Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل

doi: 10.3791/54968 Published: December 24, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخلايا الجذعية (DCS) هي الخلايا العارضة للمستضد المتخصصة أهم من نظام المناعة لدينا. غير ناضجة البلدان النامية (البلدان الجزرية النامية) يقيمون في الجلد أو في الأنسجة المخاطية وبالتالي هي من بين الخلايا المناعية الأولى للتفاعل مع مسببات الأمراض الغازية. وتمثل البلدان النامية الجسر بين الفطرية ونظام المناعة التكيفية لأنها يمكن أن تفعيل البائية والخلايا الردود التالية الكشف عن العوامل المسببة للأمراض. وعلاوة على ذلك، لأنها تسهم في الاستجابات المناعية الموالية للالتهابات بسبب إفراز كميات عالية من السيتوكينات، مثل IL-1β، IL-6، و IL-12. البلدان النامية أيضا تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية وجذب الخلايا المناعية الأخرى إلى موقع الإصابة التي كتبها الكيميائي.

ويمكن تقسيم البلدان النامية إلى خلايا غير ناضجة شجيري (البلدان الجزرية النامية) والخلايا الجذعية الناضجة (mDCs) 2 بناء على التشكل وظيفة. بعد الاعتراف مستضدات الخارجية من جانب واحد من العديد من مستقبلات التعرف على الأنماط (على سبيل المثال، مثل عدد المستقبلات، C-نوعيكتينس، أو تكمل مستقبلات) أعرب بوفرة على سطح الخلية، البلدان الجزرية النامية تخضع لتغييرات كبيرة وتبدأ في النضج. وخلال هذه العملية النضج، ومستقبلات لالتقاط مستضد وأسفل تنظيم، في حين أن جزيئات أساسية لتقديم المستضد ويصل ينظم 3. ناضجة البلدان النامية يصل تنظيم معقد التوافق النسيجي الكبير الأول والثاني (MHC الأول والثاني)، وشارك في تنشيطية الجزيئات مثل CD80 و CD86، التي تعتبر ضرورية لتقديم المستضد وتنشيط الخلايا اللمفاوية التائية. بالإضافة إلى ذلك، هو فعل للتعبير عن CCR7 مستقبلات chemokine على سطح الخلية، والتي تمكن من الهجرة من البلدان النامية من الأنسجة الطرفية إلى الغدد الليمفاوية. وسهلت الهجرة من قبل "المتداول" من البلدان النامية على طول يجند chemokine 19 (CCL19 / MIP-3B) وchemokine يجند 21 (CCL21 / SLC) التدرج إلى الغدد الليمفاوية 4-6.

وبعد الهجرة، mDCs تقديم المستضد تجهيزها لالسذاجة خلايا CD4 + و CD8 + T، وبالتالي رسائل كتبها هذا المؤلفtiating استجابة مناعية التكيف ضد الغازي الممرض 7. ويرتبط هذا التفاعل مع الخلايا التائية في الغدد الليمفاوية أيضا مع انتشار الفيروس 8. وكشفت الدراسات في المختبر الأخرى التي البلدان النامية التقاط بكفاءة ونقل فيروس نقص المناعة البشرية إلى خلايا T وأن هذه النتائج انتقال الى عدوى نشطة 9-12. هذه التجارب تبرز أن في الجسم الحي فيروس نقص المناعة البشرية يستغل البلدان النامية كما المكوكات من المحيط إلى الغدد الليمفاوية. خلال تقديم المستضد، البلدان النامية تفرز المحفزة الرئيسية التي تحدد شكل التفريق بين المستجيب الخلايا التائية المساعدة، وبالتالي، يتم تحديد نتائج الاستجابة المناعية كلها ضد ميكروب في هذا التفاعل جدا. وبصرف النظر عن نوع 1 (TH1) والنوع 2 (TH2) المستجيب الخلايا التائية، مجموعات فرعية أخرى من الخلايا CD4 + T المساعدة (على سبيل المثال، اكتب 17 (Th17) ونوع 22 (خلايا Th22) T) وقد وصفت، وتحريض و وقد تم التحقيق في وظيفة تماما. وتشارك البلدان النامية علاوة على ذلك فيتوليد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) 13،14. هذه الخلايا هي المثبطة للمناعة، ويمكن أن تتوقف أو أسفل تنظم تحريض أو انتشار المستجيب خلايا تي وحاسمة لتطوير مناعة والتسامح وهكذا.

وتضم البلدان النامية التقليدية الإنسان (جان تنمية المجتمعات المحلية) عدة مجموعات فرعية من الخلايا مع الأصل النخاعي (أي خلايا لانغرهانس (خطابات الاعتماد) والجلد والبلدان النامية الخلالي) أو أصل اللمفاوية (أي البلدان النامية بلازماوية الشكل (PDCS)). لفي التجارب المختبرية أو استراتيجيات التطعيم العاصمة، وتستخدم البلدان النامية الوحيدات المستمدة بشكل روتيني نموذجا للبلدان النامية عن طريق الجلد. تظهر هذه الخلايا التشابه في علم وظائف الأعضاء، مورفولوجيا، وظيفة الخلايا الجذعية الدم النخاعي التقليدية. يتم إنشاؤها من قبل إضافة انترلوكين 4 (IL-4) ومحببة بلعم تحفيز مستعمرة عامل (GM-CSF) إلى حيدات معزولة من المتبرعين الأصحاء 12،15-18. ويمكن أيضا أن الخلايا الجذعية تكون معزولة مباشرة من الجلد أو الغشاء المخاطي الخزعات، أو يمكن حتى به وضعت من CD34 + الخلايا الاصلية المكونة للدم المعزولة من عينات دم الحبل السري التي تم الحصول عليها الرحم السابقين. هنا، علينا أن نظهر كيف يتم عزل حيدات وحفز من الدم البشري مكافحة متخثر بعد خلية وحيدة النواة في الدم المحيطي (PBMC) تخصيب بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 5 أيام، وحيدات الإنسان في ظل ظروف محددة هي متباينة في البلدان الجزرية النامية ونحن على استعداد لإجراءات تجريبية في وضع غير سريري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المتبرعين بالدم المشاركة من قبل المعهد المركزي لنقل الدم وزارة المناعية، إنسبروك، النمسا: الأخلاقيات بيان. وتمت الموافقة على استخدام عينات بقايا مجهولة الهوية لأغراض علمية من قبل لجنة الأخلاقيات من كلية الطب بجامعة انسبروك.

1. إثراء خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs)

  1. تركيز PBMCs بواسطة الطرد المركزي.
    1. فتح حزمة الدم والانقسام في أنابيب معقمة 50 مل الطرد المركزي وفقا لكمية من الدم الواردة.
    2. إذا لزم الأمر، وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل لكل أنبوب مع العقيمة Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D-PBS).
    3. وضع أنابيب إلى جهاز للطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) دون فرامل.
    4. رسم من الطبقة العليا التي تحتوي البلازما والصفائح الدموية باستخدام معقم ماصة 10 مل المصلية، وترك boundarذ طبقة دون عائق.
      ملاحظة: إذا تم استخدام البلازما الذاتي بدلا من FCS لاستكمال مستنبت، يجب جمع البلازما والمعطل للحرارة في هذه الخطوة.
    5. جمع الخلايا وحيدة النواة (طبقات الحدود) من اثنين من 50 مل أنابيب الطرد المركزي ونقلها إلى أنبوب مل العقيمة 50 واحد باستخدام العقيمة 10 مل ماصة المصلية.
    6. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل لكل أنبوب باستخدام معقم مد برنامج تلفزيوني.
    7. وضع أنابيب إلى جهاز للطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 15 دقيقة في RT دون فرامل.
    8. رسم من الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والصفائح الدموية باستخدام معقم ماصة 10 مل المصلية، وترك الطبقة الحدودية دون عائق.
    9. جمع الخلايا وحيدة النواة (طبقات الحدود) من 50 مل أنابيب الطرد المركزي ونقلها إلى قسمين العقيمة 50 مل أنابيب جمع باستخدام العقيمة 10 مل ماصة المصلية.
    10. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل لكل أنبوب مع معقم مد برنامج تلفزيوني.
  2. الفصلمن PBMCs بواسطة الطرد المركزي التدرج الكثافة (الشكل 1).
    1. إعداد أربع 50 مل أنابيب وماصة 15 مل من التدرج الكثافة المتوسطة في كل أنبوب.
    2. خذ 25 مل من الخلايا المجمعة / الدم من أنبوب جمع (الخطوة 1.1.10) وتراكب بعناية متوسطة الكثافة التدرج.
    3. وضع أنابيب إلى جهاز للطرد المركزي وتدور لهم في 700 x ج لمدة 30 دقيقة في RT دون فرامل.
  3. جمع وتنقية PBMCs.
    1. رسم من الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والصفائح الدموية باستخدام معقم ماصة 10 مل المصلية، وترك طبقة PBMC دون عائق.
    2. جمع البيني PBMC من جميع الأنابيب وتجمع الخلايا في اثنين العقيمة 50 مل أنابيب باستخدام العقيمة 25 مل ماصة المصلية.
    3. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل لكل أنبوب مع معقم مد برنامج تلفزيوني. وضع أنابيب إلى جهاز للطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
    4. نضح طاف واعادة تعليقالخلايا في العقيمة مد برنامج تلفزيوني. تجميع الخلايا من كلا الأنابيب وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل مع معقم مد برنامج تلفزيوني.
    5. وضع أنابيب في أجهزة الطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
    6. نضح طاف واعادة تعليق الخلايا في العقيمة مد برنامج تلفزيوني. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل مع معقم مد برنامج تلفزيوني وماصة 50 ميكرولتر إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على 450 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني.
    7. دوامة أنبوب 1.5 مل بقوة وعد الخلايا في غرفة نويباور أو أي صك عد الخلايا الأخرى.
    8. وضع 50 مل أنابيب في أجهزة الطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.

2. عزل الخلايا وحيدة النواة التي CD14 الجزيئات المغناطيسية المضادة الإنسان

  1. وسم PBMCs مع الجزيئات المغناطيسية.
    1. ضبط تركيز PBMC إلى 8 × 10 7 خلية / مل باستخدام عازلة العزلة.
    2. دوامة جسيمات CD14 مكافحة الإنسان المغناطيسية thoroughly و إضافة 50 ميكرولتر من الجسيمات لكل 1 × 10 7 PBMCs.
    3. مزيج تعليق خلية الجسيمات بدقة واحتضان ذلك في RT لمدة 30 دقيقة.
  2. فصل الكسور الإيجابية والسلبية.
    1. ضبط حجم ما يصل الى 12 مل باستخدام عازلة العزلة.
    2. إعداد ستة أنابيب جولة القاع معقمة وماصة 2 مل من تعليق خلية الجسيمات في كل أنبوب.
    3. المكان على الفور أنابيب على المغناطيس. احتضان لهم لمدة 10 دقيقة في RT.
    4. إبقاء الأنابيب على المغناطيس ورسم بعناية قبالة طاف. وطاف يحتوي على جزء سلبي.
    5. إزالة أنبوب من المغناطيس وإضافة 2 مل من العازلة العزلة.
    6. بلطف إعادة تعليق الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا.
    7. وضع أنابيب مرة أخرى على المغناطيس. احتضان لمدة 5 دقائق على RT.
    8. إبقاء الأنابيب على المغناطيس ورسم بعناية قبالة طاف. وطاف يحتوي على جزء سلبي.
    9. إزالة الأنابيب من المغناطيس وإضافة 2 مل من العازلة العزلة إلى كل أنبوب. بلطف إعادة تعليق الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا.
    10. نقل جزء إيجابي لأنبوب 50 مل العقيمة وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل باستخدام معقم مد برنامج تلفزيوني.

3. تحفيز المعزولة وحيدات مع IL-4 و GM-CSF

  1. وضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي وأنها تدور في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
  2. نضح طاف وإعادة تعليق الخلايا في 50 مل من مد برنامج تلفزيوني.
  3. ماصة 50 ميكرولتر في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 450 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني. دوامة أنبوب 1.5 مل بقوة وعد الخلايا في غرفة نويباور أو أداة العد خلية أخرى.
  4. وضع أنبوب 50 مل في أجهزة الطرد المركزي وأنها تدور في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
    ملاحظة: إذا كان الكسر السلبي، تحتوي على الخلايا الليمفاوية في الدم الطرفية (PBLs)، ومطلوب أيضا، أداء الغسيل والفرز خطوات مماثلة لرخرطوم الكسر الإيجابي (الخطوات 3،1-3،5).
  5. ضبط تركيز الخلية إلى 1 × 10 6 / مل مستنبت قبل تحسنت (المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 10٪ FBS الحرارة المعطل و 1٪ حل الجلوتامين) وماصة 3 مل / بئر في 6 لوحات جيدة.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم الحرارة المعطل البلازما ذاتي، استبدال FCS 10٪ مع 1-5٪ البلازما الذاتي، وفقا لانشاء التجريبية.
  6. تحفيز حيدات مع المؤتلف الإنسان IL-4 (250 U / مل)، والمؤتلف الإنسان GM-CSF (1000 U / مل) من قبل pipetting السيتوكينات مباشرة في مستنبت. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  7. إعادة تنشيط الخلايا مع IL-4 (250 U / مل)، وGM-CSF (1000 U / مل) بعد 48 ساعة من قبل pipetting السيتوكينات مباشرة في مستنبت.
    ملاحظة: إذا كان هناك أي علامات على تحمض أظهره مؤشر الرقم الهيدروجيني في المتوسط، استبدال نصف المتوسط ​​مع مستنبت قبل تحسنت.
  8. الحصاد غير ناضجة الخلايا الجذعية في يوم 5 لأسفل مجرى التجارب من قبل pipetting الخلايا المستنبتة من لوحة 6 جيدا وفي أنبوب 50 مل الطرد المركزي بعد pipetting لمستنبت صعودا وهبوطا عدة مرات.
  9. عد الخلايا وصمة عار على عينة من حيدات معزولة مع أضداد الإنسان ضد CD11b، CD11c وو DC-SIGN / CD209، جنبا إلى جنب مع صبغة بقاء الخلية. لتجنب غير محددة ملزمة من الأجسام المضادة خلال تلطيخ السطح، واستخدام التيسير مستقبلات منع الكواشف أو ألبومين المصل البقري مخازن (BSA) ينصح بشدة.
  10. تحليل العينة باستخدام الصبغة بقاء الخلية، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، عن طريق أداء التدفق الخلوي لتقييم نقاء وسلامة والبلدان الجزرية النامية ولدت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

بعد الطرد المركزي من الدم المضادة للمتخثر باستخدام وسادة السكروز، وإثراء الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs) في الطور البيني على أعلى من متوسط كثافة التدرج (الشكل 1). بعد يتم رسمها PBMCs الخروج، يتم إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحديد خصائص السكان خلية مختلفة داخل PBMCs باستخدام علامات النسب (على سبيل المثال، CD3 عن الخلايا الليمفاوية T، CD14 للحيدات، وCD19 عن الخلايا الليمفاوية B). ويبين الشكل 2A نتائج تحليل FACS تمثيلية من PBMCs جمعها والملون بعد الطرد المركزي التدرج الكثافة. من السكان بوابات (الشكل 2A، مؤامرة العليا)، اكتشفنا 4.03٪ الخلايا الليمفاوية B، 28.20٪ وحيدات، و67،62٪ الخلايا الأخرى (الشكل 2A، مؤامرة المتوسطة)، منها 43.62٪ وكانت اللمفاويات التائية (الشكل 2A، وانخفاض مؤامرة ).

ثم يتم تحضين PBMCs ثإيث CD14 الجزيئات المغناطيسية، وبعد الحضانة على المغناطيس، ويتم تحليل الكسر السلبي الذي يحتوي على الخلايا الليمفاوية في الدم الطرفية (PBLs) من خلال نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام مجموعة من علامات النسب المذكورة أعلاه. مقارنة PBMCs، قمنا بقياس نسبة مماثلة من الخلايا الليمفاوية B (4.65٪، الشكل 2B، مؤامرة الوسطى)، وترتفع النسبة بين الخلايا الأخرى (88.61٪، الشكل 2B، مؤامرة الوسطى)، وخفض بشدة نسب حيدات (6.59٪، الشكل 2B ، مؤامرة الوسطى). تظاهر توصيف جزء الإيجابي (الشكل 3) كفاءة الفصل العالية، منذ نقاء خلايا معزولة أكثر من 97٪ (الشكل 3، غادر مؤامرة)، منها 99.56٪ (الشكل 3، مؤامرة اليمنى) أعرب مستويات عالية من CD14 على سطح الخلية.

IL4 وGM-CSF تحفيز حيدات لمدة 5 أيام يؤدي إلى التمايز في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات، والتي يمكن مقارنتها مع الجلد والخلايا الجذعية في التشكل، والسلوك، والتعبير مستقبلات 19. تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات في يوم 5 يبين عدد سكانها مثلي (الشكل 4، غادر مؤامرة) معربا عن مستويات عالية من CD11b، CD11c و(لا يظهر)، و C-نوع كتين DC-SIGN. لم يتم الكشف عن التعبير عن العاصمة نضوج علامة CD83 (الشكل 4، مؤامرة اليمنى)، والخلايا تفقد أيضا CD14 الوحيدات علامة (لا يظهر).

الشكل 2
الشكل 1: فصل مكونات الدم عن طريق الطرد المركزي التدرج الكثافة. يتم إثراء PBMCs في الطور البيني على أعلى من المتوسطة الفصل عن طريق الطرد المركزي التدرج الكثافة. وتظهر طبقات قبل (يسار) وبعد (يمين) الطرد المركزي. من فضلكانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تدفق cytometric تحليلات PBMCs (A) وPBLs (B). ويتم حصاد (A) PBMCs، ملطخة عن علامات النسب (الماوس المضادة للالإنسان الأجسام المضادة CD3، CD14، CD19 و)، وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. وترد المؤامرات نقطة من نتيجة ممثل. (ب) ويتميز جزء سلبي تحتوي على PBLs بواسطة علامات النسب (CD3 الماوس مكافحة الإنسان، CD14، CD19 والأجسام المضادة) وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. وترد المؤامرات نقطة من نتيجة ممثل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)

الشكل (4)
الشكل 4: تدفق cytometric يحلل الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات. يتم تحفيز حيدات لمدة 5 أيام مع IL4 وGM-CSF وملطخة عن علامات العاصمة مميزة، مثل CD11b، CD11c و(لا يظهر)، وC-نوع كتين DC-SIGN، وCD83 نضوج علامة. وترد المؤامرات نقطة من نتيجة ممثل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يصف هذا البروتوكول توليد الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات (MDDCs) من خلال عزل حيدات الإنسان من الدم المضادة للمتخثر باستخدام الفحص القائمة على جسيمات متناهية الصغر المغناطيسي. في هذا البروتوكول، ويتم تنفيذ الخطوات الطرد المركزي المنبع الإجراء العزلة الخلية، مما يؤدي إلى إثراء جزء PBMC. وعلى الرغم من فقدان الخلايا أثناء الطرد المركزي، لتراكب محتوى حزمة الدم كله على التدرج الكثافة المتوسطة يتطلب 200-300 مل من متوسطة الكثافة التدرج، وبالتالي لا يمكن اعتبار فعالة من حيث التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، في إثراء PBMCs من النتائج الطرد المركزي في السكان الخلية الأنظف، الأمر الذي يؤثر إيجابا على مرفق من الجزيئات المغناطيسية CD14 مكافحة الإنسان أثناء عملية العزل. العزلة المغناطيسي جسيمات متناهية الصغر من النتائج حيدات في عدد السكان الوحيدات قابلة للحياة، والتي يمكن استخدامها لمزيد من التمايز في المختبر لمختلف مجموعات فرعية العاصمة أو الضامة.

= "jove_content"> مزايا هذه التقنية مقارنة مع غيرها من البروتوكولات المستخدمة في الماضي، مثل تنقية بوساطة الالتزام على زراعة الأنسجة أو الأطباق البلاستيكية المغلفة الجيلاتين، هي عالية النقاء وتجانس السكان خلية معزولة، فضلا عن الراحة والسرعة. بشكل عام، فإنه من المهم العمل بسرعة ولكن بدقة عند العمل مع الخلايا من أجل تجنب التعرض لفترات طويلة لظروف غير الفسيولوجية. يتم تحسين CD14 الجزيئات المغناطيسية المضادة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول لاختيار إيجابية أو استنزاف كرات الدم البيضاء الحاملة CD14. ولذلك، فإن الجسيمات النانوية المغناطيسية ربط مباشرة إلى خلايا الفائدة ولا تتم إزالة بعد العملية. هذا يمكن أن يكون مسألة يجب أن تعالج الباحثين قبل أن يتم إجراء بعض التجارب أو التحليلات، منذ النتائج يمكن أن يتأثر أو تعديلها من قبل النانوية المغناطيسية محددة الخلية. بدلا من ذلك، تتوفر فحوصات اختيار السلبية، التي تهدف إلى استنزاف الخلايا غير المرغوب فيها وإلى kالآثار البيئية خلايا الفائدة يمسها. لتوليد MDDCs، وCD14 النانوية المغناطيسية المضادة الإنسان تستخدم لعزل حيدات تظهر أية مضاعفات، لأنه خلال التمايز في MDDCs، وحيدات حفز خلوى أسفل تنظيم مستقبلات CD14. وبالتالي، يتم إزالة الجسيمات النانوية المغناطيسية دون مزيد من شطف أو إجراءات فصل، ويتم اختبار MDDCs السلبي لCD14 التعبير مستقبلات التدفق الخلوي. منذ يستخدم مستنبت تحتوي على السفح خلال التمايز في هذا البروتوكول، MDDCs التي تم الحصول عليها هنا هي للاستخدام البحث فقط. لMDDCs في المرافق الصحية، وقد وضعت وسائل الإعلام الخاصة من دون الحاجة إلى مصل. وبالإضافة إلى ذلك، البلازما ذاتي يمكن جمعها بعد الطرد المركزي الخطوة الأولى (الخطوة 1.1.4)، الحرارة المعطل، وتستخدم في مستنبت. إلى جانب البلازما الذاتي، ويمكن أيضا أن تضاف المتاحة تجاريا البلازما البشرية إلى مستنبت لتفادي وقوع تفاعل الخلفية في فحوصات على المدى الطويل بسبب xenogenالبروتينات EIC في السفح.

بدلا من ذلك، والخلايا الجذعية يمكن أن تكون معزولة مباشرة من الجلد أو خزعات المخاطية أو يمكن تطويرها من CD34 + الخلايا الاصلية المكونة للدم المعزولة من عينات دم الحبل السري التي تم الحصول عليها الرحم السابقين.

ومع ذلك، MDDCs هي النموذج الأكثر استخداما على نطاق واسع للخلايا الجذعية، منذ عزل المباشرة من البلدان النامية من الخزعات هي أكثر تعقيدا لأداء. ويمكن أن يؤدي أيضا إلى أعداد الخلايا غير الفعالة التي غالبا ما تختلف بسبب الاختلافات في نوعية المانحة. يمكن أن تحدث مشاكل مماثلة عندما يتم إنشاؤها البلدان النامية من CD34 + الخلايا الجذعية المعزولة من دم الحبل السري.

وبالنسبة للتطبيقات المستقبلية، محرض الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) يمكن أن تستخدم بدلا من-CD14 المغناطيسي حبة عزل حيدات من الدم. مزايا استخدام iPSCs هي مجموعات فرعية العاصمة أنه ليس فقط، ولكن كل الخلايا المكونة للدم من الفائدة، يمكن أن تتولد من جهة مانحة واحدة (خلايا تي، الخلايا البائية، وNK جملتعلمي اللغة اإلنكليزية) والتي iPSCs المريض محددة يمكن استخدامها لوصف تفاعلات الخلايا المناعية ذاتي بطريقة شخصية.

الخطوة الأكثر أهمية خلال عزل حيدات هي خطوة الطرد المركزي التدرج الكثافة، منذ يتحقق الفصل الدقيق لخلايا الدم الحمراء والبيضاء فقط عندما يتم تشغيل الفرامل من أجهزة الطرد المركزي حالا. هذا يحدد نتائج كفاءة العزل أسفل تيار.

في الختام، هذا البروتوكول هو وسيلة سريعة جدا وفعالة، وفعالة من حيث التكلفة لتوليد السكان الخلية الجذعية المشتقة من الوحيدات قابلة للحياة ومتجانسة من خلال عزل حيدات الإنسان من الدم المضادة للمتخثر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 BD Biosciences 555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e BD Biosciences 551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles BD Biosciences 557769
BD Imagnet BD Biosciences 552311
BSA (Albumin Fraction V) Carl Roth EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Costar 3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Bio-Sciences 17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma-Aldrich D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet Corning 357551
Falcon 25 ml Serological Pipet Corning 357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes Corning 352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a BD Biosciences 555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) Tonbo biosciences 13-0870
GM-CSF MACS Miltenyi Biotec 130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) Gibco 10500-064
Hettich Rotanta 460R Hettich ---
IL-4 CC PromoKine C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) BD Biosciences 552362
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin VWR 211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 BD Biosciences 555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 BD Biosciences 551265
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  2. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
  3. Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
  4. Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
  5. Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
  6. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
  7. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  8. Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
  9. Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
  10. McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
  12. Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
  13. Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
  14. Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
  15. Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
  16. Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
  17. Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
  18. Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
  19. Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
جيل من الوحيدات المستمدة الخلايا الجذعية البشرية من الدم الكامل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).More

Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter