cy5-دكتب، و 2 ميكرولتر من [كدنا] أعدت في الخطوة 6.15.
    1. تسخين التفاعل إلى 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة لتفكك الجزيئات، وأداء 25 دورات من ير (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية 30 ثانية، و 72 درجة مئوية 30 ثانية)، والحفاظ على رد فعل عند 72 درجة مئوية ل 7 دقائق، ثم ترك الأمر في عقد 4 درجات مئوية.
  17. حل المنتجات ير عن طريق الكهربائي من خلال هلام بولي أكريلاميد 10٪ مع قاعدة تريس 1X، حمض بوريك، و إدتا (تب) العازلة. إجراء المسح الضوئي باستخدام الماسح الضوئي مضان. قياسقيمة كل شكل الإسوي الربط باستخدام البرمجيات كثافة.

7. استخدام ESF لتعديل الذاتية بي سي إل س الربط وقياس أثرها على موت الخلايا المبرمج

  1. لوحة 2 × 10 5 خلايا هيلا إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 500 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
  2. بعد 12 ساعة، transfect الخلايا مع 2 ميكروغرام من PGL-الغليسين، PUF (WT) أو 0.2 ميكروغرام، 1 ميكروغرام، و 2 ميكروغرام من PGL-الغليسين، PUF (531) (مجال PUF برمجتها يعترف بي سي إل س ما قبل مرنا مع قابلية عالية، انظر الشكل 2 A).
  3. بعد 24 ساعة، وحصاد الخلايا. 1/3 من الخلايا هي لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل PCR (الخطوات 6،8 حتي 6،17) و03/02 هي لعزل بروتين.
  4. لتحليل لطخة غربية، وتغلي مجموع الكريات خلية في 2X الصوديوم دوديسيل كبريتات-إس دي إس بايج (SDS-PAGE) العازلة تحميل لمدة 10 دقيقة، ومن ثم حل البروتينات في هلام سدز-بادج 12٪. نقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز.
  5. منع الغشاء مع الحليب 5٪ لمدة 1 ساعة في رت واحتضان غشاء O / N مع كاسباس -3 (1: 1،000)، بارب (1: 1،000)، أو بيتا أكتين (1: 5،000) الأجسام المضادة الأولية (المخفف في 5٪ حليب) عند 4 درجات مئوية.
  6. غسل الغشاء مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ توين 20 (بس-T) لمدة 5 دقائق في رت 3X على شاكر هزاز. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة المرتبطة هرب (1: 5،000، المخفف في الحليب 5٪) لمدة 1 ساعة في رت.
  7. غسل الغشاء مع بس-T 3X في رت، ومن ثم تطوير الغشاء باستخدام إكل الغربية الكواشف الكشف النشاف.
  8. إضافة 250 ميكرولتر من بولي L- يسين (بل) على كوفرسليبس، واحتضان لهم لمدة 15 دقيقة في رت، وسيفون قبالة السائل. غسل الزجاج المغلفة بل كوفرسليبس مع برنامج تلفزيوني 3X لمدة 5 دقائق لكل منهما. لقياس المناعي قياس موت الخلايا المبرمج، البذور 5 × 10 5 خلايا هيلا على كوفرسليبس بولي يسين المغلفة الزجاج في لوحة 6 جيدا. ترانسفيكت pغل-غلي-بوف (وت) أو بل-غلي-بوف (531) البلازميدات في الخلايا هيلا باستخدام كاشف ترنسفكأيشن الليبوسومات (انظر الخطوات 6،1-6،5).
  9. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، إصلاح الخلايا على كوفرسليبس مع 1 مل من بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 20 دقيقة في رت. تنبيه: بفا هو سامة. التعامل معها بعناية في غطاء الدخان.
  10. غسل بلطف الخلايا على كوفرسليبس عن طريق إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X. احتضان لهم لمدة 5 دقائق. إزالة بس مع ماصات. كرر غسل 3X.
  11. بيرمابيليز الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة، ومن ثم غسلها 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
  12. منع الخلايا مع 3٪ البقري المصل ألبومين (بسا) في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 10 دقيقة وغسلها 3X مع برنامج تلفزيوني 1X.
  13. تمييع الأجسام المضادة فلاج 1: 1000 في 3٪ بسا / برنامج تلفزيوني وماصة 30 ميكرولتر من الجسم المضاد فلاج المخفف على ورقة بارافيلم.
  14. إخراج ساترة مع الخلايا، وتجفيف بعناية العازلة الزائدة مع مناديل مختبر، ووضعه رأسا على عقب (جانب الخلية إلى أسفل) على 30 ميكرولتر المضادة فلاج قالحل. احتضان لمدة 1 ساعة في رت.
  15. إضافة حوالي 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X إلى جانب ساترة حضنت مع الأجسام المضادة الأولية حتى يطفو ساترة على رأس الحل. إعادته إلى لوحة 6-جيدا مع برنامج تلفزيوني 1X في الآبار.
  16. غسله 3X مع برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  17. تمييع الأجسام المضادة الثانوية لمكافحة الماوس (1: 500) في 3٪ بسا / برنامج تلفزيوني. مرة أخرى، واستخدام 30 ميكرولتر لكل ساترة. وضع ساترة رأسا على عقب على حل الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة 15 دقيقة في رت.
  18. إزالة ساترة من بارافيلم، كما هو موضح في الخطوة 7.15. وضعه مرة أخرى في لوحة 6-جيدا وغسله مع 1X بس 3X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  19. جبل كوفرسليبس مع تصاعد المتوسطة (مع دابي)، إزالة المتوسطة الزائدة، وختم حافة مع طلاء الأظافر.
  20. تصور الخلايا باستخدام المجهر مضان (في التكبير 100X) وتصويرها باستخدام كاميرا رقمية.
    ملاحظة: يتم التعبير عن التعبير إسف من قبل مضان-لابيلوتصور الأجسام المضادة الثانوية د ضد العلامة FLAG، وتفتيت النووي باستخدام تلوين دابي.

8. قياس موت الخلايا المبرمج للخلايا سرطان مختلفة التعبير عن كلية العلوم التربوية

  1. تقسيم 2 × 10 6 خلايا هيلا، MDA-MB-231 الخلايا، والخلايا A549 في أطباق من عيار 60 ملم مع 4 مل من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للكشف عن موت الخلايا المبرمج مع Propidium يوديد (PI) تلطيخ.
  2. بعد 24 ساعة، وتحديث المتوسطة وإعداد الفيروسة البطيئة، كما ذكرت سابقا 24.
  3. تمييع pWPXld-الغليسين، PUF (WT)، pWPXld-الغليسين، PUF (531)، أو pWPXld-GFP أسهم 10 × 10 6 الفيروسة البطيئة إلى 4 مل من متوسطة جديدة لجعل نسبة الفيروس في عدد الخلايا يساوي 5.
  4. تغيير المتوسطة في لوحات ل4 مل من متوسطة تحتوي على فيروس أعدت في الخطوة 8.3 واحتضان لوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪. 12 ساعة بعد الإصابة، وتغيير المتوسطة.
  5. بعد 24 ساعة من العدوى، وجمع وصمة عار على الخلايا لمدة 5 دقائق في محلول PBS التي تحتوي على تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل PI.
  6. تحليل الخلايا ملطخة PI مع تدفق عداد الكريات، كما هو موضح سابقا (16).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

یصف ھذا التقریر البروتوکول الکامل لتصمیم وبناء الأطر البیئیة والاجتماعیة (إسف) ومراسلي الربط. ويحدد أيضا المزيد من تطبيق إسفس في التلاعب أس من الجينات الذاتية 16 . لتوضيح النتائج النموذجية للتغيرات الربط بوساطة إسف، نستخدم البيانات من عملنا السابق كمثال. ویمکن استخدام الأطر البیئیة البیئیة (إسف) ذات المجالات الوظیفیة المختلفة لتعزیز أو تمکین إدراج إكسون الکاسیت المستھدف ( الشکل 1 D & E ). إسفس يمكن أن تؤثر أيضا على استخدام بديل 5 'و 3' مواقع لصق في نظام المراسل ( الشكل 1 F & G ).

ويمكن أيضا أن ينظم الربط البديل للجينات الذاتية على وجه التحديد مع المصممات إسف المصممة. لقد أثبتنا هذا التطبيق حسب المواصفاتاستهدفت بشكل فعلي بكل-x، والتي يمكن أن تقسم إلى اثنين من الأشكال الإسوية العدائية مع بديل 5 'مواقع لصق. قمنا بتصميم إسف، غلي-بوف (531)، التي تعترف عنصر رنا 8 نت بين مواقع لصق 5 'بديل. هذا غلي-بوف (531) على وجه التحديد تحولت الربط نحو إنتاج بكل-شس ( الشكل 2 A ). بعد ترانسفكتينغ غلي-بوف (531) في خلايا هيلا، ارتفع مستوى إيسوفورمز بكل-شس والبروتينات بكل-شس بطريقة تعتمد على الجرعة، في حين أن إسف السيطرة، غلي-بوف (وت)، لم يؤثر على نسبة من بكل-شس إلى بكل-زل ( الشكل 2 B & C ). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمصمم إسف تحفز انشقاق كاسباس 3 وبولي (ADP- الريبوز) البلمرة (بارب)، وهما علامات الجزيئية المعروفة من موت الخلايا المبرمج ( الشكل 2 D ). كما هو متوقع، المصممة إسفس في الغالب محلية في نوى الخلايا ترانزفكتد، كما التجريبيnstrated بواسطة المجهر المناعي (الشكل 2 E). باستمرار، والتحول الربط عن طريق الغليسين، PUF (531) تسبب في تفتيت DNA النووي، مشيرا إلى أن هذه الخلايا تشهد موت الخلايا المبرمج (الشكل 2 E). وأكد زيادة الخلايا أفكارك أبعد من خلال دراسة أكثر من 200 خلية من حقول تم اختيارها عشوائيا وعن طريق قياس النسبة المئوية للخلايا مع DNA النووي مجزأة (الشكل 2 F).

شكل 1
الشكل 1: تصميم كلية العلوم التربوية ونشاطها في تحوير اكسون الطفر. ويتضح (A) محددة ملزمة بين الأهداف نطاق وRNA PUF مع هيكل RNA PUF والرسم التخطيطي. رمز ملزمة PUF لكل منوتستخدم أربع قواعد الحمض النووي الريبي، التي تظهر على الحق مع ألوان مختلفة، لتصميم الطفرات بوف. ( B ) مخطط تدفق للحصول على نطاق بوف مخصصة. وقد تم استخدام صندوق بوف الذي يعترف ب "أوغووا" كمثال على ذلك. يتم استخدام استراتيجية ير 4-جولة لتجميع سقالة بوف مع تخصيص مخصصة رنا ملزم (لون مشفرة على غرار لوحة A). في الجولة الأولى، يتم استخدام سلسلة من الاشعال ير التي تتضمن رموز الاعتراف الحمض النووي الريبي المطلوب لتكرار بوف المتجاورة لتوليد أربعة شظايا التي تشمل رموز الاعتراف الحمض النووي الريبي ثمانية من البروتين بوف الكامل (R1 / R2، R3 / R4 ، R5 / R6، و R7 / R8). وتنتج أيضا شظايا الكابينة التي ترمز إشارة توطين نووية من طرف N، و كودون محطة C-ترمينال، و شظايا الجسر بشكل منفصل (5 '' و '3' نهاية كاب، الجسر 2/3، الجسر 4/5، والجسر 6 / 7). في الجولة الثانية، يتم إنشاء قوالب جديدة عن طريق مزج شظايا متداخلة ترميز تكرارات المجاورة مع الجسر المناسب (على سبيل المثال، خلط R1 / R2،R3 / R4، وجسر 2/3 يولد قالب R1 - 4) ثم تمتد مع البلمرة DNA لملء الثغرات. وبالمثل، فإن الجولة الثالثة تنضم R1-4، R5-8، وجسر 4/5. وأخيرا، فإن الجولة الرابعة يضيف 5'نهاية و3'نهاية مباراة دولية في المجال PUF جنبا إلى جنب مع المواقع استنساخ للاستنساخ لاحق لناقلات التعبير. (C) منظمة نطاق وحدات من كلية العلوم التربوية. هي التي تحرك كلية العلوم التربوية من قبل المروجين CMV (السهم) وترميز، من N- إلى C-محطة: حاتمة FLAG (للكشف عن كلية العلوم التربوية)، وحدة وظيفية (مجال الغليسين الغنية أو مجال RS)، وNLS (تسهيل توطين النووية من كلية العلوم التربوية)، ومجال التعرف على RNA (مجال PUF). NHE الأول وBamH مصممة I لادخال وحدة وظيفية، في حين Xba الأول وسال مصممة I لادخال مجال التعرف على الحمض النووي الريبي. (D) الغليسين، PUF كلية العلوم التربوية وشارك في وأعرب مع اكسون تخطي للصحفيين، ويعاير نمط الربط بواسطة RT-PCR. لتعديل PUF ل E )، موقع التصحيح 5 'التنافسي ( F )، أو مراسل موقع لصق 3' المنافسة ( G ) بطرق مماثلة لللوحة D. بيانات رت-ير هم من وانغ وآخرون. 16 - الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2 : تنظيم الذاتية بكل-x قبل مرنا الربط مع إسفس. ( A ) تخطيطي من الربط البديل من بك الذاتيةLX قبل مرنا. وتستخدم اثنين البديل الموقع 5 'لصق في اكسون 2 من بي سي إل س لتوليد نمطين من الأشكال الإسوية من مختلف الأحجام، بي سي-XL وبي سي-XS. يتم تحديد UGUGCGUG تسلسل بين الموقعين 5 "لصق كهدف كلية العلوم التربوية، وWT PUF يكرر 1 و 3 و 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) وبرمجتها (النجمة) الاعتراف هذا التسلسل المستهدف. صندوق دعم الاقتصاد الناتجة تحتوي على نطاق الغليسين الغنية يمنع استخدام المصب "SS 5 (المشار إليها السهم الأحمر). (B) تعديل من بي سي إل × 5 "استخدام قوات الأمن الخاصة. و transfected كميات مختلفة من الغليسين، PUF (531) بناء التعبير إلى خلايا هيلا. الغليسين، PUF (WT) يستخدم كعنصر تحكم. تم الكشف عن اثنين من الأشكال الإسوية من بي سي-X مع RT-PCR باستخدام بادئات الموافق الإكسونات 1 و 3 من هذا الجين بي سي إل س. وكميا نسبة شكل الإسوي بي سي-XS وأظهرت في القاع. (C) كلية العلوم التربوية تؤثر على مستويات التعبير عن بي سي-XL وبي سي-XS. يتم تحميل العينات في نفس الترتيب كما في لوحة B، وجميع البروتينات ARe الكشف عنها من قبل البقع الغربية. يتم الكشف عن التعبير عن إسف من قبل الأجسام المضادة المضادة فلاج، ومستوى توبولين يستخدم كعنصر تحكم. ( D ) يتم ترانزفكتد كميات مختلفة من يبني التعبير إسف في خلايا هيلا، مما أدى إلى انشقاق بارب و كاسباس 3. تم الكشف عن عينات من قبل لطخة غربية 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. تم الكشف عن مستوى أكتين كعنصر تحكم. ( E ) تم الكشف عن توطين تحت الخلايا الجذعية إسف في الخلايا هيلا ترانزفكتد بواسطة المجهر المناعي مع الأجسام المضادة المضادة فلاج. الخلايا هي ملطخة مشتركة مع دابي لإظهار النوى. بعض النوى، وخاصة في الخلايا ترانزفكتد مع غلي-بوف (531)، هي مجزأة بسبب موت الخلايا المبرمج. شريط مقياس: 5 ميكرون. ( F ) يتم قياس نسبة الخلايا المبرمج ( أي الخلايا مع الحمض النووي النووي مجزأة) من المجالات التي تم اختيارها عشوائيا من الصور المجهري مضان. تشير الأشرطة إلى المتوسط، في حين تشير النقاط إلى البيانات من تجربتين. هذا الرقميتم تعديل الصورة من تقريرنا السابق وانغ وآخرون. 16 وفقا لسياسة المجموعة الطبيعة النشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يقدم هذا التقرير وصفا تفصيليا لتصميم وبناء عوامل الربط المصطنعة التي يمكن التلاعب على وجه التحديد الربط البديلة من الجينات المستهدفة. يأخذ هذا الأسلوب الاستفادة من RNA طريقة فريدة ملزم من PUF يكرر لإنتاج سقالة ملزم RNA مع خصوصية مخصصة. ويمكن استخدامه إما تنشيط أو قمع الربط.

في خطوة حاسمة في هذا البروتوكول هو الجيل المجال PUF reprogramed الذي يحدد خصوصية كلية العلوم التربوية. وقد تم وضع بروتوكول خياطة PCR والأمثل للجيل السريع للسقالة PUF. مفتاح نجاحها هو لضبط نسبة قوالب متداخلة مختلفة إلى 1: 1: 1. تنقية المنتجات PCR بعد كل جولة حاسمة أيضا، لأن المنتجات غير المكرر، قد يكون تلوث التمهيدي من الجولة الماضية. خطوة هامة أخرى هي لفحص نسبة الربط باستخدام نصف الكمية RT-PCR. عموما، والرجل أيضايجب تجنب دورات التضخيم y، لأنها قد تشبع رد فعل ير. في تجاربنا مع التعبير المشترك لمراسل الربط، كانت 20 - 25 دورات تستخدم بشكل روتيني، ولكن هذا قد تختلف اعتمادا على وفرة من مرنا عند قياس الربط من الجينات الذاتية. عند قياس الأشكال الإسوية الربط باستخدام زوج جديد من الاشعال، نقترح معايرة تجربة ير في كل مرة، كما هو موضح سابقا 16 .

الحد المحتمل مع إسفس المصممة هو آثارها خارج الهدف، لأن يتم تحديد خصوصية من قبل عدد من يكرر في سقالة بوف. ويلديب بوف يعترف موقع 8 نت، وهو مشابه لخصوصية سيرنا التي تعترف هدفها من خلال "مباراة البذور". ومع ذلك، لأن أي تسلسل 8-نت يمكن أن يحدث مرة واحدة عن طريق الصدفة في نص 65،000 نت طويل (4 8 = 65،536)، سيكون هناك غيرها من النصوص خارج الهدف المعترف بها من قبل بوف المصمم. خارج الهدف الهدفإلخ يمكن أن تخفض باستخدام PUFs مع تكرار إضافية؛ ومع ذلك، فإنه لا يزال مفيدا لتقييم خصوصية والآثار بعيدا عن الهدف من كلية العلوم التربوية. للحد من الآثار المحتملة بعيدا عن الهدف، ويمكن أيضا أن يتم التعبير عن مزيج من كلية العلوم التربوية مصمم متعددة على مستوى أدنى من. في مثل هذه الحالة، والجينات المستهدفة من قد لا تتأثر كمية قليلة من كلية العلوم التربوية، في حين ستتأثر الربط الهدف الحقيقي من خلال كلية العلوم التربوية المتعددة التي تعمل بالتآزر. هذا الحل على غرار ما استخدم الباحثون في إسكات الجينات مع رني، حيث الرناوات siRNAs المجمعة (كل بتركيز انخفاض) التي تستهدف مواقع متعددة من مرنا واحد يمكن أن تقلل من الآثار بعيدا عن الهدف.

طريقة الرئيسي الآخر لمعالجة AS هو استخدام العقاقير [أليغنوكليوتيد أن الزوج مع مناطق معينة من قبل مرنا. مقارنة هذه الطريقة الحالية، يمكن أن كلية العلوم التربوية تتسبب في آثار طويلة في الخلايا ستابلي. وبالإضافة إلى ذلك، والتسليم في الجسم الحي من Eسف يمكن الاستفادة من ترسانة متزايدة من ناقلات العلاج الجيني، في حين أن تسليم الجسم الحي من أوليغونوكلأوتيدس العدوى من الصعب جدا السيطرة عليها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه الطريقة تجنب تعديلات معقدة ومكلفة من قليل النوكليوتيدات. باستخدام مختلف المروجين محرض، ويمكن أيضا أن تتحقق مراقبة أكثر دقة للتعبير إسف في أنواع الخلايا الصحيحة وفي الأوقات الصحيحة. والعيب الرئيسي لهذه الطريقة هو خصوصية منخفضة نسبيا (موقع الاعتراف 8 نت مقابل موقع الاعتراف 16-20-نت في أوليغونوكلأوتيدس المعادية نموذجية).

ويؤدي عدم الربط بين الربط البديل إلى العديد من الأمراض، بما في ذلك السرطان 26 ، 27 . وقد كشفت الدراسات على نطاق الجينوم أكثر من 15،000 المتغيرات لصق المرتبطة الورم في أنواع مختلفة من السرطان 28 ، 29 ، 30 . على سبيل المثال، إنترونيكوغالبا ما تسبب الطفرات الموقع لصق جينات الورم القامع الأحداث تخطي اكسون وتنتج البروتينات الشاذة التي قد تسهم في ورم نشأة 26 و 31 و 32. وعلاوة على ذلك، توجد بعض العوامل الربط إلى أن overexpressed في العديد من أنواع السرطان، الأمر الذي يسهم في خلية تحول 33، 34، مشيرا إلى أن عوامل الربط يمكن أيضا أن تلعب دورا هاما في نشوء حيوي السرطان. لذلك، بالإضافة إلى توفير أداة مفيدة لتعديل وظيفة الجين، والتلاعب من الربط مع كلية العلوم التربوية المصمم قد استعادة الأحداث الربط misregulated في السرطان، وبالتالي توفير أداة العلاجية المحتملة. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال دمج مجال PUF مصمم مع مجالات وظيفية مختلفة، والعوامل اصطناعية متعددة التي تعالج مختلف العمليات RNA الأيض ويمكن تصميم. على سبيل المثال، انصهار منشط متعدية (GLD2) أو مندوب متعديةressor (CAF1) مع المجال PUF العوامل الجديدة المنتجة التي يمكن تنشيط أو تثبيط مرنا الترجمة 27. باستخدام نفس التصميم الرئيسية، ونحن الجمع بين مجال RNA نوكلياز داخلية غير محددة (PIN) مع سلسلة من المجالات مصمم PUF لتوليد الاصطناعية نوكلياز داخلي RNA في مواقع محددة (ASREs) التي تعمل بالقياس إلى تقييد DNA الانزيمات 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R01-CA158283 وNSFC منح 31400726 لZWYW يموله برنامج المواهب الشابة ألف ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (منح 31471235 و81422038). ويتم تمويل XY من قبل مؤسسة العلوم ما بعد الدكتوراه من الصين (2015M571612).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14, (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18, (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8, (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352, (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17, (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72, (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1, (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19, (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34, (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286, (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7, (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6, (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6, (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20, (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186, (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19, (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23, (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64, (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4, (3), 4732 (2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68, (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7, (8), 1002218 (2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24, (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14, (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60, (1), 105-117 (2015).
هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).More

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter