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Immunology and Infection

पूरे रक्त से मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं की पीढ़ी

doi: 10.3791/54968 Published: December 24, 2016

Introduction

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वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी) हमारी प्रतिरक्षा प्रणाली का सबसे महत्वपूर्ण विशेष प्रतिजन कोशिकाओं पेश कर रहे हैं। अपरिपक्व DCS (IDCs) त्वचा में या श्लैष्मिक ऊतकों में रहते हैं और हमलावर रोगज़नक़ों के साथ बातचीत करने के लिए पहले प्रतिरक्षा कोशिकाओं के बीच में इसलिए कर रहे हैं। डीसी, सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली 1 के बीच पुल का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्योंकि वे रोगज़नक़ पता लगाने के बाद टी और बी सेल प्रतिक्रिया सक्रिय कर सकते हैं। इसके अलावा, वे इस तरह के आईएल 1β, आईएल -6, और आईएल 12 के रूप में साइटोकिन्स की उच्च मात्रा, के स्राव के कारण समर्थक भड़काऊ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए योगदान करते हैं। डीसी भी एन.के. कोशिकाओं को सक्रिय करने और chemotaxis द्वारा संक्रमण की साइट के लिए अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं आकर्षित करती हैं।

डीसी अपरिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं (IDCs) और परिपक्व वृक्ष के समान कोशिकाओं (mDCs) 2 उनकी आकृति विज्ञान और कार्य के आधार पर बांटा जा सकता है। (कई पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स की एक जैसे, टोल की तरह रिसेप्टर्स, सी प्रकार से विदेशी एंटीजन की मान्यता के बादlectins, या रिसेप्टर्स के पूरक) बहुतायत से कोशिका की सतह पर व्यक्त की, IDCs बड़े बदलाव से गुजरना और परिपक्व करने के लिए शुरू करते हैं। इस परिपक्वता प्रक्रिया के दौरान, प्रतिजन को पकड़ने के लिए रिसेप्टर्स नीचे विनियमित कर रहे हैं, जबकि प्रतिजन प्रस्तुति के लिए आवश्यक अणुओं को विनियमित कर रहे हैं 3। परिपक्व डीसी को विनियमित प्रमुख उतक अनुरूपता परिसरों मैं और द्वितीय (एमएचसी मैं और द्वितीय), CD80 और CD86 तरह सह उत्तेजक अणु है, जो प्रतिजन प्रस्तुति और टी lymphocytes की सक्रियता के लिए आवश्यक हैं। इसके अतिरिक्त, कोशिका की सतह पर केमोकाइन रिसेप्टर CCR7 की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित किया जाता है, जो लिम्फ नोड्स के लिए परिधि के ऊतकों से डीसी के प्रवास के लिए सक्षम बनाता है। प्रवास एक केमोकाइन ligand 19 (CCL19 / एमआईपी -3 बी) और केमोकाइन ligand 21 (CCL21 / एसएलसी) ढाल लिम्फ नोड्स 4-6 करने के लिए साथ डीसी के "रोलिंग" से मदद की है।

पलायन के बाद, mDCs, सीडी 4 + और सीडी 8 + टी कोशिकाओं भोले संसाधित प्रतिजन पेश इस प्रकार पहलहमलावर रोगज़नक़ 7 के खिलाफ एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया tiating। लिम्फ नोड्स में टी कोशिकाओं के साथ यह बातचीत भी वायरस 8 के प्रसार के साथ जुड़ा हुआ है। अन्य में इन विट्रो अध्ययन से पता चला है कि डीसी कुशलता से कब्जा करने और एक जोरदार संक्रमण 9-12 में इस प्रसारण के परिणाम टी कोशिकाओं के लिए और है कि एचआईवी हस्तांतरण। इन प्रयोगों को उजागर करने के लिए लिम्फ नोड्स परिधि से शटल के रूप में है कि इन विवो एचआईवी कारनामे DCs। प्रतिजन प्रस्तुति के दौरान, डीसी कुंजी interleukins कि प्रेरक टी सहायक कोशिकाओं के भेदभाव को आकार, और इसलिए, सूक्ष्म जीव के खिलाफ पूरी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का नतीजा यह बहुत ही बातचीत में चुना गया है छिपाना। इसके अलावा टाइप 1 (Th1) और टाइप 2 से (Th2) प्रेरक टी कोशिकाओं, सीडी 4+ टी सहायक कोशिकाओं (जैसे, प्रकार 17 (Th17) और प्रकार 22 (Th22) टी कोशिकाओं) में वर्णित किया गया है में से अन्य सबसेट, और उनके प्रेरण और समारोह को अच्छी तरह से जांच की गई है। डीसी इसके अलावा में शामिल कर रहे हैंविनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) 13,14 की पीढ़ी। इन कोशिकाओं को immunosuppressive कर रहे हैं और बंद कर सकते हैं या प्रेरण या प्रेरक टी कोशिकाओं के प्रसार को नीचे विनियमित है और इस तरह प्रतिरक्षा और सहिष्णुता के विकास के लिए महत्वपूर्ण हैं।

मानव पारंपरिक DCS (CDCs) एक माइलॉयड मूल के साथ कोशिकाओं के कई सबसेट शामिल है (यानी, Langerhans कोशिकाओं (LCS) और चमड़े और मध्य DCs) या एक लसीकावत् मूल (यानी, plasmacytoid DCS (पीडीसी))। इन विट्रो प्रयोगों या डीसी टीकाकरण रणनीतियों के लिए, monocyte व्युत्पन्न DCs नियमित रूप से चमड़े का डीसी के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। इन कोशिकाओं को पारंपरिक माइलॉयड वृक्ष के समान कोशिकाओं को शरीर क्रिया विज्ञान, आकृति विज्ञान, और समारोह में समानता बताते हैं। वे स्वस्थ दाताओं 12,15-18 से अलग monocytes को इंटरल्यूकिन 4 (आईएल 4) और granulocyte बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के अलावा द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं। वृक्ष के समान कोशिकाओं को भी सीधे त्वचीय या श्लैष्मिक बायोप्सी से अलग किया जा सकता है, या भी कर सकते हैं खई CD34 + गर्भनाल रक्त पूर्व utero प्राप्त नमूनों से अलग hematopoietic पूर्वज कोशिकाओं से विकसित की है। यहाँ, हम कैसे monocytes पृथक और बाद परिधीय रक्त mononuclear सेल (PBMC) संवर्धन घनत्व ढाल centrifugation द्वारा विरोधी जमा हुआ मानव रक्त से प्रेरित कर रहे हैं प्रदर्शित करता है। 5 दिनों के लिए ऊष्मायन के बाद, विशेष परिस्थितियों में मानव monocytes IDCs में भेदभाव कर रहे हैं और एक गैर नैदानिक ​​सेटिंग में प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए तैयार हैं।

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Protocol

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आचार बयान: सूचित सहमति लिखित रक्ताधान और रोग प्रतिरक्षण विभाग, इंसब्रुक, ऑस्ट्रिया के लिए केन्द्रीय संस्थान द्वारा भाग लेने वाले सभी रक्त दाताओं से प्राप्त हुई थी। वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए गुमनाम बचे हुए नमूनों के उपयोग के इंसब्रुक के चिकित्सा विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं का संवर्धन (PBMCs)

  1. Centrifugation द्वारा PBMCs की एकाग्रता।
    1. प्राप्त रक्त की मात्रा के अनुसार बाँझ 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में रक्त पैक और विभाजन रक्त खोलें।
    2. यदि आवश्यक हो, बाँझ Dulbecco फास्फेट buffered खारा (डी पीबीएस) के साथ प्रत्येक ट्यूब के लिए 50 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें।
    3. ट्यूब एक सेंट्रीफ्यूज में रखें और ब्रेक के बिना कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए 400 XG पर उन्हें स्पिन।
    4. ऊपरी परत एक बाँझ 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग प्लाज्मा और प्लेटलेट्स युक्त बंद ड्रा, boundar छोड़नेY परत undisturbed।
      नोट: के बजाय एफसीएस ऑटोलॉगस प्लाज्मा संस्कृति के माध्यम से पूरक करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो प्लाज्मा एकत्र किया जाना चाहिए और इस चरण में गर्मी निष्क्रिय।
    5. दो 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब से mononuclear कोशिकाओं (सीमा परतों) लीजिए और उन्हें एक बाँझ 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण।
    6. बाँझ डी-पीबीएस का उपयोग कर प्रत्येक ट्यूब के लिए 50 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें।
    7. ट्यूब एक अपकेंद्रित्र में रखें और उन्हें ब्रेक के बिना आरटी पर 15 मिनट के लिए 400 XG पर स्पिन।
    8. ऊपरी परत प्लाज्मा और प्लेटलेट्स एक बाँझ 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग, सीमा परत अबाधित छोड़ने युक्त बंद ड्रा।
    9. 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब से mononuclear कोशिकाओं (सीमा परतों) लीजिए और उन्हें दो बाँझ 50 मिलीलीटर संग्रह एक बाँझ 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग ट्यूबों में हस्तांतरण।
    10. बाँझ डी पीबीएस के साथ प्रत्येक ट्यूब के लिए 50 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें।
  2. पृथक्करणघनत्व ढाल centrifugation द्वारा PBMCs की चित्रा (1)।
    1. प्रत्येक ट्यूब में चार 50 मिलीलीटर ट्यूब और घनत्व ढाल माध्यम की पिपेट 15 मिलीलीटर की तैयारी।
    2. संग्रह ट्यूब (कदम 1.1.10) से जमा कोशिकाओं / खून की 25 मिलीलीटर ले लो और ध्यान घनत्व ढाल मध्यम उपरिशायी।
    3. ट्यूब एक अपकेंद्रित्र में रखें और उन्हें ब्रेक के बिना आरटी पर 30 मिनट के लिए 700 XG पर स्पिन।
  3. संग्रह और PBMCs की शुद्धि।
    1. ऊपरी परत प्लाज्मा और प्लेटलेट्स एक बाँझ 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग, PBMC परत अबाधित छोड़ने युक्त बंद ड्रा।
    2. सभी ट्यूबों से PBMC अंतरावस्था लीजिए और एक बाँझ 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग दो बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं पूल।
    3. बाँझ डी पीबीएस के साथ प्रत्येक ट्यूब के लिए 50 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें। ट्यूब एक अपकेंद्रित्र में रखें और उन्हें ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 400 XG पर स्पिन।
    4. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और फिर से निलंबितबाँझ डी पीबीएस में कोशिकाओं। दोनों ट्यूबों से कोशिकाओं पूल और बाँझ डी पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें।
    5. नलियों सेंट्रीफ्यूज में रखें और उन्हें ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर स्पिन।
    6. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और बाँझ डी पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। डी-पीबीएस के 450 μl युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब बाँझ डी पीबीएस के साथ 50 मिलीलीटर और पिपेट 50 μl के लिए मात्रा समायोजित करें।
    7. भंवर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब सख्ती और एक Neubauer कक्ष या किसी अन्य साधन सेल गिनती में कोशिकाओं की गिनती।
    8. 50 मिलीलीटर ट्यूबों अपकेंद्रित्र में रखें और उन्हें ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर स्पिन।

विरोधी मानव CD14 चुंबकीय कणों द्वारा monocytes के 2. अलगाव

  1. चुंबकीय कणों के साथ PBMCs की लेबलिंग।
    1. 8 x 10 7 कोशिकाओं / अलगाव बफर का उपयोग मिलीलीटर PBMC एकाग्रता को समायोजित करें।
    2. भंवर विरोधी मानव CD14 चुंबकीय कणों thoroughlY और हर 1 10 x 7 PBMCs के लिए कणों के 50 μl जोड़ें।
    3. सेल-कण निलंबन अच्छी तरह मिक्स और 30 मिनट के लिए आरटी पर यह सेते हैं।
  2. सकारात्मक और नकारात्मक अंशों की जुदाई।
    1. अलगाव बफर का उपयोग 12 मिलीलीटर मात्रा को समायोजित करें।
    2. प्रत्येक ट्यूब में छह बाँझ दौर नीचे ट्यूब और सेल-कण निलंबन की पिपेट 2 मिलीलीटर तैयार करें।
    3. इसके तत्काल बाद चुंबक पर ट्यूबों जगह है। उन्हें आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. चुंबक पर ट्यूबों रखें और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद आकर्षित। सतह पर तैरनेवाला नकारात्मक अंश होता है।
    5. चुंबक से ट्यूब निकालें और अलगाव बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    6. धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    7. नलियों चुंबक पर वापस प्लेस। आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    8. चुंबक पर ट्यूबों रखें और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला बंद आकर्षित। सतह पर तैरनेवाला नकारात्मक अंश होता है।
    9. चुंबक से ट्यूबों निकालें और प्रत्येक ट्यूब अलगाव बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
    10. एक बाँझ 50 मिलीलीटर ट्यूब को सकारात्मक अंश स्थानांतरण और बाँझ डी-पीबीएस का उपयोग करने के लिए 50 मिलीलीटर की मात्रा समायोजित करें।

आईएल 4 और जीएम-सीएसएफ के साथ अलग monocytes के 3. उत्तेजना

  1. ट्यूब सेंट्रीफ्यूज में रखें और यह ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर स्पिन।
  2. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और डी पीबीएस के 50 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित।
  3. डी-पीबीएस के 450 μl युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पिपेट 50 μl। भंवर 1.5 मिलीलीटर ट्यूब सख्ती और एक Neubauer कक्ष या अन्य सेल गिनती साधन में कोशिकाओं की गिनती।
  4. 50 मिलीलीटर ट्यूब अपकेंद्रित्र में रखें और यह ब्रेक के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 XG पर स्पिन।
    नोट: नकारात्मक अंश, परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों (PBLs) से युक्त है, यह भी आवश्यक है, धोने के प्रदर्शन और उनकी गिनती के इसी तरह के कदम के लिए टीसकारात्मक अंश की नली (3.1-3.5 कदम)।
  5. 1 एक्स 10 6 मिलीग्राम / करने के लिए सेल एकाग्रता पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से (1640 RPMI मध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय FBS और 1% एल Glutamine समाधान के साथ पूरक) और पिपेट 3 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटों में से समायोजित करें।
    नोट: गर्मी निष्क्रिय ऑटोलॉगस प्लाज्मा का उपयोग करते हैं, तो 1-5% ऑटोलॉगस प्लाज्मा के साथ 10% एफसीएस की जगह है, प्रयोगात्मक सेट अप के अनुसार।
  6. साइटोकिन्स संस्कृति के माध्यम में सीधे pipetting द्वारा पुनः संयोजक मानव आईएल 4 (250 यू / एमएल) और पुनः संयोजक मानव जीएम-सीएसएफ (1,000 यू / एमएल) के साथ monocytes उत्तेजित। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं और 5% सीओ 2।
  7. साइटोकिन्स संस्कृति के माध्यम में सीधे pipetting द्वारा 48 घंटे के बाद आईएल 4 (250 यू / एमएल) और जीएम-सीएसएफ (1000 यू / एमएल) के साथ कोशिकाओं को फिर से उत्तेजित।
    नोट: यदि वहाँ माध्यम में पीएच सूचक द्वारा दिखाए गए अम्लीकरण के किसी भी संकेत मिल रहे हैं, पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से मध्यम के आधे की जगह।
  8. फसल के लिए 5 दिन पर वृक्ष के समान कोशिकाओं अपरिपक्वनीचे धारा 6 अच्छी तरह से थाली के बाहर और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में संस्कृति के माध्यम से ऊपर pipetting के बाद और एक बार कुछ नीचे संवर्धित कोशिकाओं pipetting द्वारा प्रयोगों।
  9. कोशिकाओं की गणना और CD11b, CD11c के खिलाफ विरोधी मानव एंटीबॉडी के साथ अलग monocytes का एक नमूना दाग, और डीसी साइन इन करें / CD209, एक साथ एक सेल व्यवहार्यता डाई के साथ। सतह धुंधला दौरान unspecific एंटीबॉडी के बंधन से बचने के लिए, अभिकर्मकों या गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) बफ़र्स अवरुद्ध एफसी रिसेप्टर के उपयोग अत्यधिक की सिफारिश की है।
  10. नमूना सेल व्यवहार्यता डाई का उपयोग का विश्लेषण करें, निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, प्रवाह cytometry पवित्रता और उत्पन्न IDCs की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए प्रदर्शन से।

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Representative Results

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विरोधी जमा हुआ रक्त एक सुक्रोज तकिया का उपयोग कर के बाद centrifugation, परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) घनत्व ढाल मध्यम (चित्रा 1) के शीर्ष पर एक interphase में समृद्ध कर रहे हैं। बाद PBMCs बंद तैयार कर रहे हैं, FACS विश्लेषण वंश मार्कर का उपयोग PBMCs (जैसे, CD3 टी lymphocytes के लिए, monocytes के लिए CD14, और बी लिम्फोसाइटों के लिए CD19) के भीतर अलग-अलग सेल आबादी को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। चित्रा 2A एकत्र की है और घनत्व ढाल centrifugation के बाद दाग PBMCs के एक प्रतिनिधि FACS विश्लेषण के परिणामों से पता चलता है। गेटेड आबादी (2A चित्रा, ऊपरी साजिश) से बाहर है, हम 4.03% बी लिम्फोसाइट, 28.20% monocytes, और 67.62% अन्य कोशिकाओं (चित्रा 2A, मध्य साजिश), जिसमें से 43.62% टी lymphocytes थे (2A चित्रा का पता चला है, कम साजिश )।

PBMCs तो डब्ल्यू incubated हैंith CD14 चुंबकीय कणों और एक चुंबक पर ऊष्मायन के बाद,, नकारात्मक परिधीय रक्त लिम्फोसाइटों (PBLs) युक्त अंश उपरोक्त वंश मार्करों के चयन का उपयोग FACS द्वारा विश्लेषण किया है। PBMCs की तुलना में, हम, बी लिम्फोसाइटों (4.65%, चित्रा 2 बी, मध्य साजिश) के समान प्रतिशत अन्य कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत (88.61%, चित्रा 2 बी, मध्य साजिश), और monocytes की दृढ़ता से कम प्रतिशत मापा (6.59%, चित्रा 2 बी , मध्य साजिश)। सकारात्मक अंश (चित्रा 3) की विशेषता है, एक उच्च जुदाई दक्षता का प्रदर्शन के बाद से अलग कक्षों की शुद्धता 97% (चित्रा 3, छोड़ साजिश), जो 99.56% की (चित्रा 3, सही साजिश) खत्म हो गया है CD14 के उच्च स्तर व्यक्त कोशिका की सतह पर।

IL4 और जीएम-सीएसएफ 5 दिनों के लिए monocytes की उत्तेजना monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान सेल में भेदभाव में यह परिणामएस, जो तुलना कर रहे हैं आकृति विज्ञान, व्यवहार, और रिसेप्टर अभिव्यक्ति 19 में वृक्ष के समान कोशिकाओं त्वचीय करने के लिए। 5 दिन पर monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं के FACS विश्लेषण एक मुताबिक़ आबादी (चित्रा 4, बाएँ साजिश) CD11b, CD11c (नहीं दिखाया गया है), और सी प्रकार लेक्टिन डीसी हस्ताक्षर के उच्च स्तर व्यक्त पता चलता है। डीसी परिपक्वता मार्कर CD83 की कोई अभिव्यक्ति (चित्रा 4, सही साजिश) का पता चला है, और कोशिकाओं को भी monocyte मार्कर CD14 (नहीं दिखाया गया है) खो देते हैं।

चित्र 2
चित्रा 1: घनत्व ढाल centrifugation द्वारा रक्त घटकों के पृथक्करण। PBMCs घनत्व ढाल centrifugation द्वारा जुदाई माध्यम के शीर्ष पर एक interphase में समृद्ध कर रहे हैं। पहले (बाएं) और बाद में (दाएं) centrifugation परतें दिखाई जाती हैं। कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रवाह cytometric PBMCs (ए) और PBLs (बी) का विश्लेषण करती है। (ए) PBMCs काटा जाता है, वंश मार्कर (माउस विरोधी मानव CD3, CD14, और CD19 एंटीबॉडी) के लिए दाग, और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया। एक प्रतिनिधि परिणाम की डॉट भूखंडों दिखाए जाते हैं। (बी) के नकारात्मक PBLs युक्त अंश वंश मार्कर (माउस विरोधी मानव CD3, CD14, और CD19 एंटीबॉडी) की विशेषता है और प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया है। एक प्रतिनिधि परिणाम की डॉट भूखंडों दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन

चित्रा 4
चित्रा 4: प्रवाह cytometric monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं का विश्लेषण करती है। Monocytes IL4 और जीएम-सीएसएफ के साथ 5 दिनों के लिए प्रेरित किया और विशेषता डीसी मार्कर, CD11b, CD11c () नहीं दिखाया, सी प्रकार लेक्टिन डीसी पर हस्ताक्षर, और परिपक्वता मार्कर CD83 तरह के दाग रहे हैं। एक प्रतिनिधि परिणाम की डॉट भूखंडों दिखाए जाते हैं।

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Discussion

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इस प्रोटोकॉल एक चुंबकीय nanoparticle आधारित परख का उपयोग विरोधी जमा हुआ रक्त से मानव monocytes के अलगाव के माध्यम से monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (MDDCs) की पीढ़ी का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल में, centrifugation कदम सेल अलगाव प्रक्रिया है, जो PBMC अंश की एक संवर्धन की ओर जाता है नदी के ऊपर प्रदर्शन कर रहे हैं। कोशिकाओं centrifugation के दौरान खो रहे हैं हालांकि, घनत्व ढाल माध्यम पर एक पूरे रक्त पैक की सामग्री मढ़ी घनत्व ढाल माध्यम की 200-300 मिलीलीटर की आवश्यकता होगी और इसलिए लागत प्रभावी नहीं माना जा सकता। इसके अतिरिक्त, एक क्लीनर सेल की आबादी है, जो सकारात्मक अलगाव की प्रक्रिया के दौरान विरोधी मानव CD14 चुंबकीय कणों की कुर्की के प्रभावों में centrifugation परिणामों से PBMCs के संवर्धन। एक व्यवहार्य एककेंद्रकश्वेतकोशिका जनसंख्या में monocytes परिणाम है, जो आगे विभिन्न डीसी सबसेट या मैक्रोफेज करने के लिए इन विट्रो भेदभाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का चुंबकीय-nanoparticle अलगाव।

वैकल्पिक रूप से, वृक्ष के समान कोशिकाओं को सीधे त्वचीय या श्लैष्मिक बायोप्सी से अलग किया जा सकता है या CD34 + गर्भनाल रक्त पूर्व utero प्राप्त नमूनों से अलग hematopoietic पूर्वज कोशिकाओं से विकसित किया जा सकता है।

बहरहाल, MDDCs, वृक्ष के समान कोशिकाओं के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल हैं, क्योंकि बायोप्सी से डीसी के प्रत्यक्ष अलगाव अधिक प्रदर्शन करने के लिए जटिल है। यह भी अक्षम सेल नंबर है कि अक्सर दाता गुणवत्ता में अंतर के कारण भिन्न हो सकता है। इसी प्रकार की समस्याओं हो सकता है जब डीसी गर्भनाल रक्त से अलग CD34 + स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न कर रहे हैं।

भविष्य अनुप्रयोगों के लिए, inducible स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) खून से monocytes के CD14 चुंबकीय मनका अलगाव के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। IPSCs का उपयोग करने का लाभ यह है कि न केवल डीसी सबसेट हैं, लेकिन ब्याज के सभी hematopoietic कोशिकाओं, एक दाता से उत्पन्न किया जा सकता (टी कोशिकाओं बी कोशिकाओं, और एन.के. गएल्स) और है कि रोगी विशेष IPSCs एक व्यक्तिगत ढंग से ऑटोलॉगस प्रतिरक्षा कोशिकाओं की बातचीत को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

के बाद से लाल और सफेद रक्त कोशिकाओं का सही जुदाई केवल जब सेंट्रीफ्यूज का ब्रेक बंद कर दिया है हासिल की है monocytes के अलगाव के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम है, घनत्व ढाल centrifugation कदम है। यह नीचे धारा अलगाव दक्षता के परिणाम को निर्धारित करता है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल विरोधी जमा हुआ रक्त से मानव monocytes के अलगाव के माध्यम से एक व्यवहार्य और समरूप monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान सेल की आबादी उत्पन्न करने के लिए एक बहुत ही तेजी से, कुशल और लागत प्रभावी तरीका है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 BD Biosciences 555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e BD Biosciences 551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles BD Biosciences 557769
BD Imagnet BD Biosciences 552311
BSA (Albumin Fraction V) Carl Roth EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Costar 3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Bio-Sciences 17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma-Aldrich D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet Corning 357551
Falcon 25 ml Serological Pipet Corning 357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes Corning 352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a BD Biosciences 555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) Tonbo biosciences 13-0870
GM-CSF MACS Miltenyi Biotec 130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) Gibco 10500-064
Hettich Rotanta 460R Hettich ---
IL-4 CC PromoKine C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) BD Biosciences 552362
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin VWR 211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 BD Biosciences 555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 BD Biosciences 551265
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020

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References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  2. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
  3. Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
  4. Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
  5. Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
  6. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
  7. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  8. Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
  9. Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
  10. McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
  12. Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
  13. Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
  14. Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
  15. Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
  16. Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
  17. Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
  18. Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
  19. Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
पूरे रक्त से मानव monocyte व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं की पीढ़ी
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Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).More

Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).

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