Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Engineering Artificiella Faktorer att specifikt Manipulera alternativ splitsning i humana celler

doi: 10.3791/54967 Published: April 26, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Denna rapport beskriver en bioteknik metod för att utforma och konstruera nya Artificiella Skarv Faktorer (ASFs) som specifikt modulerar splitsning av målgener i däggdjursceller. Denna metod kan utvidgas ytterligare för att konstruera olika artificiella faktorer att manipulera andra aspekter av RNA-metabolism.

Abstract

Bearbetning av de flesta eukaryota RNA medieras av RNA-bindande proteiner (RBP-anordningama) med modulära konfigurationer, inkluderande en modul RNA erkännande, som specifikt binder den pre-mRNA-mål och en effektordomän. Tidigare har vi dragit fördel av den unika RNA-bindningsläge för PUF-domänen i humant pumilio 1 för att generera en programmerbar RNA-bindande scaffold, som användes för att konstruera olika artificiella RBP-anordningama för att manipulera RNA-metabolism. Här, är ett detaljerat protokoll beskrivs att konstruera Engineered Skarv Faktorer (ESFS) som är särskilt utformade för att modulera alternativ splitsning av målgener. Protokollet innefattar hur man kan utforma och konstruera en anpassad PUF byggnadsställning för ett specifikt mål-RNA, hur man konstruerar en ESF expressionsplasmid genom att fusera en designer PUF domän och en effektordomän, och hur man använder ESFS att manipulera splitsning av målgener. I representativa resultat av denna metod har vi också beskrivit de gemensamma analysernaav ESF-aktiviteter med hjälp av splits reportrar, tillämpningen av ESF i odlade humana celler, och den efterföljande effekten av splits förändringar. Genom att följa de detaljerade protokoll i denna rapport är det möjligt att utforma och skapa ESFS för reglering av olika typer av alternativ splitsning (AS), vilket ger en ny strategi för att studera skarvning reglering och funktion olika skarv isoformer. Dessutom, genom att fusera olika funktionella domäner med en designad PUF domän kan forskare ingenjör artificiella faktorer som riktar specifika RNA för att manipulera olika steg i RNA-bearbetning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De flesta humana gener genomgår Alternativ Splicing (AS) för att producera flera isoformer med olika aktiviteter, vilket kraftigt har ökat den kodande komplexiteten hos genomet 1 , 2 . AS tillhandahåller en viktig mekanism för att reglera genfunktionen, och den regleras strikt genom olika vägar i olika cellulära och utvecklingssteg 3 , 4 . Eftersom splitsning av felreglering är en vanlig orsak till mänsklig sjukdom 5 , 6 , 7 , 8 , blir målriktning av splitsningsreglering en attraktiv terapeutisk väg.

Enligt en förenklad modell för splitsningsreglering kontrolleras AS huvudsakligen av Splicing Regulatory cis- Elements (SREs) i pre-mRNA som fungerar som splicing enhancers eller silencers of alternative exons. ThEse SREs rekryterar specifikt olika transaktiva proteinfaktorer ( dvs splitsningsfaktorer) som främjar eller undertrycker splitsningsreaktionen 3 , 9 . De flesta transaktiva splitsningsfaktorerna har separata sekvensspecifika RNA-bindande domäner för att igenkänna deras mål och effektordomäner för att styra splitsning. De mest kända exemplen är medlemmarna i den serin / argininrika (SR) -proteinfamiljen som innehåller N-terminala RNA-erkännandemotiv (RRM), vilka binder exoniska splitsningsförstärkare och C-terminala RS-domäner, vilket främjar exon inkludering 10 . Omvänt binder hnRNP A1 till exoniska splitsningsdämpare genom RRM-domänerna och hämmar exonintegration genom en C-terminal glycinrik domän 11 . Med hjälp av sådana modulära konfigurationer bör forskare kunna konstruera artificiella splitsningsfaktorer genom att kombinera en specifik RNA-bindande domän (RBD) med olika effekttor domäner som aktiverar eller hämmar splitsning.

Nyckeln till en sådan utformning är att använda en RBD som identifierar given mål med programmerbar RNA bindningsspecificitet, som är analog med den DNA-bindande läget av berättelsen domänen. Dock de flesta nativa splitsningsfaktorer innehåller RRM eller K Homologi (KH) domäner, som känner igen korta RNA element med svag affinitet och således saknar en prediktiv RNA-proteinigenkänning "kod" 12. RBD av PUF upprepningsproteiner (dvs. PUF-domänen) har en unik RNA-igenkänningsmoden, vilket möjliggör den nya utformningen av PUF domäner att specifikt känna igen olika RNA-mål 13, 14. Den kanoniska PUF domänen innehåller åtta upprepningar av tre a-helixar, vardera som igenkänner en enda bas i en 8-nt RNA-målet. Sidokedjorna av aminosyror vid vissa positioner för de andra α-helix bildar specifika vätebindningar med Watson-Crick-kanten av than RNA bas, som bestämmer det RNA-bindande specificiteten för varje upprepning (Figur 1A). Koden för RNA bas erkännande av PUF upprepningen är förvånansvärt enkel (figur 1 A), vilket möjliggör generering av PUF domäner som känner igen eventuella 8-baskombination (översikt av Wei och Wang 15).

Denna princip modulär design tillåter generering av en Engineered Skarvning Factor (ESF) som består av en anpassad PUF domän och en skarvningsmodule-domän (t.ex. en SR-domän eller en Gly-rika domän). Dessa ESFS kan fungera som antingen splits aktivatorer eller som inhibitorer för att styra olika typer av splitsningshändelser, och de har visat sig vara användbara som verktyg för att manipulera splitsning av endogena gener relaterade till human sjukdom 16, 17. Som ett exempel, har vi konstruerat PUF-Gly-typ ESFS att specifikt förändra splitsning av Bcl-genen, Omvandling av den anti-apoptotiska lång isoform (BcI-Xl) till pro-apoptotiska korta isoformen (Bcl-xS). Skiftning förhållandet mellan Bcl-x-isoform var tillräcklig för att sensibilisera flera cancerceller till flera anticancerkemoterapiläkemedel 16, vilket tyder på att dessa artificiella faktorer kan vara användbara som potentiella terapeutiska reagens.

Förutom att styra splitsning med kända skarvnings effektordomäner (t ex en RS eller Gly-rika domän), kan de konstruerade PUF faktorer också användas för att undersöka verksamheten i nya splitsfaktorer. Exempelvis med användning av detta tillvägagångssätt har vi visat att den C-terminala domänen av flera SR proteiner kan aktivera eller inhibera splitsning då bindning till olika pre-mRNA-områdena 18, att den alanin-rika motivet av RBM4 kan hämma splitsning 19, och att den prolinrika motiv i DAZAP1 kan förbättra skarvning 20, 21 </ Sup>. Dessa nya funktionella domäner kan användas för att konstruera ytterligare typer av konstgjorda faktorer för att finjustera skarvning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Konstruktion av en PUF Scaffold med skräddarsy RNA-bindande specificitet genom överlappande PCR

  1. Utforma en serie av PCR-primrar innehållande de PUF sekvenser som specifikt känner igen olika RNA nukleotider i varje position 12 (se tabell 1 för primersekvenserna och se figur 1 A för RNA: PUF igenkänningskoden). För varje PUF upprepa att utforma fyra olika primers känna igen en annan bas på varje position.
    OBS: Dessa primrar kommer att användas i en serie av fyra omgångar av PCR-reaktioner för att generera PUF fragment som är förenade med varandra (Figur 1 B).
  2. Välj platsen för målgenen nära den alternativa splitsstället erkännande.
    OBS: Denna sida kan beslutas av användaren, och det oftast väljs inom 10-50 nt från alternativa splitsningsställen.
  3. Runda 1: Generera kodande sekvenserför fyra PUF upprepningar, universella bro fragment och Cap fragment.
    1. Använd målplatsen för att definiera erkännande koden för varje upprepning av den anpassade PUF. Välja den uppsättning av PCR-primrar för PUF upprepar 1 - 8. Conduct fyra på varandra följande rundor av PCR för att producera en skräddarsydd PUF-domän, såsom beskrivs nedan (Figur 1 B).
    2. I den första omgången av PCR, inrättat standard PCR-reaktionsblandningar (innehållande 2,5 mikroliter av 10x buffert, 0,5 | il av 10 mM dNTP, 0,5 | il av 10 ^ M framåt och omvända primrar, 50 ng av DNA-mallen (humant cDNA eller expressionsvektor av WT PUF domän), och 0,5 U high-fidelity-DNA-polymeras i en 25 | il slutlig volym).
      OBS: Dessa reaktioner kommer att producera DNA-sekvenser som motsvarar varje PUF upprepning, till universella bryggfragment, och två lock fragment med olika restriktionsställen (Figur 1 B). En kort lista över mallar, primersOch genererade PCR-produkter som används i detta steg visas i tabell 2.
    3. Ställa in PCR-programmet enligt följande: 5 min vid 95 ° C; 28 cykler av 30 s vid 95 ° C, 30 s vid 55 ° C och 15 s vid 72 ° C; och 5 min av inkubation vid 72 ° C. Använd high-fidelity DNA-polymeras för att minimera punktmutationer under PCR.
  4. Runda 2: Generera kodande sekvenser för R1 / R2 / R3 / R4 (R1 - 4) och R5 / R6 / R7 / R8 (R5 - 8).
    1. Separera PCR-produkter erhållna i steg 1.3.3 med användning av elektrofores med en 1,5% agarosgel (25 min vid en konstant spänning av 120 V). Gel-rena alla produkter av den förväntade storleken med användning av en gel-reningskit. Använda en annan blandning av dessa produkter som mall i följande omgångar av PCR.
      OBS: Blanda tre PCR-produkter på ungefär 1: 1: 1-förhållande. De brukar inte behöver kvantifieras, så länge intensiteten av varje produkt liknar i gel.
    2. Blanda omkring 5% av de renade PCR-produkter som en temPlattan i nästa omgång av PCR. Alternativt kvantifierar de renade PCR-produkterna med en UV-Vis-spektrofotometer och använd 15 ng av varje PCR-produkt i mallblandningen.
    3. Använd renade PCR-produkter R1 / R2, R3 / R4 och Bridge 2/3 som blandade mallar och R1-F och R4-R som primers. Ställ in PCR-reaktionen som beskrivs i steg 1.3 för att erhålla överlappande PCR-produkt R1-4.
    4. Använd renade PCR-produkter R5 / R6, R7 / R8 och Bridge 6-7 som blandade mallar och R5-F och R8-R som primers för att få överlappande PCR-produkt R5-8 ( Figur 1 B ). Ställ PCR-programmet enligt följande: 5 min vid 95 ° C; 28 cykler av 30 s vid 95 ° C, 30 s vid 55 ° C och 30 s vid 72 ° C; Och 5 minuter vid 72 ° C. Gel-rena R1-4 och R5-8.
  5. Runda 3: Generera kodningssekvenser för R1 / R2 / R3 / R4 / R5 / R6 / R7 / R8 (Rl-8 utan lock).
    1. I den tredje omgången PCR användes den renade Ri-4, R5-8 och Bridge 4/5 som blandade mallar och Ri-F ochR8-R som primrar, sätt PCR-reaktionen som beskrivet i steg 1.3 för att erhålla överlappande PCR-produkt Rl-8 utan kapslar.
    2. Ställ PCR-programmet enligt följande: 5 min vid 95 ° C; 28 cykler av 30 s vid 95 ° C, 30 s vid 55 ° C och 55 s vid 72 ° C; Och 5 minuter vid 72 ° C. Gel-rena R1-8 utan kepsar.
  6. Runda 4: Generera kodningssekvenser för fullständiga PUF-domäner.
    1. I den sista omgången av PCR, med användning av den renade Ri-8 utan kapsyler och 5'-änd- och 3'-ändkapslar som blandade mallar och Cap-F och Cap-R som primrar, ställer man upp PCR-reaktionen som beskrivits i steg 1.3 För erhållande av de slutliga muterade PUF-domänerna.
    2. Ställ PCR-programmet enligt följande: 5 min vid 95 ° C; 28 cykler av 30 s vid 95 ° C, 30 s vid 55 ° C och 1 min vid 72 ° C; Och 5 minuter vid 72 ° C.
    3. Gel-rena PCR-produkterna från de slutgiltiga omprogrammerade PUF-domänerna. Använd dessa produkter för konstruktionen av ESF-expressionsplasmiden i de följande stegen. SequENCE den slutliga konstruktionen för att kontrollera de omprogrammerade sekvenser av PUF domäner.
      OBS: Cap-F kodar NLS (PPKKKRKV) mellan BamHI och Xba I-ställena och Cap-R kodar för ett stoppkodon och Sall-stället (restriktionsställen utformades för att konstruera expressionsvektorer av ESFS, figur 1 C).

2. Konstruktion av en funktionsmodul för ESFS

  1. Två strategier används vanligen för att klona funktionella moduler av ESFS (RS domäner eller Gly-rika domäner): för att amplifiera dessa domäner genom PCR med användning av total humant cDNA som mall (steg 2,2), eller för att direkt syntetisera de DNA-fragment som kodar för olika RS eller Gly-rika domäner (steg 2,3).
  2. Användningen PCR för att klona RS domäner från resterna 123 - 238 av 9G8 (NP001026854), rester 180-272 av SRP40 (NP008856), eller resterna 117 - 221 av SC35 (NP003007). Klona Gly-rika domäner från resterna 195-320 av hnRNP A1 (NP_002127), rests 203 - 353 i hnRNP A2 (NP112533), eller resterna 211 - 378 av hnRNP A3 (NP919223).
    1. Använd NCBI primer designverktyg (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) eller Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) för att utforma primers för kloning RS domäner eller Gly-rika domäner (funktionell modul av ESFS).
      OBS: Den framåtriktade primern innehåller en N-terminal FLAG tag efter Nhel-stället. Den omvända primern innehåller ett BamHI-ställe för kloning i expressionsvektorer (Fig 1 C).
    2. Ställa in standard-PCR-reaktionen, som beskrivs i steg 1,3, för att amplifiera RS eller Gly-rika domäner. Ställa in PCR-programmet enligt följande: 5 min vid 95 ° C; 28 cykler av 30 s vid 95 ° C, 30 s vid 55 ° C, och 30 s vid 72 ° C; och 5 min vid 72 ° C.
  3. Klon RS domäner eller Gly-rika domäner genom direkt DNA-syntes. Stället för att generera PCR-produkter som kodar för de effektordomäner i steg 2,2, synthestorlek en oligonukleotid som kodar för en kort-fragment RS domän (RSRSRSRSRSRS) eller en Gly-rika domänen (GYGGGGPGYGNQGGGYGGG) med användning av en kommersiell källa av DNA-oligonukleotider.

3. Konstruktion av ESF expressionsplasmider

  1. Konstruera ESF expressionsplasmiderna använder någon uttrycksvektor.
    OBS: Ett uttryck konstruera pGL-Gly-MS2 (en gåva från Dr. R. Breathnach från Institute de Biologie-CHR 11) användes ursprungligen, som kodar från N- till C-terminal, en FLAG-epitop, en Gly -rika domänen av hnRNP A1, och MS2-höljeprotein. Därför är detta expressionskonstruktion som används som ett exempel i det följande steget.
    OBS: Andra expressionsvektorer med multipla kloningsställen kan också användas, och standardkloningsstegen kommer att tillämpas för att förena fragmenten samman.
  2. Digest 1,5 ug av de expressionsplasmider (PGL-Gly-MS2) som nämns i steg 3,1 för att avlägsna MS2-höljeproteinfragmentet. Använd RESTRICtion nukleaserna BamH I och Sal I för en timme vid 37 ° C. Smälta igenkänningsmodulen av ESFS (som kodar en NLS och omprogrammeras PUF domäner, som genereras i steg 1,5) med BamH I och Sal I i samma skick.
  3. Lägga 5x laddningsfärg till restriktionsdigereringsreaktioner och långsamt elektrofores den totala volymen med en 1,5% agarosgel innehållande en DNA-gel fläck för 40 min vid 120 V. Gel-renar de spjälkade produkterna.
  4. Förbereda 10 mikroliter ligeringsreaktioner med en renad igenkänningsmodul av ESF-skär och expressionsvektor-DNA i en 3: 1-förhållande, en mikroliter av DNA-ligas och 1 yl 10 X ligeringsbuffert. Inkubera ligeringsreaktioner över natten vid 4 ° C; det resulterande konstruktet uttrycker en Gly-PUF-typ ESF (pGL-Gly-PUF) under kontroll av en CMV-promotor (Fig 1 C).
  5. Avlägsna fragment som kodar för FLAG / Gly-rika domän med Nhe I och BamH I-digerering under 1 h vid 37 ° C. Byt ut det med ett fragment som kodar för RS-domänen (genererad i steg 2.2, som också digereras av Nhe I och BamH I); Den resulterande konstruktionen uttrycker en ESF-typ av RS-PUF-typ ( Figur 1C).

4. Konstruktion av Splicing Reporter

  1. Syntetisera oligonukleotider innehållande kandidatsekvenserna ( dvs målsekvenser av PUF-domäner) flankerade av XhoI- och ApaI-ställen eller XhoI- och EcoRl-ställen. Anneal oligonukleotiderna i 5 minuter vid 55 ° C för erhållande av dubbelsträngade insatser innehållande igenkänningsställena för PUF-domäner flankerade av de sammanhängande ändarna av Xhol och Apa I eller Xho I och EcoR I ställen.
  2. Börja från en tidigare beskriven modulär splitsningsreporterare 22 , pGZ3, som innehåller två GFP-exoner separerade av en testexon (exon 12 hos human IGF2BP1, Ensembl ID ENSG00000159.217) och dess flankerande introner.
    OBS: Test exon var konstruerad med Xho I- och Apa I-ställen, som kan användas för att infoga syntetiserade oligonukleotider innehållande kandidatsekvenser (målsekvenser av PUF domäner). Detta modulära skarvning reporter (pGZ3) är anordnad genom plasmiden förvaret Add-genen.
  3. Smälta basen reportern pGZ3 (framställd i steg 4,2) med Xho I och Apa I-restriktionsendonukleaser för en timme vid 37 ° C.
  4. Gel-rena de spjälkade produkterna som beskrivs i steg 3,3.
  5. Förbereda 10 mikroliter av ligeringsreaktioner med de dubbelsträngade skär genererade i steg 4,1 och den digere pGZ3 vektorn genereras vid steg 4,4 i en 3: 1 molärt förhållande, 1 mikroliter av DNA-ligas och 1 yl 10 X ligeringsbuffert. Inkubera ligeringsreaktioner över natten vid 4 ° C för att erhålla konstruera skarvningsreportervektor pGZ3.
  6. Infoga de dubbelsträngade skär genererats i steg 4,1 in i den tidigarePublicerade journalister, pEZ-1B (med hjälp av Xho I och EcoR I-ställen) och pEZ-2F (med hjälp av Xho I och Apa I-ställen) 23 , för att erhålla den konkurrerande 5's-reportern och den konkurrerande 3'-ss-reportern, såsom beskrivs i steg 4,3-4,5.
    OBS! Båda typerna av splicing-reportrar kommer att finnas tillgängliga via Add-gen.

5. Konstruktion av lentivirala expressionsvektorer för ESF

  1. Ställ in den vanliga PCR-reaktionen som beskrivits i steg 1.3 för att amplifiera ESF: erna i full längd från de ursprungliga expressionsvektorerna (pGL-Gly-PUF eller pGL-RS-PUF) med primrar innehållande MluI / Spel- ställen. Ställ PCR-programmet enligt följande: 5 min vid 95 ° C; 28 cykler av 30 s vid 95 ° C, 30 s vid 55 ° C och 1,5 min vid 72 ° C; Och 5 minuter vid 72 ° C.
  2. Genom en matsmältningsreaktion integrerar gelrening och ligeringsreaktion ESF: erna i den lentivirala expressionsvektorn, pWPXLd, mellan Mlu Spe I-ställen, såsom beskrivs i steg 3.2-3.4.
  3. Använda standardkalciumfosfatfällningsmetoden, såsom tidigare rapporterats 24, för att generera lentivirus genom samtransfektering HEK293T celler genom att förpacka vektor, psPAX2 och pMD2.G, med antingen pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF ( vikt) (som en specificitetskontroll), eller pWPXLd-GFP (mock).
    1. Frö 5x10 6 HEK293T celler i 10 cm skålar och odla cellerna över natten i 10 ml av Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) per skål i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 . Utför transfektion när cellerna är 70-90% sammanflytande.
    2. Framställa plasmiden blandningen genom att tillsätta de tre plasmider (7,5 | j, g av förpacknings vektorn, psPAX2; 2,5 pg av pMD2.G; och 10 ^ g av antingen pWPXLd-Gly-PUF (Bcl-x), pWPXLd-Gly-PUF (wt) eller pWPXLd-GFP) till en 2 ml rör.
    3. Lägg 560 mikroliter av 0,25 M CaCl2 och 560 | il av 2x BBS lösning på 2-ml tub. Blanda försiktigt flera gånger och inkubera det i 15 min vid RT för att förbereda transfektion blandningen.
    4. Lägg alla transfektion blandningar till 10 cm rätter. Snurra skålarna försiktigt och inkubera dem över natten vid 3% CO 2 och 37 ° C.
    5. Avlägsna mediet, tillsätt 10 ml av färsk DMEM med 2% FBS till varje skål, och inkubera dem vid 10% CO 2 och 37 ° CO / N.
    6. Samla den första supernatanten från skålarna. Tillsätt 10 ml av färsk DMEM med 2% FBS till varje skål. Inkubera skålarna O / N vid 10% CO 2 och 37 ° C. Lagra supernatanten vid 4 ° C.
    7. Samla den andra supernatanten från skålarna. Pool supernatanten från den första och andra skördar. Rensa supernatanten från cellrester genom att filtrera den genom ett 0,4-pm filter. Använd klarade supernatanten direkt eller lagra den vid -80 ° C.
  4. Bestäm titer av lentivirus genom att infektera HEK293T-celler med seriespädningar av virusberedningen, såsom tidigare rapporterats 25.

6. specifikt modulera Exon integration och alternativ användning av splitsningsställen med ESFS

  1. Frö 2 x10 5 HEK293T celler i varje brunn i en 24-brunnsplatta. Odla cellerna över natten i 500 | il av DMEM kompletterat med 10% FBS i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. Blanda liposomal transfektion reagens genom att försiktigt vända flaskorna innan användning. Späd 2 mikroliter av liposomalt transfektionsreagens i 50 mikroliter av minskad serummedium. Blanda försiktigt och inkubera dem under 5 min vid RT.
  3. Späd 0,04 pg av pGL-Gly-PUF expressionsvektorer och 0,2 pg av pGZ3 reporterplasmider i 50 mikroliter av reducerat serummedium i ett sterilt rör. Späd 0,4 pg av PGL-RS-PUF expressionsvektorer och 0,2 pg av pGZ3 reporterplasmider i 50 mikroliter av reducerat serummedium i ett sterilt rör. Dilute 0,4 pg av PGL-RS-PUF expressionsvektorer och 0,2 pg av pez-1B eller PEZ-2F reporterplasmider i 50 mikroliter av reducerat serummedium i ett sterilt rör.
  4. Efter 5 min inkubation vid RT, försiktigt blanda den utspädda liposomalt transfektionsreagens som framställts i steg 6,2 med de utspädda plasmider som framställts i steg 6,3. Inkubera blandningen under 20 min vid RT.
  5. Lägga hela transfektion blandningar som innehåller expressionsvektorer och transfektionsreagens som framställts i steg 6,4 till varje brunn och inkubera i minst 12 timmar i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2.
  6. Efter 12 h i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2, kassera mediet från varje brunn och tvätta dem med 500 mikroliter av fosfatbuffrad saltlösning lösning (PBS) / brunn.
  7. Kasta PBS och tillsätt 200 mikroliter av trypsin till varje brunn. Inkubera plattan i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 under 5 min. Tillsätt 1 ml av mediet för att stoppa digestion och överföra cellerna till en steril 1,5 ml rör.
  8. Centrifugera rören för 3 min vid 5000 X g och kassera mediet. Lägga 0,5 ml RNA-extraktionsbuffert per rör att lysera cellerna genom repetitiv pipettering. Inkubera de homogeniserade prover för 5 min.
  9. För varje RNA-extraktionsbuffert behandlade provet, tillsätt 0,1 ml kloroform per 0,5 ml RNA-extraktionsbuffert. Invertera rören under 15 s och inkubera dem under 3 min vid RT.
  10. Centrifugera rören för 15 min vid 12000 xg och 4 ° C. Överför vattenfasen till ett nytt rör. Lägga 0,25 ml isopropanol per 0,5 ml av RNA-extraktionsbuffert som användes för den initiala homogeniseringen.
  11. Blanda genom att vortexa och inkubera dem vid RT under 10 min. Centrifugera rören vid 12.000 xg under 10 min vid 4 ° C. Efter centrifugering, är RNA-fällningen vanligtvis synliga på botten av röret.
  12. Kassera supernatanten och tvätta RNA-pelleten med 0,5 ml 75% etanol per 0,5 ml RNA-extraktionsbuffert.
  13. Skaka kraftigt och centrifugera det vid 7500 xg under 5 min vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och torka RNA-pelleten. Upplösa RNA i 50 | il RNas-fritt vatten.
  14. Lägg 2 mikroliter av 5U / | il DNas I, 7 mikroliter av 10x buffert och 11 | il av H2O till varje 50-mikroliter RNA-lösning. Inkubera rören vid 37 ° C under 1 h. Upphetta dem vid 70 ° C under 15 minuter för inaktivering av DNas.
  15. För varje prov, lägga till följande komponenter till ett 0,2 ml nukleasfritt rör: 1 | il av 50 | iM oligo dT, 5 mikroliter av 400 ng / | il RNA (2 jig), 1 mikroliter av 10 mM dNTP, och 3 mikroliter av H 2 O. Utför den omvända PCR.
    1. Värm blandningen till 65 ° C under 5 min och inkubera den på is under minst 2 min för att förhindra återbildningen av den sekundära strukturen. Lägga till följande komponenter till samma rör: 4 | il av 5x första strängen-buffert, 1 | il av 0,1 M DTT, 1 | il av 200 U / ^ il omvänt transkriptas, och 4 | il av H 2 </ Sub> O. Blanda genom att pipettera försiktigt upp och ned och inkubera vid 50 ° C under 60 min. Stoppa reaktionen genom upphettning vid 70 ° C under 15 min.
  16. För varje prov, lägga till följande komponenter till ett PCR-rör för att fullborda kroppen-märkt PCR: 2,5 yl 10 X PCR-buffert, 0,5 | il av 10 mM dNTP-blandning, 1 pl av 10 pM framåtriktad primer, 1 pl av 10 pM omvänd primer, 0,25 | il av 5 U / ul Taq-DNA-polymeras, 0,5 mikroliter av 25 nM Cy5-dCTP och 2 ul av cDNA som framställts i steg 6,15.
    1. Värm reaktionsblandningen till 94 ° C under 2 min för att denaturera molekylerna, utföra 25 PCR-cykler (94 ° C under 30 s, 60 ° C 30 s, och 72 ° C 30 s), håll reaktionen vid 72 ° C under 7 min, och sedan lämna det vid en 4 ° C håll.
  17. Lösa de PCR-produkter genom elektrofores genom en 10% polyakrylamidgel med en 1x Tris-bas, borsyra och EDTA (TBE) -buffert. Utför en skanning med hjälp av en fluorescensskanner. MätMängden av varje splicing isoform med användning av en densitometry-mjukvara.

7. Använd ESF för att modulera endogen Bcl-x Splicing och mäta dess effekter på apoptos

  1. Placera 2 x 10 5 HeLa-celler till varje brunn i en brunn med 24 brunnar. Växa cellerna över natten i 500 | il DMEM kompletterad med 10% FBS i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. Efter 12 timmar transfekterar cellerna med 2 μg pGL-Gly-PUF (WT) eller 0,2 μg, 1 μg och 2 μg pGL-Gly-PUF (531) (en omprogrammerad PUF-domän som känner igen Bcl-x pre- MRNA med hög affinitet, se figur 2A ).
  3. 24 h senare skörda cellerna. 1/3 av cellerna är för RNA-isoleringen och PCR-analysen (steg 6,8 - 6,17) och 2/3 är för proteinisoleringen.
  4. För Western blot-analysen koka de totala cellpellets i 2X natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) laddningsbuffert under 10 minOch sedan lösa proteinerna i en 12% SDS-PAGE-gel. Överföra proteinerna till ett nitrocellulosamembran.
  5. Blockera membranet med 5% mjölk under 1 h vid RT och inkubera membran O / N med kaspas-3 (1: 1000), PARP (1: 1000), eller beta-aktin (1: 5000) primära antikroppar (utspädda i 5% mjölk) vid 4 ° C.
  6. Tvätta membranet med PBS innehållande 0,1% Tween 20 (PBS-T) under 5 min vid RT 3x på en gungande skakapparat. Inkubera membranet med HRP-bundna antikroppar (1: 5000, utspädd i 5% mjölk) under 1 h vid RT.
  7. Tvätta membranet med PBS-T 3x vid RT, och sedan utveckla membranet med användning av ECL Western blotting detektionsreagens.
  8. Tillsätt 250 | il av poly-L-lysin (PLL) på täckglas, inkubera dem under 15 min vid RT och sifon bort vätskan. Tvätta PLL-belagda täckglas med PBS 3x för 5 min vardera. För immunofluorescensanalys mäta apoptos, frö 5 x 10 5 HeLa-celler på poly-lysin-belagda glastäckglas i en 6-brunnsplatta. transfektera pGL-Gly-PUF (WT) eller pGL-Gly-PUF (531) plasmider i HeLa-cellerna med användning av ett liposomalt transfektionsreagens (se steg 6.1-6.5).
  9. 24 timmar efter transfektionen fixera cellerna på täckglasen med 1 ml 4% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS under 20 minuter vid RT. VARNING: PFA är giftigt; Hantera det försiktigt i en avluftningsskydd.
  10. Torka försiktigt cellerna på täckglasen genom att tillsätta 2 ml 1x PBS. Inkubera dem i 5 min. Ta bort PBS med pipetter. Upprepa tvätten 3x.
  11. Permeabilisera cellerna med 0,2% Triton X-100 i 1x PBS under 10 minuter och tvätta sedan dem 3x med 1x PBS.
  12. Blockera cellerna med 3% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS under 10 minuter och tvätta dem 3x med 1x PBS.
  13. Späd FLAG-antikroppen 1: 1000 i 3% BSA / PBS och pipett 30 | il av den utspädda FLAG-antikroppen på ett parafilmark.
  14. Ta ut täckglaset med cellerna, torka noggrann bufferten med labservetter och lägg den upp och ner (cellsidan ner) på 30 μL anti-FLAG solution. Inkubera det under 1 h vid RT.
  15. Tillsätt ca 500 mikroliter av 1 x PBS till sidan av täckglaset inkuberas med den primära antikroppen, tills täckglas flyter ovanpå lösningen. Returnera den till 6-brunnar med 1x PBS i brunnarna.
  16. Tvätta den 3x med 1x PBS i 5 minuter vardera.
  17. Späda anti-mus sekundär antikropp (1: 500) i 3% BSA / PBS; igen måste du använda 30 mikroliter för varje täckglas. Sätta täckglas upp och ned på den sekundära antikroppslösningen och inkubera det i 15 min vid RT.
  18. Avlägsna täckglaset från parafilm, såsom beskrivs i steg 7,15. Lägga den tillbaka in i 6-brunnars platta och tvätta den med 1 x PBS 3x för 5 min vardera.
  19. Montera täckglasen med monteringsmedium (med DAPI), ta bort överskott mediet, och försegla kanten med nagellack.
  20. Visualisera celler med användning av ett fluorescensmikroskop (vid 100X förstoring) och fotografera dem med hjälp av en digitalkamera.
    OBS: Uttrycket av ESF visualiseras genom fluorescens-labeled sekundär antikropp mot FLAG-markör, och nukleär fragmentation visualiseras med användning av DAPI-färgning.

8. Mät Apoptos av olika cancerceller som uttrycker ESF

  1. Split 2 x 10 6 HeLa-celler, MDA-MB-231-celler och A549-celler i 60-mm skålar med 4 ml DMEM kompletterat med 10% FBS i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 för att detektera apoptos med Propidium jodid (PI) färgning.
  2. 24 timmar senare, uppdatera mediet och förbereda lentivirus, såsom tidigare rapporterats 24.
  3. Späd 10 x 10 6 lentivirus pWPXld-Gly-PUF (WT), pWPXld-Gly-PUF (531), eller pWPXld-GFP bestånd i 4 ml färskt medium för att göra förhållandet av virus till cellantalet är lika med fem.
  4. Ändra mediet i plattorna till 4 ml av virusinnehållande medium framställt i steg 8,3 och inkubera plattorna i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. 12 h efter infektionen, ändra mediet.
  5. Efter 24 timmars infektion, samla in och färga cellerna under 5 min i en PBS-lösning innehållande en slutlig koncentration av 2 | ig / ml PI.
  6. Analysera PI-färgade celler med en flödescytometer, som beskrivits tidigare 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna rapport beskriver hela protokollet för design och konstruktion av ESFS och skarvning reportrar. Den beskriver också den ytterligare tillämpning av ESFS i manipulera AS av endogena gener 16. För att illustrera typiska resultat av ESF-medierad skarvning förändringar använder vi data från vårt tidigare arbete som ett exempel. ESFS med olika funktionella domäner kan användas för att främja eller hämma införandet av målet kassett exon (Figur 1 D & E). ESFS kan också påverka användningen av alternativa 5' och 3' splitsningsställen i reportersystem (figur 1 F & G).

Den alternativa splitsning av den endogena genen kan också specifikt regleras med designade ESFS. Vi har visat det här programmet genom specifically targeting Bcl-x, som kan splitsas in i två antagonistiska isoformer med alternativa 5' splitsningsställen. Vi utformade ett ESF, Gly-PUF (531), som igenkänner ett 8-nt RNA-element mellan de alternativa 5' splitsningsställen. Denna Gly-PUF (531) skiftade specifikt skarvn mot produktion av Bcl-xS (figur 2 A). Efter transfektion av Gly-PUF (531) in i HeLa-celler, nivån av Bcl-xs isoformer och Bcl-xs-proteiner ökade på ett dosberoende sätt, medan kontroll ESF, Gly-PUF (WT), påverkade inte förhållandet av Bcl-xS till BcI-xl (fig 2 B & C). Dessutom kan konstruktören ESF inducera klyvning av kaspas 3 och poly (ADP-ribos) polymeras (PARP), två välkända molekylära markörer för apoptos (Figur 2 D). Som väntat, är formgivaren ESFS övervägande lokaliserade i kärnan av transfekterade celler, som demonstrated genom immunofluorescens-mikroskopi (Figur 2 E). Konsekvent, skarvnings skift med Gly-PUF (531) orsakade fragmentering av nukleärt DNA, vilket indikerar att dessa celler genomgår apoptos (fig 2 E). Ökningen av apoptotiska celler bekräftades ytterligare genom att undersöka mer än 200-celler från slumpmässigt valda fält och genom att kvantifiera procent av celler med fragmenterad kärn-DNA (figur 2 F).

Figur 1
Figur 1: Utformning av ESFS och deras aktivitet att modulera Exon Hoppa. (A) Specifik bindning mellan domän och RNA-mål PUF illustreras med RNA-PUF struktur och ett schematiskt diagram. PUF bindande kod för var och en avfyra RNA-baserna, som visas på höger med olika färger, används för att utforma PUF mutationer. (B) Flödesschema för att erhålla en anpassad PUF domän. Den PUF som känner igen "UGUAUAUA" användes som ett exempel. En 4-round PCR-strategi användes för att sätta samman en PUF byggnadsställning, med RNA-bindningsspecificitet (färgkodade på liknande sätt som panel A). I den första omgången, är en serie av PCR-primers som införlivar de önskade RNA-igenkänningskoder för två intilliggande PUF upprepningar används för att generera fyra fragment som inkluderar de åtta RNA-igenkänningskoder i en fullständig PUF protein (R1 / R2, R3 / R4 , R5 / R6, och R7 / R8). Cap-fragment som kodar en N-terminal kärnlokaliseringssignal, en C-terminalt stoppkodon, och bryggfragment produceras också separat (5'-änden och 3'-ändlock, bro 2/3, bro 4/5, och bro 6 / 7). I den andra omgången, är nya mallar genereras genom att blanda överlappande fragment som kodar intilliggande upprepningar med den lämpliga bryggan (t.ex. blanda R1 / R2,R3 / R4 och bro 2/3 genererar mallen för R1-4) och sträcker sig därefter med DNA-polymeras för att fylla luckorna. På samma sätt förenar den tredje rundan R1-4, R5-8 och broen 4/5. Slutligen lägger den fjärde rundan 5'-änden och 3'-änden på PUF-domänen tillsammans med kloningsställena för efterföljande kloning till expressionsvektorer. ( C ) Modulär domänorganisation av ESF. ESF-enheter drivs av CMV-promotorer (pil) och kodar, från N- till C-terminalen: en FLAG-epitop (för detektering av ESF), en funktionell modul (en Gly-rik domän eller en RS-domän), en NLS (Underlättande av nukleär lokalisering av ESF) och en RNA-igenkänningsdomän (en PUF-domän). Nhe I och BamH Jag är utformad för att infoga en funktionell modul, medan Xba I och Sal I är utformade för att infoga en RNA-igenkänningsdomän. ( D ) Gly-PUF-ESF-koder uttrycks med exon-hoppningsreporterare och splejsningsmönstret analyseras med RT-PCR. Den modifierade PUF a b specifikt binda till 8-mer mål A och B, respektive (i samma färger). Alla kombinationer används, så de PUF-mål-par av annan färg tjäna som kontrollerna. Effekterna av RS-PUF på exon hoppa (E), var den konkurrerande 5' splitsningsställe (F), eller den konkurrerande 3-splitsstället reporter (G) analyseras genom metoder som liknar panelen D. De data av RT-PCR är från Wang et al. 16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Reglering av endogen Bcl-x pre-mRNA-splitsning med ESFS. (A) Schematisk av alternativ splitsning av endogen Bclx pre-mRNA. Två alternativa 5' splitsstället i exon 2 av Bcl-x används för att generera två isoformer av olika storlekar, BcI-Xl och Bcl-xS. Sekvensen UGUGCGUG mellan de två 5' splitsningsställen är vald som ESF målet, och WT PUF upprepar 1, 3, och 5 (Q867E / Q939E / C935S / Q1011E / C1007S) är omprogrammeras (asterisker) för att känna igen denna målsekvens. Den resulterande ESF innehållande en Gly-rika domänen inhiberar användningen av den nedströms belägna 5' ss (indikeras med röd pil). (B) Modulering av Bcl-x 5' ss användning. Olika mängder av Gly-PUF (531) expressionskonstrukt transfekteras in i HeLa-celler. Gly-PUF (WT) användes som kontroll. Två isoformer av Bcl-x detekteras med RT-PCR med användning av primrar som motsvarar exoner 1 och 3 av Bcl-genen. Den procentandel av Bcl-xS isoformen kvantifieras och visas längst ner. (C) ESFS påverkar expressionsnivåerna av Bcl-xL och Bcl-xS. Prover laddas i samma ordning som i panel B, och alla proteiner are detekteras genom Western blöts. Uttrycket av ESFS detekteras av anti-FLAG-antikropp och tubulin nivån används som en kontroll. (D) Olika mängder av ESF expressionskonstrukt transfekteras in i HeLa-celler, vilket resulterar i klyvningen av PARP och kaspas 3. Prover detekteras genom Western blot-24 h efter transfektion. Aktin nivå detekteras som en kontroll. (E) Den subcellulära lokaliseringen av ESFS i transfekterade HeLa-celler detekteras genom immunofluorescens-mikroskopi med anti-FLAG-antikropp. Cellerna co-färgades med DAPI för att visa kärnan. Vissa kärnor, särskilt i celler transfekterade med Gly-PUF (531), är fragmenterade på grund av apoptos. Scale bar: 5 um. (F) Andel av apoptotiska celler (dvs. celler med fragmenterad nukleärt DNA) mäts från slumpmässigt valda områden av fluorescensmikroskopiska bilder. Staplarna visar medelvärdet, medan prickarna visar data från de två experimenten. Figurens modifieras från vår tidigare rapport från Wang et al. 16 i enlighet med den politik som Nature Publishing Group. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denna rapport ger en detaljerad beskrivning av konstruktionen och konstruktionen av artificiella splicingsfaktorer som specifikt kan manipulera den alternativa splitsningen av en målgen. Denna metod utnyttjar det unika RNA-bindnings-läget för PUF-repeter för att producera ett RNA-bindningsställ med anpassad specificitet. Det kan användas för att antingen aktivera eller undertrycka splitsning.

Det kritiska steget i detta protokoll är genereringen av den omprogrammerade PUF-domänen som definierar ESFs specificitet. Ett PCR-siktprotokoll har utvecklats och optimerats för snabb generering av PUF-ställningen. Nyckeln till framgången är att justera förhållandet mellan olika överlappande mallar till 1: 1: 1. Reningen av PCR-produkterna efter varje runda är också kritisk, eftersom orenade produkter kan ha primerförorening från den sista omgången. Ett annat viktigt steg är att analysera splitsningsförhållandet med användning av halvkvantitativ RT-PCR. Allmänt, för many amplifieringscykler bör undvikas, eftersom de kan mätta PCR-reaktionen. I våra experiment med samexpression av en skarv reporter, 20 - 25 cykler användes rutinmässigt, men detta kan variera beroende på det överflöd av mRNA vid mätning av splitsning av endogena gener. När kvantifiera splits isoformerna med användning av ett nytt par av primrar, föreslår vi att kalibrera PCR-experiment varje gång, såsom beskrivits tidigare 16.

En potentiell begränsning med designade ESFS är deras off-mål effekter eftersom specificitet bestäms av antalet upprepningar i PUF schavotten. Vildtyp PUF redovisar en 8-nt webbplats, vilket är jämförbart med specificitet en siRNA som erkänner sitt mål genom "frö match." Eftersom alla 8-nt-sekvensen skulle kunna inträffa en gång av en slump i en utskrift 65.000 nt lång (4 8 = 65.536), kommer det att finnas andra off-target avskrifter erkänts av designern PUF. Den off-target effEct kan reduceras genom att använda PUF med ytterligare upprepningar; Det är dock fortfarande användbart att utvärdera ESF: s specificitet och off-target-effekter. För att minimera potentiella off-target-effekter kan uttrycket av en kombination av flera designer-ESF-enheter på en lägre nivå också utföras. I ett sådant fall kan de off-target-generna inte påverkas av den låga delen av ESF, medan splittringen av det verkliga målet kommer att påverkas av de flera ESF som fungerar synergistiskt. Denna lösning liknar vad forskare använde vid genavstämning med RNAi, där de sammanslagna siRNA (var och en i en minskad koncentration) som riktar sig mot flera ställen i ett enda mRNA kan minska off-mål-effekterna.

Den andra huvudmetoden för att manipulera AS är att använda antisenseoligonukleotider som parar med vissa regioner i pre-mRNA. Jämfört med denna befintliga metod kan ESF orsaka långvariga effekter i stabilt transfekterade celler. Dessutom levereras in vivo av ESF kan dra nytta av den ökande arsenal av genterapivektorer, medan leveransen av antisensoligonukleotider in vivo är mycket svårt att kontrollera. Dessutom kan denna metod undvika komplicerade och kostsamma modifieringar av oligonukleotider. Med användning av olika inducerbara promotorer, kan en mer exakt kontroll av ESF-expression i de korrekta celltyper och vid korrekta tidpunkter också uppnås. Den största nackdelen med denna metod är den relativt låga specificiteten (en igenkänningsställe 8-nt kontra en 16- till 20-nt-igenkänningsstället i typiska antisensoligonukleotider).

Den dysreglering av alternativ splitsning orsakar många sjukdomar, bland annat cancer 26, 27. Genomvida studier har visat mer än 15.000 tumörassocierade splitsningsvarianter i olika typer av cancer 28, 29, 30. Exempelvis intronskarv-site mutationer av tumörsuppressorgener orsakar ofta exon-hoppa händelser och producera avvikande proteiner som kan bidra till tumörgenes 26, 31, 32. Dessutom är vissa splitsfaktorer visat sig vara överuttryckt i många cancertyper, vilket bidrar till celltransformation 33, 34, vilket indikerar att splitsfaktorer också kan spela en viktig roll i cancer biogenes. Därför, förutom att ge ett användbart verktyg för att modulera genfunktion, kan manipulering av splitsning med designade ESFS återställa misregulated splitsningshändelser i cancer, vilket således ger ett potentiellt terapeutiskt verktyg. Dessutom, genom att fusera en designer PUF domän med olika funktionella domäner, flera artificiella faktorer som manipulerar olika RNA-metabolismprocesser kan utformas. Till exempel, fusion av en translationsaktivatorn (GLD2) eller en translations repRessor (CAF1) med PUF-domänen producerade nya faktorer som kan aktivera eller hämma mRNA-översättning 27 . Genom att använda samma designprincip kombinerar vi en icke-specifik RNA-endonukleasdomän (PIN) med en serie designer PUF-domäner för att generera artificiella platsspecifika RNA-endonukleaser (ASREs) som fungerar analogt med DNA-restriktionsenzymer 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01-CA158283 och NSFC ger 31.400.726 till ZWYW finansieras av Young tusen talenter Program och National Natural Science Foundation of China (bidrag 31471235 och 81422038). XY finansieras av postdoktorala Science Foundation of China (2015M571612).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer New England Biolabs M0530L
DNA ligase (T4 DNA ligase) New England Biolabs M0202L
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) Invitrogen 11668-019
Reduced serum medium (Opti-MEM) Gibco 31985-062
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) ambion 15596018 TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling
PBS (1x) Life Technologies 10010-031
SuperScript III Reverse Transcriptase (RT) Invitrogen 18080044
Caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9668
PARP antibody Cell Signaling Technology 9542
Bcl-x antibody BD Bioscience 610211
beta-actin antibody Sigma-Aldrich A5441
alpha-tubulin antibody Sigma-Aldrich T5168
FLAG antibody Sigma-Aldrich F4042
Nitrocellulose membrane Amersham-Pharmacia RPN203D
ECL Western Blotting detection reagents Invitrogen WP20005
Cy5-dCTP GE Healthcare PA55021
Fluorescence-activated Cell Sorter (FACS) BD Bioscience FACSCalibur 
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) GE Healthcare SH30243.01
Fetal Bovine Serum (FBS) Invitrogen 26140079
Propidium iodide (PI) Sigma P4170
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7638-5G
Triton-X100 Promega H5142
Poly-L-Lysine  Sigma P-4832 Filter-sterilize and store at 4 °C
Vector pWPXLd Addgene 12258
Vector pMD2.G Addgene 12259
Vector psPAX2 Addgene 12260
DNase I (RNase-free) New England Biolabs M0303S
Oligo(dT)18 Primer Thermo Scientific SO131 
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) Cell Signaling Technology 7076S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, (7221), 470-476 (2008).
  2. Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, (12), 1413-1415 (2008).
  3. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. Rna. 14, (5), 802-813 (2008).
  4. Matera, A. G., Wang, Z. A day in the life of the spliceosome. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, (2), 108-121 (2014).
  5. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends Mol Med. 18, (8), 472-482 (2012).
  6. Wang, G. -S., Cooper, T. A. Splicing in disease: disruption of the splicing code and the decoding machinery. Nat Rev Genet. 8, (10), 749-761 (2007).
  7. Li, Y. I., et al. RNA splicing is a primary link between genetic variation and disease. Science. 352, (6285), 600-604 (2016).
  8. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nat Rev Genet. 17, (1), 19-32 (2016).
  9. Black, D. L. Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing. Annu Rev Biochem. 72, (1), 291-336 (2003).
  10. Graveley, B. R., Maniatis, T. Arginine/serine-rich domains of SR proteins can function as activators of pre-mRNA splicing. Mol cell. 1, (5), 765-771 (1998).
  11. Del Gatto-Konczak, F., Olive, M., Gesnel, M. -C., Breathnach, R. hnRNP A1 recruited to an exon in vivo can function as an exon splicing silencer. Mol Cell Biol. 19, (1), 251-260 (1999).
  12. Auweter, S. D., Oberstrass, F. C., Allain, F. H. Sequence-specific binding of single-stranded RNA: is there a code for recognition. Nucleic Acids Res. 34, (17), 4943-4959 (2006).
  13. Dong, S., et al. Specific and modular binding code for cytosine recognition in Pumilio/FBF (PUF) RNA-binding domains. J Biol Chem. 286, (30), 26732-26742 (2011).
  14. Filipovska, A., Razif, M. F., Nygård, K. K., Rackham, O. A universal code for RNA recognition by PUF proteins. Nat Chem Biol. 7, (7), 425-427 (2011).
  15. Wei, H., Wang, Z. Engineering RNA-binding proteins with diverse activities. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6, (6), 597-613 (2015).
  16. Wang, Y., Cheong, C. -G., Hall, T. M. T., Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods. 6, (11), 825-830 (2009).
  17. Choudhury, R., Tsai, Y. S., Dominguez, D., Wang, Y., Wang, Z. Engineering RNA endonucleases with customized sequence specificities. Nat Commun. 3, 1147 (2012).
  18. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nat Struct Mol Biol. 20, (1), 36-45 (2013).
  19. McCabe, B. C., Gollnick, P. Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 186, (15), 5157-5159 (2004).
  20. Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules. Nat Struct Mol Biol. 19, (10), 1044-1052 (2012).
  21. Choudhury, R., et al. The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration. Nat Commun. 5, (2014).
  22. Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (47), 18583-18588 (2007).
  23. Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control. Mol Cell. 23, (1), 61-70 (2006).
  24. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  25. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, (1), 241-245 (2006).
  26. Venables, J. P. Aberrant and alternative splicing in cancer. Cancer Res. 64, (21), 7647-7654 (2004).
  27. Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L., Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (38), 15870-15875 (2011).
  28. He, C., Zhou, F., Zuo, Z., Cheng, H., Zhou, R. A global view of cancer-specific transcript variants by subtractive transcriptome-wide analysis. PloS one. 4, (3), 4732 (2009).
  29. Venables, J. P., et al. Identification of alternative splicing markers for breast cancer. Cancer Res. 68, (22), 9525-9531 (2008).
  30. Shapiro, I., et al. An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer. PLoS Genet. 7, (8), 1002218 (2011).
  31. David, C. J., Manley, J. L. Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged. Genes Dev. 24, (21), 2343-2364 (2010).
  32. Ladomery, M. Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer. Int J Cell biol. 2013, (2013).
  33. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nat Struct Mol Biol. 14, (3), 185-193 (2007).
  34. Anczukòw, O., et al. SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer. Mol cell. 60, (1), 105-117 (2015).
Engineering Artificiella Faktorer att specifikt Manipulera alternativ splitsning i humana celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).More

Wei, H. H., Liu, Y., Wang, Y., Lu, Q., Yang, X., Li, J., Wang, Z. Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells. J. Vis. Exp. (122), e54967, doi:10.3791/54967 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter