Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Tekniske kunstige faktorer til specifikt manipulation af alternativ splejsning i humane celler

Published: April 26, 2017 doi: 10.3791/54967
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Computational Biology, CAS-MPG Partner Institute for Computational Biology, Shanghai Institutes for Biological Sciences (SIBS), 2Institute of Cancer Stem Cell, Second Affiliated Hospital, Cancer Center, Dalian Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Denne rapport beskriver en naturnær metode til at designe og konstruere hidtil ukendte Kunstige splejsningsfaktorer (ASFS), som specifikt modulerer splejsning af målgener i pattedyrceller. Denne fremgangsmåde kan udvides yderligere til at konstruere forskellige kunstige faktorer at manipulere andre aspekter af RNA metabolisme.

Abstract

Behandling af de fleste eukaryote RNA'er medieres af RNA-bindende proteiner (RBP'er) med modulære konfigurationer, herunder en RNA-genkendelse modul, som specifikt binder præ-mRNA mål for og et effektordomæne. Tidligere har vi draget fordel af den unikke RNA bindende tilstand af PUF-domænet i human pumilio 1 for at generere en programmerbar RNA-bindende stillads, som blev anvendt til at konstruere forskellige kunstige RBP'er at manipulere RNA metabolisme. Her er en detaljeret protokol beskrevet til konstruktion Engineered splejsningsfaktorer (ESFS) som er specifikt designet til at modulere alternativ splejsning af målgener. Protokollen omfatter at designe og konstruere en tilpasset PUF skelet til en specifik RNA-mål, hvordan man konstruerer en ESF ekspressionsplasmid ved at fusionere en designer PUF domæne og et effektordomæne, og hvordan man bruger ESFS at manipulere splejsning af målgener. I de repræsentative resultater af denne fremgangsmåde, har vi også beskrevet de fælles assaysaf ESF aktiviteter ved hjælp splejsning reportere, anvendelsen af ​​ESF i dyrkede humane celler, og den efterfølgende effekt til at splejse ændringerne. Ved at følge de detaljerede protokoller i denne rapport, er det muligt at designe og generere ESFS for regulering af forskellige typer af alternativ splejsning (AS), hvilket giver en ny strategi for at studere splejsning regulering og funktionen af ​​forskellige splejsningsisoformer. Endvidere ved at fusionere forskellige funktionelle domæner med en konstrueret PUF domæne, kan forskerne ingeniør kunstige faktorer, der er målrettet mod specifikke RNA'er til at manipulere forskellige trin af RNA-processering.

Introduction

De fleste humane gener undergår alternativ splejsning (AS) for at fremstille flere isoformer med særskilte aktiviteter, hvilket har stærkt forøgede den kodende kompleksiteten af genomet 1, 2. AS tilvejebringer en større mekanisme til at regulere genfunktion, og det reguleres stramt gennem diverse veje i forskellige cellulære og udviklingsstadier 3, 4. Fordi splejsning misregulering er en almindelig årsag til sygdom hos mennesker 5, 6, 7, 8, målretning splejsning regulering bliver en attraktiv terapeutisk rute.

Ifølge en forenklet model af splejsning regulering, AS hovedsageligt kontrolleres af Splejsning Regulatory cis -elementer (SRE'er) i præ-mRNA, der fungerer som splejsning enhancere eller dæmpere af alternative exons. thESE SRE'er specifikt rekruttere forskellige trans-agerende proteinfaktorer (dvs. splejsning faktorer), der fremmer eller undertrykker splejsningsreaktionen 3, 9. Fleste trans-agerende splejsningsfaktorer har separate sekvensspecifik RNA bindingsdomæner at genkende deres mål og effektordomæner at kontrollere splejsning. De mest kendte eksempler er medlemmer af serin / argininrige (SR) proteinfamilie, som indeholder N-terminale RNA Recognition Motifs (RRMS), som binder exoniske splejsning enhancere og C-terminale RS domæner, som fremmer exon integration 10 . Omvendt hnRNP A1 binder til exoniske splejsning lyddæmpere gennem RRM domæner og inhiberer exon integration gennem en C-terminal glycin-rige domæne 11. Ved anvendelse af sådanne modulære konfigurationer, forskere kunne konstruere kunstige splejsningsfaktorer ved at kombinere et specifikt RNA-bindingsdomænet (RBD) med forskellig effekTor-domæner, der aktiverer eller hæmmer splejsning.

Nøglen til et sådant design er at anvende en RBD, der genkender givne mål med programmerbar RNA-bindingsspecificitet, som er analog med DNA-bindingsmodusen for TALE-domænet. Imidlertid indeholder de fleste native splejsningsfaktorer RRM eller K Homology (KH) domæner, der genkender korte RNA-elementer med svag affinitet og således mangler en prædiktiv RNA-proteingenkendelse "kode" 12 . RBD af PUF gentag proteiner ( dvs. PUF-domænet) har en unik RNA-genkendelsestilstand, der muliggør redesign af PUF-domæner til specifikt at genkende forskellige RNA-mål 13 , 14 . Det canoniske PUF-domæne indeholder otte gentagelser af tre a-helikser, som hver genkender en enkelt base i et 8-nt RNA-mål. Sidekæderne af aminosyrer i visse positioner af den anden a-helix danner specifikke hydrogenbindinger med Watson-Crick-kanten af ​​than rna base, som bestemmer det RNA-bindende specificitet hver gentagelse (figur 1A). Koden til RNA basis erkendelse af PUF repeat er overraskende enkel (figur 1A), hvilket muliggør frembringelsen af PUF domæner, som genkender enhver mulig 8-bund-kombination (gennemgået af Wei og Wang 15).

Dette design princip modulære muliggør genereringen af en Engineered Splejsning Factor (ESF), der består af en tilpasset PUF domæne og en splejsning modulation domæne (dvs. en SR-domæne eller en Gly-rige domæne). Disse ESFS kan fungere som enten splejsnings- aktivatorer eller som inhibitorer til at kontrollere forskellige typer af splejsningsbegivenheder, og de har vist sig egnede som redskaber til at manipulere splejsning af endogene gener relateret til human sygdom 16, 17. Som et eksempel, har vi konstrueret PUF-Gly-typen ESFS til specifikt at ændre splejsning af Bcl-x-genetOmdannelse af antiapoptotiske lang isoform (Bd-XL) til pro-apoptotiske korte isoform (Bcl-XS). Shifting forholdet mellem Bcl-x-isoform var tilstrækkelig til at sensibilisere flere cancerceller til flere anti-cancer kemoterapeutiske lægemidler 16, antyder, at disse kunstige faktorer kan være nyttige som potentielle terapeutiske reagenser.

Udover at kontrollere splejsning med kendte splejsning effektordomæner (fx en RS eller Gly-rige domæne), kan de manipulerede PUF faktorer også anvendes til at undersøge aktiviteterne i nye splejsningsfaktorer. For eksempel ved hjælp af denne fremgangsmåde, har vi vist, at det C-terminale domæne af adskillige SR proteiner kan aktivere eller hæmme splejsning når binding til forskellige præ-mRNA-regioner 18, at alanin-rige motiv af RBM4 kan inhibere splejsning 19, og at den prolin-rige motiv af DAZAP1 kan forbedre splejsning 20, 21 </ Sup>. Disse nye funktionelle domæner kan bruges til at konstruere flere typer kunstige faktorer til finjustering af splejsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Konstruktion af en PUF-stillads med tilpasset RNA-bindende specificitet ved overlappende PCR

  1. Design en række PCR-primere indeholdende PUF-sekvenserne, der specifikt genkender forskellige RNA-nukleotider i hver position 12 (se tabel 1 for primer-sekvenserne og se figur 1A for RNA: PUF-genkendelseskoden). For hver PUF gentagelse skal du designe fire forskellige primere for at genkende en anden base på hver position.
    BEMÆRK: Disse primere vil blive brugt i en serie på fire runder af PCR-reaktioner til dannelse af PUF-fragmenter, der er sammenføjet ( figur 1 B ).
  2. Vælg genkendelsesstedet for målgenet nær det alternative splejsningssted.
    BEMÆRK: Dette websted kan afgøres af brugeren, og det vælges normalt inden for 10 - 50 nt fra de alternative splejsningssteder.
  3. Runde 1: Generer kodende sekvenserfor 4 PUF gentagelser, universal bridge fragmenter og cap-fragmenter.
    1. Brug målområdet at definere anerkendelse kode for hver gentagelse af den tilpassede PUF. Vælge det sæt af PCR-primere til PUF gentager 1 - 8. Conduct fire på hinanden følgende runder af PCR til frembringelse af en tilpasset PUF domæne, som beskrevet nedenfor (figur 1 B).
    2. I den første runde af PCR, nedsat standard-PCR reaktionsblandinger (indeholdende 2,5 pi 10x buffer, 0,5 pi 10 mM dNTP'er, 0,5 pi 10 pM fremadrettede og reverse primere, 50 ng DNA-templaten (humant cDNA eller ekspressionsvektor af WT PUF domæne), og 0,5 U high-fidelity DNA-polymerase i en 25 pi slutvolumen).
      BEMÆRK: Disse reaktioner vil producere DNA-sekvenser svarende til hver PUF repeat, til universelle bridge fragmenter og til to cap fragmenter med forskellige restriktionssites (figur 1 B). En kort liste over skabeloner, primere, Og genererede PCR-produkter anvendt i dette trin er vist i tabel 2 .
    3. Indstil PCR-programmet som følger: 5 min ved 95 ° C; 28 cyklusser på 30 s ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 15 s ved 72 ° C; Og 5 minutter inkubering ved 72 ° C. Brug højfidelitets DNA-polymerase til at minimere punktmutationer under PCR.
  4. Runde 2: Generer kodningssekvenser for R1 / R2 / R3 / R4 (R1-4) og R5 / R6 / R7 / R8 (R5-8).
    1. Separat PCR-produkter opnået i trin 1.3.3 ved anvendelse af elektroforese med en 1,5% agarosegel (25 min ved en konstant spænding på 120 V). Gel-rens alle produkter af den forventede størrelse ved hjælp af et gelrensningssæt. Brug en anden blanding af disse produkter som skabelonen i de følgende runder af PCR.
      BEMÆRK: Bland de tre PCR-produkter i et forhold på 1: 1: 1. De behøver normalt ikke kvantificeres, så længe intensiteten af ​​hvert produkt ligner hinanden i gelen.
    2. Bland ca. 5% af de oprensede PCR-produkter som et temmPlade i næste runde af PCR. Alternativt kvantificerer de oprensede PCR-produkter ved anvendelse af et UV-Vis-spektrofotometer og bruger 15 ng af hvert PCR-produkt i template-blandingen.
    3. Brug rensede PCR-produkter R1 / R2, R3 / R4 og Bridge 2/3 som blandede skabeloner og R1-F og R4-R som primere. Konfigurer PCR-reaktionen som beskrevet i trin 1.3 for at opnå overlappende PCR-produkt R1-4.
    4. Brug rensede PCR-produkter R5 / R6, R7 / R8 og Bridge 6-7 som blandede skabeloner og R5-F og R8-R som primere for at opnå overlappende PCR-produkt R5-8 ( Figur 1 B ). Indstil PCR-programmet som følger: 5 min ved 95 ° C; 28 cyklusser på 30 s ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 30 s ved 72 ° C; Og 5 minutter ved 72 ° C. Gel-rense R1-4 og R5-8.
  5. Runde 3: Generer kodningssekvenser for R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (R1 - 8 uden hætter).
    1. I den tredje runde PCR ved anvendelse af det oprensede R1-4, R5-8 og Bridge 4/5 som blandede skabeloner og R1-F ogR8-R som primere, opstiller PCR-reaktionen som beskrevet i trin 1.3 for at opnå overlappende PCR-produkt R1-8 uden hætter.
    2. Indstil PCR-programmet som følger: 5 min ved 95 ° C; 28 cyklusser på 30 s ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 55 s ved 72 ° C; Og 5 minutter ved 72 ° C. Gel-rens R1-8 uden hætter.
  6. Runde 4: Generer kodningssekvenser for komplette PUF domæner.
    1. I den sidste runde PCR indstilles PCR-reaktionen som beskrevet i trin 1.3 ved anvendelse af det oprensede R1-8 uden hætter og 5'-ende og 3'-endehætter som blandede skabeloner og Cap-F og Cap-R som primere. For at opnå de endelige muterede PUF-domæner.
    2. Indstil PCR-programmet som følger: 5 min ved 95 ° C; 28 cyklusser på 30 s ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 1 min ved 72 ° C; Og 5 minutter ved 72 ° C.
    3. Gel-oprensning af PCR-produkterne fra de endelige omprogrammerede PUF-domæner. Brug disse produkter til konstruktionen af ​​ESF ekspressionsplasmidet i de efterfølgende trin. sequiEnce den endelige konstruktion for at verificere de omprogrammerede sekvenser af PUF domæner.
      BEMÆRK: Cap-F koder for NLS (PPKKKRKV) mellem BamH I og Xba I sites, og Cap-R koder for en stopkodon og Sal I-stedet (restriktionsstederne blev designet til konstruktion af ekspressionsvektorer af ESF'er, figur 1C).

2. Opførelse af et funktionsmodul af ESF'er

  1. To strategier bruges almindeligt til at klone funktionelle moduler af ESF'er (RS-domæner eller Gly-rige domæner): at amplificere disse domæner ved hjælp af PCR under anvendelse af total human cDNA som en skabelon (trin 2.2) eller til direkte syntetisering af DNA-fragmenterne, der koder for forskellige RS Eller Gly-rige domæner (trin 2.3).
  2. Brug PCR til at klone RS-domæner fra resterne 123-238 af 9G8 (NP001026854), rester 180-272 af SRP40 (NP008856) eller rester 117-221 af SC35 (NP003007). Klon Gly-rige domæner fra rester 195 - 320 af hnRNP A1 (NP_002127), restS 203 - 353 af hnRNP A2 (NP112533) eller resterne 211 - 378 af hnRNP A3 (NP919223).
    1. Brug NCBI-primerdesignværktøjet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) eller Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) til at designe primere til Kloning af RS-domæner eller Gly-rige domæner (funktionelt modul af ESF'er).
      BEMÆRK: Den fremadrettede primer indeholder et N-terminal FLAG-tag efter Nhe I- webstedet . Den omvendte primer indeholder et BamHI- sted til kloning i ekspressionsvektorer ( figur 1C).
    2. Indstil standard PCR-reaktionen som beskrevet i trin 1.3 for at amplificere de RS- eller Gly-rige domæner. Indstil PCR-programmet som følger: 5 min ved 95 ° C; 28 cyklusser på 30 s ved 95 ° C, 30 s ved 55 ° C og 30 s ved 72 ° C; Og 5 minutter ved 72 ° C.
  3. Clone RS-domæner eller Gly-rige domæner gennem direkte DNA-syntese. I stedet for at generere PCR-produkter, der koder for effektor-domænerne i trin 2.2, synthestørrelse et oligonukleotid, der koder for et kort fragment RS domæne (RSRSRSRSRSRS) eller en Gly-rige domæne (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) under anvendelse af en kommerciel kilde til DNA-oligonukleotider.

3. Konstruktion af ESF ekspressionsplasmider

  1. Konstruere ESF ekspressionsplasmider ved hjælp af enhver ekspressionsvektor.
    BEMÆRK: Et ekspressionskonstruktion pGL-Gly-MS2 (en gave fra Dr. R. Breathnach fra Institute de Biologie-CHR11) blev oprindeligt brugt, som koder fra N- til C-terminalen, et FLAG-epitop, en Gly -rige domæne af hnRNP A1, og MS2-kappeproteinet. Derfor er denne ekspressionskonstruktion anvendes som eksempel i det følgende trin.
    BEMÆRK: Andre ekspressionsvektorer med multiple kloningssteder kan også anvendes, og vil blive anvendt faste kloningstrin at sammenknytte fragmenterne sammen.
  2. Fordøje 1,5 ug ekspressionsplasmiderne (PGL-Gly-MS2) er nævnt i trin 3.1 til fjernelse af MS2-kappeprotein-fragment. Brug restriction tionsendonukleaserne BamHI og Sall i 1 time ved 37 ° C. Fordøje genkendelsesmodul af ESFS (der koder for en NLS og omprogrammeres PUF domæner, der genereres i trin 1.5) med BamHI og Sall i samme stand.
  3. Tilføje 5x påføringsfarvestof til restriktionsfordøjelse reaktioner og langsomt elektroforese det totale volumen med en 1,5% agarosegel indeholdende en DNA-gel plet i 40 minutter ved 120 V. Gel-oprense de fordøjede produkter.
  4. Fremstilling af 10 pi ligeringsreaktioner med et oprenset genkendelsesmodul af ESF indsætter og ekspressionsvektor-DNA i et 3: 1 forhold, 1 pi DNA-ligase, og 1 pi 10x ligeringsbuffer. Inkubér ligeringsreaktioner natten over ved 4 ° C; den resulterende konstruktion udtrykker et Gly-PUF-typen ESF (pGL-Gly-PUF) under kontrol af en CMV-promotor (figur 1 C).
  5. Fjern fragment, der koder for FLAG / Gly-rige domæne med Nhel og BamHI fordøjelse i 1 time ved 37 ° C. Udskift det med et fragment, som koder for RS-domænet (genereret i trin 2.2, også fordøjet af Nhe I og BamH I); Den resulterende konstruktion udtrykker en ESF-RS-PUF-type ( figur 1C).

4. Konstruktion af splejsningsreporteren

  1. Syntese oligonukleotider indeholdende kandidatsekvenserne ( dvs. målsekvenser af PUF domæner) flankeret af Xho I og Apa I sites eller Xho I og EcoR I sites. Anneal oligonukleotiderne i 5 minutter ved 55 ° C for at opnå dobbeltstrengede indsatser indeholdende genkendelsesstederne for PUF domæner flankeret af de kohæsive ender af Xho I og Apa I eller Xho I og EcoR I steder.
  2. Start fra en tidligere beskrevet modulær splejsningsreporter 22 , pGZ3, som indeholder to GFP-exoner adskilt af en test-exon (exon 12 fra det humane IGF2BP1, Ensembl ID ENSG00000159.217) og dets flankerende introner.
    BEMÆRK: Prøven exon blev manipuleret med Xho I og Apa I-sites, som kan anvendes til at indsætte syntetiserede oligonukleotider indeholder kandidat sekvenserne (målsekvenser af PUF domæner). Dette modulopbyggede splejsning reporter (pGZ3) er tilvejebragt gennem plasmidet repository Tilføj-genet.
  3. Fordøje basen reporter pGZ3 (fremstillet i trin 4.2) med Xhol og Apal restriktionsendonukleaser i 1 time ved 37 ° C.
  4. Gel-oprense de fordøjede produkter som beskrevet i trin 3.3.
  5. Forbered 10 pi ligeringsreaktioner med de dobbeltstrengede inserter genereret i trin 4.1 og den spaltede pGZ3 vektor genereret ved trin 4,4 i en 3: 1 molforhold, 1 pi DNA-ligase, og 1 pi 10x ligeringsbuffer. Inkubér ligeringsreaktioner natten over ved 4 ° C til opnåelse af konstruere splejsning reportervektor pGZ3.
  6. Indsæt de dobbeltstrengede skær dannet i trin 4.1 ind i den tidligereoffentliggjorte reportere Pez-1B (under anvendelse af Xho I og EcoR I-stederne) og PEZ-2F (under anvendelse af Xhol og Apal sites) 23, til opnåelse af den konkurrerende 5'ss reporter og den konkurrerende 3'ss reporter, som beskrevet i trin 4.3-4.5.
    BEMÆRK: Begge typer af splejsning journalister vil være tilgængelig via Add-gen.

5. Konstruktion af Lentiviral Ekspressionsvektorer for ESF

  1. Opsætning af standard PCR-reaktion som beskrevet i trin 1.3 til amplifikation i fuld længde ESFS fra de oprindelige ekspressionsvektorer (pGL-Gly-PUF eller PGL-RS-PUF) med primere indeholdende Mlul / Spel sites. Indstil PCR-programmet som følger: 5 min ved 95 ° C; 28 cykler af 30 sekunder ved 95 ° C, 30 sekunder ved 55 ° C, og 1,5 minut ved 72 ° C; og 5 min ved 72 ° C.
  2. Gennem en spaltning reaktion, geloprensning og ligeringsreaktionen integrere ESFS i den lentivirale ekspressionsvektor pWPXLd mellem Mlul Spe I-stederne, som beskrevet i trin 3.2-3.4.
  3. Bruge standard calciumphosphatpræcipitationsfremgangsmåden, som tidligere rapporteret 24, til at generere lentivira ved cotransfektion HEK293T celler ved emballering vektorerne, psPAX2 og pMD2.G, med enten pWPXLd-Gly-PUF (Bd-XL), pWPXLd-Gly-PUF ( wt) (som en specificitet kontrol) eller pWPXLd-GFP (mock).
    1. Seed 5x10 6 HEK293T celler i 10 cm skåle og vokse cellerne natten over i 10 ml Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) pr skål i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 . Udfør transfektion, når cellerne er 70 - 90% sammenflydende.
    2. Forbered plasmid blandingen ved tilsætning af de tre plasmider (7,5 ug af emballagen vektor, psPAX2; 2,5 ug af pMD2.G og 10 ug af enten pWPXLd-Gly-PUF (Bd-XL), pWPXLd-Gly-PUF (wt) eller pWPXLd-GFP) til et 2 ml rør.
    3. Tilføj 560 pi 0,25 M CaCl2 og 560 pi 2 x BBS opløsning til 2-ml rør. Bland forsigtigt flere gange og inkubere det i 15 minutter ved stuetemperatur til fremstilling af transfektionsblandingen.
    4. Tilføj alle transfektionsforsøg blandinger til de 10-cm skåle. Swirl retterne forsigtigt og inkuberes dem natten over ved 3% CO2 og 37 ° C.
    5. Fjern mediet tilsættes 10 ml af frisk DMEM med 2% FBS til hver skål, og inkubere dem ved 10% CO2 og 37 ° CO / N.
    6. Opsaml første supernatant fra skålene. Der tilsættes 10 ml frisk DMEM med 2% FBS til hver skål. Inkubér skålene O / N ved 10% CO2 og 37 ° C. Opbevar supernatanten ved 4 ° C.
    7. Opsaml anden supernatant fra skålene. Pool supernatanten fra den første og anden høst. Rydde supernatanten af ​​cellerester ved at filtrere den gennem et 0,4-um filter. Bruge klarede supernatant direkte eller gemme det ved -80 ° C.
  4. Bestem titeren af ​​lentivirus ved at inficere HEK293T-celler med seriefortyndinger af viruspræparatet, som tidligere rapporteret 25.

6. Konkret Modulerende Exon Inklusion og den alternative anvendelse af Splice steder med ESFS

  1. Seed 2 x10 5 HEK293T celler i hver brønd på en plade med 24 brønde. Dyrk cellerne natten over i 500 pi DMEM suppleret med 10% FBS i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Bland den liposomale transfektionsreagens ved forsigtigt at vende flaskerne før brug. Fortynd 2 pi liposomal transfektionsreagens i 50 pi af reduceret serummedium. Bland forsigtigt og inkuber dem i 5 min ved stuetemperatur.
  3. Fortynd 0,04 ug pGL-Gly-PUF ekspressionsvektorer og 0,2 ug pGZ3 reporterplasmider i 50 pi reduceret serummedium i et sterilt rør. Fortynd 0,4 ug PGL-RS-PUF ekspressionsvektorer og 0,2 ug pGZ3 reporterplasmider i 50 pi reduceret serummedium i et sterilt rør. Dilute 0,4 ug PGL-RS-PUF ekspressionsvektorer og 0,2 ug af PEZ-1B eller PEZ-2F reporterplasmider i 50 pi reduceret serummedium i et sterilt rør.
  4. Efter 5 min inkubation ved stuetemperatur, bland forsigtigt den fortyndede liposomale transfektionsreagens fremstillet i trin 6.2 med de fortyndede plasmider fremstillet i trin 6.3. Inkuber blandingen i 20 minutter ved stuetemperatur.
  5. Tilføje hele transfektionsforsøg blandinger, der indeholder ekspressionsvektorer og transfektionsreagens fremstillet i trin 6,4 til hver brønd og inkuberes i mindst 12 timer i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  6. Efter 12 timer i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2, kasseres mediet fra hver brønd og vask dem med 500 pi phosphatpufret saltvand (PBS) / brønd.
  7. Kassér PBS og tilsættes 200 pi trypsin til hver brønd. Inkubér pladen i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 i 5 minutter. Der tilsættes 1 ml af mediet for at stoppe diGestion og overfør cellerne til et sterilt 1,5 ml rør.
  8. Centrifuger rørene i 3 minutter ved 5.000 xg og kassér mediet. Tilsæt 0,5 ml RNA-ekstraktionsbuffer pr. Rør for at lyse cellerne ved gentagen pipettering. Inkubér de homogeniserede prøver i 5 minutter.
  9. For hver RNA-ekstraktionsbufferbehandlet prøve tilsættes 0,1 ml chloroform pr. 0,5 ml RNA-ekstraktionsbuffer. Inverter rørene i 15 s og inkuber dem i 3 minutter ved stuetemperatur.
  10. Centrifuger rørene i 15 minutter ved 12.000 xg og 4 ° C. Overfør vandfasen til et nyt rør. Tilsæt 0,25 ml isopropanol pr. 0,5 ml RNA-ekstraktionsbuffer anvendt til den oprindelige homogenisering.
  11. Bland ved vortexing og inkuber dem ved stuetemperatur i 10 minutter. Centrifuger rørene ved 12.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Efter centrifugering er RNA-bundfaldet sædvanligvis synligt på bunden af ​​røret.
  12. Kassér supernatanten og vask RNA-pellet med 0,5 ml 75% ethanol pr. 0,5 ml RNA-ekstraktionsbuffer.
  13. Vortex kraftigt og centrifugeres den ved 7.500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten og tør RNA-pelleten. Opløs RNA i 50 pi RNase-frit vand.
  14. Tilsæt 2 pi 5 U / pl DNase I, 7 pi 10x buffer, og 11 pi H2O til hver 50-pi RNA-opløsning. Rørene inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Varme dem ved 70 ° C i 15 minutter for at inaktivere DNasen.
  15. For hver prøve tilføje følgende komponenter til en 0,2 ml nuclease-free tube: 1 pi 50 pM oligo-dT, 5 pi 400 ng / pl RNA (2 ug), 1 pi 10 mM dNTP og 3 pi H 2 O. Udfør den omvendte PCR.
    1. Blandingen opvarmes til 65 ° C i 5 minutter og inkuberes det på is i mindst 2 minutter for at forhindre gendannelse af sekundær struktur. Tilføje følgende komponenter til det samme rør: 4 pi 5x første streng buffer, 1 pi 0,1 M DTT, 1 pi 200 U / pl revers transkriptase, og 4 pi af H2 </ Sub> O. Bland ved pipettering forsigtigt op og ned og inkuberes ved 50 ° C i 60 minutter. Reaktionen standses ved opvarmning ved 70 ° C i 15 min.
  16. For hver prøve tilføje følgende komponenter til en PCR-rør for at fuldføre legemet-mærkede PCR: 2.5 pi 10 x PCR-buffer, 0,5 pi 10 mM dNTP-blanding, 1 pi 10 pM forward primer, 1 pi 10 pM reverse primer, 0,25 pi 5 U / pl Taq DNA-polymerase, 0,5 pi 25 nM Cy5-dCTP og 2 pi af cDNA fremstillet i trin 6.15.
    1. Opvarm reaktionsblandingen til 94 ° C i 2 min for at denaturere molekylerne, udføre 25 cykler af PCR (94 ° C i 30 s, 60 ° C 30 s og 72 ° C 30 s), holde reaktionen ved 72 ° C i 7 min, og derefter lade det blive ved en 4 ° C hold.
  17. Løse de PCR produkter af elektroforese gennem en 10% polyacrylamidgel med en 1x Tris-base, Borsyre og EDTA (TBE) buffer. Udfør en scanning ved hjælp af en fluorescens-scanner. Målmængde af hver splejsning isoform ved hjælp af en densitometri software.

7. Brug ESF til at modulere Endogen Bel-XL splejsning og måle dens virkninger på apoptose

  1. Plade 2 x 10 5 HeLa-celler til hver brønd i en plade med 24 brønde. Dyrk cellerne natten over i 500 pi DMEM suppleret med 10% FBS i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
  2. Efter 12 timer, transficere cellerne med 2 ug pGL-Gly-PUF (WT) eller 0,2 ug, 1 ug, og 2 ug pGL-Gly-PUF (531) (a omprogrammeres PUF domæne, der genkender Bcl-x præ- mRNA med høj affinitet, se figur 2 A).
  3. 24 timer senere, høste cellerne. 1/3 af cellerne er for RNA-isolering og PCR-analyse (trin 6.8 - 6.17) og 2/3 er for proteinet isolation.
  4. For Western blot-analyse, koges de samlede cellepellets i 2X natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ladningsbuffer i 10 minOg derefter løse proteinerne i en 12% SDS-PAGE gel. Overføre proteinerne til en nitrocellulosemembran.
  5. Blokere membranen med 5% mælk i 1 time ved stuetemperatur og inkuberes membranen O / N med caspase-3 (1: 1.000), PARP (1: 1.000), eller beta-actin (1: 5.000) primære antistoffer (fortyndet i 5% mælk) ved 4 ° C.
  6. Vask membranen med PBS indeholdende 0,1% Tween 20 (PBS-T) i 5 minutter ved stuetemperatur 3x på en vippende ryster. Inkubere membranen med HRP-bundne antistoffer (1: 5000 fortyndet i 5% mælk) i 1 time ved stuetemperatur.
  7. Vask membranen med PBS-T 3x ved stuetemperatur, og derefter udvikle membranen under anvendelse af ECL Western blotting-påvisningsreagenser.
  8. Tilsæt 250 pi af poly-L-lysin (PLL) på dækglas, inkuber dem i 15 minutter ved stuetemperatur, og omdirigerer væsken. Vask de PLL-overtrukne dækglas med PBS 3x i 5 minutter hver. For immunofluorescensassay måling apoptose, frø 5 x 10 5 HeLa-celler på poly-lysin-coatede dækglas i en 6-brønds plade. transficere pGL-Gly-PUF (WT) eller pGL-Gly-PUF (531) plasmider ind i HeLa-celler under anvendelse af et liposomalt transfektionsreagens (se trin 6.1 - 6.5).
  9. 24 timer efter transfektionen fikseres cellerne på dækglassene med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 20 minutter ved stuetemperatur. ADVARSEL: PFA er toksisk; håndtere det med omhu i et stinkskab.
  10. Forsigtigt vaske cellerne på dækglassene ved tilsætning af 2 ml 1 x PBS. Inkubere dem i 5 minutter. Fjern PBS med pipetter. Gentag vask 3x.
  11. Permeabilisere cellerne med 0,2% Triton X-100 i 1 x PBS i 10 min, og derefter vaske dem 3x med 1x PBS.
  12. Blokere cellerne med 3% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS i 10 min og vaskes 3x med 1x PBS.
  13. Fortynde FLAG-antistoffet 1: 1.000 i 3% BSA / PBS og pipette 30 pi af den fortyndede FLAG antistoffet på en parafilm ark.
  14. Tag dækglasset med cellerne, omhyggeligt tørre overskydende buffer med lab klude, og sætte det på hovedet (celle-side nedad) på de 30 pi anti-FLAG solution. Inkubere det i 1 time ved stuetemperatur.
  15. Tilsæt ca. 500 pi af 1 x PBS til den side af dækglasset inkuberet med det primære antistof indtil dækglasset flyder på toppen af ​​opløsningen. Returnere den til plade med 6 brønde med 1 x PBS i brøndene.
  16. Vaske det 3x med 1x PBS i 5 minutter hver.
  17. Fortynde anti-muse sekundært antistof (1: 500) i 3% BSA / PBS; igen, skal du bruge 30 uL for hvert dækglas. Sætte dækglasset på hovedet på det sekundære antistof opløsning og inkuber det i 15 minutter ved stuetemperatur.
  18. Fjern dækglasset fra parafilmen, som beskrevet i trin 7.15. Sætte den tilbage i 6-brønds plade og vask det med 1x PBS 3x i 5 minutter hver.
  19. Montere dækglassene med montering medium (med DAPI), fjerne overskydende medium og forsegle kanten med neglelak.
  20. Visualisere cellerne under anvendelse af et fluorescensmikroskop (ved 100X forstørrelse) og fotografere dem med et digitalkamera.
    BEMÆRK: Ekspressionen af ​​ESF visualiseres ved fluorescens-labeled sekundært antistof mod FLAG-mærke, og kernefragmentering visualiseres under anvendelse af DAPI-farvning.

8. Mål Apoptose af forskellige Cancer Cells udtrykker ESF

  1. Split 2 x 10 6 HeLa-celler, MDA-MB-231-celler og A549-celler i 60-mm skåle med 4 ml DMEM suppleret med 10% FBS i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 for at detektere apoptose med Propidium iodid (PI) farvning.
  2. 24 timer senere, opdatere mediet og forberede lentivirus, som tidligere rapporteret 24.
  3. Fortynd 10 x 10 6 lentivirus pWPXld-Gly-PUF (WT), pWPXld-Gly-PUF (531), eller pWPXld-GFP lagre i 4 ml frisk medium for at gøre forholdet mellem virus til celleantal lig med 5.
  4. Ændre mediet i pladerne til 4 ml af virusholdige medium fremstillet i trin 8.3 og inkuber pladerne i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. 12 timer efter infektionen, ændre mediet.
  5. Efter 24 timers infektion, indsamle og plette cellerne i 5 minutter i en PBS-opløsning indeholdende en slutkoncentration på 2 pg / ml PI.
  6. Analyser PI-farvede celler med et flowcytometer, som tidligere 16 beskrevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne rapport beskriver den komplette protokol for design og konstruktion af ESFS og splejsning reportere. Den beskriver også den videre anvendelse af ESFS i manipulere AS af endogene gener 16. For at illustrere typiske resultater af ESF-medieret splejsning ændringer, bruger vi data fra vores tidligere arbejde som et eksempel. ESFS med forskellige funktionelle domæner kan anvendes til at fremme eller hæmme optagelsen af målet kassette exon (Figur 1 D & E). ESFS kan også påvirke brugen af alternative 5'- og 3'-splejsningssteder i reporteren (figur 1 F & G).

Den alternativ splejsning af det endogene gen, kan også reguleres specifikt med designer ESFS. Vi har vist denne ansøgning specifically målretning Bd-XL, som kan splejses i to antagonistiske isoformer med alternative 5'splejsningssteder. Vi designet en ESF, Gly-PUF (531), som genkender en 8-nt RNA element mellem de alternative 5'- splejsningssteder. Dette Gly-PUF (531), som specifikt skiftede splejsning til produktion af Bcl-xS (figur 2 A). Efter transfektion af Gly-PUF (531) ind i HeLa-celler, niveauet af Bcl-XS isoformer og Bcl-XS-proteiner steg i en dosisafhængig måde, hvorimod kontrolgruppen ESF, Gly-PUF (WT), påvirkede ikke forholdet af Bcl-xS til Bd-xL (fig 2 B & C). Desuden kan designeren ESF inducerer kløvning af caspase 3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), to velkendte molekylære markører for apoptose (figur 2 D). Som forventet er de designer ESFS overvejende lokaliseret i kernerne af transficerede celler, som demonstrated ved immunofluorescensmikroskopi (figur 2E). Konsekvent, at splejsning skift med Gly-PUF (531) bevirkede fragmentering af kerne-DNA, hvilket indikerer, at disse celler undergår apoptose (fig 2E). Forøgelsen af apoptotiske celler blev yderligere bekræftet ved at undersøge mere end 200 celler fra tilfældigt valgte felter og ved kvantificering af procent af celler med fragmenteret nukleart DNA (figur 2 F).

figur 1
Figur 1: Design af ESFS og deres aktivitet i Modulerende Exon Skipping. (A) Specifik binding mellem PUF domæne og RNA-mål er illustreret med RNA-PUF struktur og et skematisk diagram. PUF bindende kode for hver af defire RNA-baser, der vises til højre med forskellige farver, der bruges til at designe PUF mutationer. (B) Rutediagram for at opnå en skræddersyet PUF domæne. Den PUF der genkender "UGUAUAUA" blev brugt som et eksempel. En 4-runde PCR-strategi anvendes til at samle en PUF stillads med tilpassede RNA-bindende specificitet (farvekodet lignende måde panel A). I den første runde, er en serie af PCR-primere som inkorporerer de ønskede RNA-genkendelse koder for to tilstødende PUF gentagelser anvendes til at generere fire fragmenter, der omfatter de otte RNA-genkendelseskoder af en fuld PUF protein (R1 / R2, R3 / R4 , R5 / R6 og R7 / R8). Cap fragmenter, der koder en N-terminal kernelokaliseringssignal, en C-terminal stopkodon og bridge fragmenter er også produceres separat (5'-enden og 3'-endedæksel, bro 2/3, bro 4/5, og bro 6 / 7). I anden runde, er nye skabeloner genereres ved blanding overlappende fragmenter, der koder tilstødende gentagelser med den passende bro (fx blande R1 / R2,R3 / R4 og bro 2/3 genererer skabelon til R1 - 4) og derefter strækker sig med DNA-polymerase at udfylde hullerne. Ligeledes den tredje runde slutter R1-4, R5-8, og broen 4/5. Endelig er det fjerde runde tilføjer 5'-enden og 3'-endedæksler af PUF-domænet sammen med kloningsstederne for efterfølgende kloning til ekspressionsvektorer. (C) Modular domæne organisering af ESFS. ESFS er drevet af CMV-promotorer (pil) og indkode, fra N- til C-terminal: et FLAG-epitop (til påvisning af ESFS), et funktionelt modul (a Gly-rige domæne eller en RS-domæne), en NLS (lette kernelokalisering af ESFS), og en RNA-genkendelsesdomæne (en PUF domæne). NheI og BamHI er designet til at indsætte et funktionelt modul, mens Xbal og Sall er jeg designet til at indsætte en RNA-genkendelse domæne. (D) Gly-PUF ESFS co-udtrykkes med exon skipping reportere, og splejsningsmønster analyseres ved RT-PCR. Det modificerede PUF en b binder specifikt til 8-mer-mål A og B. (i samme farver). Alle kombinationer anvendes, så PUF-mål-par i forskellige farver tjene som kontrollerne. Virkningerne af RS-PUF på exon skipping (E), blev den konkurrerende 5'-splejsningssted (F), eller den konkurrerende 3'-splejsningssted reporter (G) analyseres ved fremgangsmåder svarende til panel D. Dataene i RT-PCR er fra Wang et al. 16. Klik her for at se en større version af dette tal.

figur 2
Figur 2: Regulering af endogent Bcl-xL præ-mRNA splejsning med ESFS. (A) Skematisk af alternativ splejsning af endogent Bclx præ-mRNA. To alternative 5'-splejsningssted i exon 2 af Bel-XL anvendes til at generere to isoformer af forskellige størrelser, Bd-XL og Bcl-XS. Sekvensen UGUGCGUG mellem de to 5'-splejsningssteder er valgt som ESF mål, og WT PUF gentager 1, 3 og 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) omprogrammeres (stjerner), anerkender denne målsekvens. Den resulterende ESF indeholdende en Gly-rige domæne inhiberer anvendelsen af ​​den nedstrøms 5'ss (angivet med den røde pil). (B) Modulation af Bel-x 5' ss brug. Forskellige mængder af Gly-PUF (531) ekspressionskonstruktion transficeres ind i HeLa-celler. Gly-PUF (WT) anvendes som en kontrol. To isoformer af Bel-XL detekteres med RT-PCR under anvendelse af primere svarende til exon 1 og 3 i Bd-XL-genet. Procentdelen af ​​Bcl-xS isoform kvantificeres og vist nederst. (C) ESFS påvirker ekspressionsniveauerne af Bd-XL og Bcl-XS. Prøver lagt i samme rækkefølge som i panel B, og alle proteiner are opdaget af Western blotting. Ekspressionen af ​​ESFS detekteres af anti-FLAG-antistof, og tubulin niveau anvendes som en kontrol. (D) Forskellige mængder af ESF ekspressionskonstruktioner transficeres ind i HeLa-celler, hvilket resulterer i spaltningen af PARP og caspase 3. Prøver detekteres ved Western blot 24 timer efter transfektion. Actin niveau detekteres som en kontrol. (E) Den subcellulære lokalisering af ESFS i transficerede HeLa-celler detekteres ved immunofluorescensmikroskopi med anti-FLAG-antistof. Cellerne co-farvet med DAPI for at vise kernerne. Nogle kerner, især i celler transficeret med Gly-PUF (531), er fragmenterede skyldes apoptose. Skalasøjle: 5 um. (F) Procentdel af apoptotiske celler (dvs. celler med fragmenteret kerne-DNA) er målt fra tilfældigt udvalgte områder af fluorescens mikroskopi billeder. Søjlerne angiver middelværdien, mens prikkerne angiver data fra de to forsøg. tallets er ændret fra vores tidligere rapport af Wang et al. 16 i overensstemmelse med den politik Nature Publishing Group. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne rapport giver en detaljeret beskrivelse af konstruktion og fremstilling af kunstige splejsningsfaktorer som specifikt kan manipulere alternativ splejsning af et målgen. Denne fremgangsmåde drager fordel af den unikke RNA bindende tilstand af PUF gentager at producere et RNA-bindende stillads med tilpassede specificitet. Det kan bruges til enten at aktivere eller undertrykke splejsning.

Det kritiske trin i denne protokol er frembringelsen af ​​reprogramed PUF domæne, der definerer specificiteten af ​​ESFS. En PCR syning protokol er blevet udviklet og optimeret til hurtig generering af PUF stilladset. Nøglen til succes er at justere forholdet mellem forskellige overlappende skabeloner til 1: 1: 1. Oprensningen af ​​PCR-produkterne efter hver runde er også kritisk, fordi urensede produkter kan have primer forurening fra den sidste runde. Et andet vigtigt skridt er at analysere splejsning procent med semikvantitativ RT-PCR. Generelt, også mandy amplifikationscykler bør undgås, da de kan mætte PCR-reaktionen. I vores eksperimenter med co-ekspression af et splejsning reporter, 20 - blev 25 cyklusser anvendes rutinemæssigt, men kan variere afhængigt af den overflod af mRNA ved måling af splejsning af endogene gener. Når kvantificering af de splejsningsisoformer anvendelse af et nyt par primere, foreslår vi at kalibrere PCR-forsøg hver gang, som tidligere beskrevet 16.

En potentiel begrænsning med designer ESFS er deres off-target effekter, fordi specificiteten bestemmes af antallet af gentagelser i PUF stilladset. Vildtype PUF genkender en 8-nt site, der kan sammenlignes med specificiteten af ​​et siRNA, der anerkender sit mål gennem "frø kamp." Men da enhver 8-nt sekvens kunne forekomme én gang ved et tilfælde i et transkript 65.000 nt langt (4 8 = 65.536), vil der være andre off-target transkripter anerkendt af designer PUF. Off-target effect kan reduceres ved hjælp PUF'er med yderligere gentagelser; men det er stadig nyttigt at evaluere specificiteten og off-target effekter af ESFS. For at minimere potentielle off-target effekter, kan ekspressionen af ​​en kombination af flere designer ESFS på et lavere niveau også udføres. I et sådant tilfælde kan de off-målrettede gener ikke påvirkes af den lave mængde af ESFS, hvorimod splejsning af det egentlige mål vil blive påvirket af de multiple ESFS, der fungerer synergistisk. Denne opløsning svarer til, hvad forskere anvendt i gendæmpning med RNAi, hvor de puljede siRNA'er (hver ved en reduceret koncentration), der er målrettet flere steder af et enkelt mRNA kan reducere off-target effekter.

Den anden vigtigste metode til at manipulere AS er at anvende antisense-oligonukleotider, par med visse regioner i præ-mRNA'et. Sammenlignet med denne eksisterende fremgangsmåde kan ESFS forårsage forlængede virkninger i stabilt transficerede celler. Hertil kommer, at in vivo-levering af ESF kan drage fordel af den stigende arsenal af genterapivektorer, hvorimod in vivo levering af antisense-oligonukleotider er meget svært at kontrollere. Desuden kan denne fremgangsmåde undgå komplicerede og kostbare modifikationer af oligonukleotider. Ved hjælp af forskellige inducerbare promotorer, kan også opnås en mere præcis styring af ESF ekspression i de korrekte celletyper og på de rigtige tidspunkter. Den væsentligste ulempe ved denne fremgangsmåde er den relativt lave specificitet (en 8-nt genkendelsessted versus en 16- til 20-nt genkendelsessted i typiske antisenseoligonukleotider).

Den dysregulering af alternativ splejsning forårsager mange sygdomme, herunder kræft 26, 27. Genom-dækkende undersøgelser har afsløret mere end 15.000 tumorassocierede splejsningsvarianter i forskellige typer af cancere 28, 29, 30. For eksempel, intronisksplejsealleler mutationer af tumorsuppressorgener forårsager ofte exon-spring begivenheder og producere afvigende proteiner, som kan bidrage til tumorgenese 26, 31, 32. Desuden er fundet nogle splejsningsfaktorer at være overudtrykt i mange cancertyper, hvilket bidrager til celletransformation 33, 34, hvilket indikerer, at splejsningsfaktorer også kan spille vigtige roller i cancer biogenese. Derfor, ud over at tilvejebringe et nyttigt værktøj til at modulere genfunktion, kan manipulation af splejsning med designer ESFS genoprette misregulated splejsningsbegivenheder i cancer, hvorved der tilvejebringes en potentiel terapeutisk værktøj. Desuden ved at fusionere en designer PUF domæne med forskellige funktionelle domæner, flere kunstige faktorer der manipulerer forskellige RNA metabolisme processer kan udformes. F.eks fusionen af ​​et translationel aktivator (GLD2) eller en translationel repRESSOR (Caf1) med PUF domæne producerede hidtil ukendte faktorer, der kan aktivere eller hæmme mRNA-translation 27. Ved anvendelse af samme design principal, vi kombinerede en ikke-specifik RNA endonuklease domæne (PIN) med en række designer PUF-domæner for at danne kunstige stedspecifikke RNA endonukleaser (ASREs), der fungerer analogt med DNA restriktionsenzymer 17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud R01-CA158283 og NSFC giver 31.400.726 til ZWYW er finansieret af Young Tusinde Talenter Program og National Natural Science Foundation of China (tilskud 31471235 og 81422038). XY er finansieret af postdoc Science Foundation of China (2015M571612).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456 (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40 (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14 (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18 (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8 (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352 (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17 (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72 (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1 (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19 (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34 (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286 (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7 (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6 (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64 (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4 (3), 4732 (2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68 (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7 (8), 1002218 (2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).

Tags

Genetik kunstige RNA bindende faktorer protein engineering splejsningsfaktorer alternativ splejsning PUF scaffold RNA-bindende proteiner kræft
Tekniske kunstige faktorer til specifikt manipulation af alternativ splejsning i humane celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu,… More

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter