Introduction
Les cellules dendritiques (CD) sont les plus importantes cellules présentant des antigènes les spécialisés de notre système immunitaire. Immature PED (iDC) réside dans la peau ou dans les tissus des muqueuses et sont donc parmi les premières cellules immunitaires d'interagir avec les agents pathogènes envahisseurs. PED représentent le pont entre l'inné et le système immunitaire adaptatif 1, car ils peuvent activer des réponses T et des cellules B suite à la détection d'agents pathogènes. En outre, elles contribuent à la réponse immunitaire pro-inflammatoires en raison de la sécrétion de grandes quantités de cytokines, comme l'IL-1β, IL-6 et IL-12. DC activer également les cellules NK et d'attirer d'autres cellules immunitaires vers le site de l'infection par le chimiotactisme.
Les CD peuvent être divisés en cellules dendritiques immatures (iDC) et des cellules dendritiques matures (MDC) 2 en fonction de leur morphologie et de la fonction. Après la reconnaissance d'antigènes étrangers par l' un des nombreux récepteurs de reconnaissance des formes (par exemple, des récepteurs de type Toll, du type Cdes lectines, des récepteurs ou complément) abondamment exprimé sur la surface cellulaire, iDC subissent des changements importants et commencent à arriver à maturité. Au cours de ce processus de maturation, des récepteurs pour l' antigène de capture sont régulés à la baisse, tandis que les molécules essentielles à la présentation de l' antigène sont régulés à la hausse 3. Les DC matures réguler à la hausse les complexes majeurs d'histocompatibilité I et II (CMH I et II), les molécules co-stimulatrices telles que CD80 et CD86, qui sont essentiels pour la présentation des antigènes et l'activation des lymphocytes T. En outre, l'expression de CCR7 des récepteurs de chimiokines sur la surface cellulaire est induite, ce qui permet la migration des CD à partir des tissus périphériques vers les ganglions lymphatiques. La migration est favorisée par le "rolling" des DC le long d' un ligand de chimiokine 19 (CCL19 / MIP-3b) et un ligand de chimiokine 21 (CCL21 / SLC) Gradient aux ganglions lymphatiques 4-6.
Après la migration, mDCs présentent l'antigène traité pour naïfs cellules CD4 + et CD8 + T, ainsi ininégo- une réponse immunitaire adaptative contre l'envahisseur pathogène 7. Cette interaction avec des cellules dans les ganglions lymphatiques T est également associé à la propagation du virus 8. D' autres études in vitro ont révélé que les PED efficacement la capture et le transfert du VIH aux lymphocytes T et que cette transmission se traduit par une infection vigoureuse 9-12. Ces expériences mettent en évidence que in vivo du VIH exploite les PED comme des navettes de la périphérie vers les ganglions lymphatiques. Lors de la présentation de l'antigène, les CD sécrètent des interleukines clés qui façonnent la différenciation des cellules T auxiliaires effectrices, et par conséquent, les résultats de l'ensemble de la réponse immunitaire contre le microbe est déterminé à cette interaction très. En plus de type 1 (Th1) et de type 2 (Th2) effectrices des cellules T, d' autres sous - ensembles de cellules CD4 + T auxiliaires (par exemple, le type 17 (Th17) et le type 22 (cellules TH22) T) ont été décrits, et leur induction et fonction ont été étudiés à fond. DC sont en outre impliqués dansla génération de lymphocytes T régulateurs (Treg) 13,14. Ces cellules sont immunosuppresseur et peuvent arrêter ou réguler négativement l'induction ou la prolifération des cellules T effectrices et sont donc essentiels pour le développement de l'immunité et la tolérance.
DC classiques humaines (CDCS) comprennent plusieurs sous - ensembles de cellules ayant une origine myéloïde (ie, les cellules de Langerhans (LCS) et cutanée et DC interstitiels) ou une origine lymphoïde (ie, les DC plasmacytoïdes (pDC)). Pour les expériences in vitro ou des stratégies de vaccination DC, les DC dérivées de monocytes sont couramment utilisés comme modèle pour les PED dermiques. Ces cellules présentent des similitudes dans la physiologie, la morphologie et la fonction de cellules dendritiques myéloïdes classiques. Elles sont produites par l'addition d'interleukine 4 (IL-4) et granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) , les monocytes isolés à partir de donneurs sains 12,15-18. Les cellules dendritiques peuvent également être directement isolés à partir de biopsies cutanées ou des muqueuses, ou peut même be développé à partir de cellules CD34 + progénitrices hématopoïétiques isolées à partir d' échantillons de sang de cordon ombilical obtenues ex utero. Ici, nous montrons comment les monocytes sont isolés et stimulés du sang humain anticoagulé après que les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) enrichissement par centrifugation en gradient de densité. Après une incubation de 5 jours, les monocytes humains dans des conditions spécifiques sont différenciées en iDC et sont prêts pour les procédures expérimentales dans un cadre non clinique.
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Protocol
déclaration éthique: le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants donneurs de sang par l'Institut central de transfusion sanguine et Département Immunological, Innsbruck, Autriche. L'utilisation d'échantillons de restes anonymes à des fins scientifiques a été approuvé par le Comité d'éthique de l'Université médicale d'Innsbruck.
1. Enrichissement des cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP)
- La concentration des PBMC par centrifugation.
- Ouvrez la poche de sang et le sang fendu dans des tubes de 50 ml à centrifuger stériles selon la quantité de sang reçu.
- Si nécessaire, ajuster le volume à 50 ml pour chaque tube avec tampon phosphate salin stérile de Dulbecco (D-PBS).
- Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les à 400 xg pendant 15 min à température ambiante (RT) sans frein.
- Soutirer la couche supérieure contenant du plasma et des plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant le boundarcouche y undisturbed.
NOTE: Si le plasma autologue au lieu de FCS est utilisé pour compléter le milieu de culture, le plasma doit être recueilli et inactivé par la chaleur dans cette étape. - Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) de deux tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans un tube stérile de 50 ml en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile.
- Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube en utilisant stérile D-PBS.
- Placer les tubes dans une centrifugeuse et tourner les 400 g pendant 15 min à température ambiante sans frein.
- Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche limite non perturbée.
- Recueillir les cellules mononucléaires (couches limites) des tubes de 50 ml de centrifugeuse et les transférer dans deux tubes de 50 ml de collecte stériles en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile.
- Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS.
- Séparationdes PBMC par centrifugation à gradient de densité (figure 1).
- Préparer quatre tubes de 50 ml et la pipette 15 ml de milieu de gradient de densité dans chaque tube.
- Prélever 25 ml de cellules / sang commun du tube de collecte (étape 1.1.10) et recouvrir soigneusement le milieu de gradient de densité.
- Placer les tubes dans une centrifugeuse et de spin eux à 700 xg pendant 30 min à température ambiante sans frein.
- Collecte et purification de CMSP.
- Soutirer la couche supérieure contenant le plasma et les plaquettes en utilisant une pipette de 10 ml sérologique stérile, laissant la couche PBMC intacte.
- Collecter l'interphase PBMC de tous les tubes et mettre en commun les cellules dans deux stériles tubes de 50 ml en utilisant une pipette de 25 ml sérologique stérile.
- Réglez le volume à 50 ml pour chaque tube stérile D-PBS. Placer les tubes dans une centrifugeuse et centrifuger à 400 g eux pendant 15 min à 4 ° C avec le frein.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension leles cellules dans du PBS stérile D. Réunir les cellules des deux tubes et ajuster le volume à 50 ml avec stérile D-PBS.
- Placer les tubes dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du D-PBS stérile. Ajuster le volume à 50 ml avec du PBS stérile et D-pipette 50 ul d'un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS.
- Vortex du tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre Neubauer ou tout autre instrument de comptage cellulaire.
- Placer les tubes de 50 ml dans la centrifugeuse et centrifuger les à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
2. Isolement des monocytes par particules magnétiques CD14 anti-humain
- Étiquetage des CMSP avec des particules magnétiques.
- Ajuster la concentration des PBMC à 8 x 10 7 cellules / ml en utilisant un tampon d'isolement.
- Vortex les particules magnétiques CD14 anti-humain thoroughly et ajouter 50 ul de particules pour chaque 1 x 10 7 PBMC.
- Mélanger la suspension cellulaire de particules à fond et incuber à température ambiante pendant 30 min.
- Séparation des fractions positives et négatives.
- Réglez le volume jusqu'à 12 ml en utilisant un tampon d'isolement.
- Préparer six tubes à fond rond stériles et pipette 2 ml de la suspension cellulaire particules dans chaque tube.
- Placer immédiatement les tubes sur l'aimant. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
- Gardez les tubes sur l'aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative.
- Retirer le tube de l'aimant et ajouter 2 ml de tampon d'isolement.
- Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas.
- Placer les tubes de retour sur l'aimant. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Gardez les tubes sur l'aimant et soigneusement tirer le surnageant. Le surnageant contient la fraction négative.
- Retirer les tubes de l'aimant et ajouter 2 ml de tampon d'isolement à chaque tube. Doucement remettre en suspension les cellules par pipetage de haut en bas.
- Transférer la fraction positive à un tube stérile de 50 ml et ajuster le volume à 50 ml en utilisant stérile D-PBS.
3. La stimulation des monocytes isolés avec l'IL-4 et GM-CSF
- Placer le tube dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 50 ml de D-PBS.
- Introduire à la pipette 50 ul dans un tube de 1,5 ml contenant 450 ul de D-PBS. Vortexer le tube de 1,5 ml vigoureusement et compter les cellules dans une chambre de Neubauer ou d'un autre instrument de comptage de cellules.
- Placer le tube de 50 ml dans la centrifugeuse et le tourner à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
NOTE: Si la fraction négative, contenant des lymphocytes du sang périphérique (PBL), est également nécessaire, effectuer le lavage et le comptage des étapes similaires à ttuyau de la fraction positive (étapes 3.1-3.5). - Ajuster la concentration cellulaire à 1 x 10 6 / ml avec un milieu de culture préchauffé (milieu RPMI 1640 complété avec une solution à 10% de L-Glutamine inactivé à la chaleur et SBF à 1%) et de la pipette 3 ml / puits dans des plaques à 6 puits.
NOTE: Si vous utilisez du plasma autologue inactivé à la chaleur, remplacer le FCS avec 1-5% de plasma autologue à 10%, selon le montage expérimental. - Stimuler les monocytes avec IL-4 humaine recombinante (250 U / ml) et GM-CSF humain recombinant (1000 U / ml) par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture. Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Re-stimuler les cellules avec l'IL-4 (250 U / ml) et GM-CSF (1000 U / ml) après 48 heures par pipetage des cytokines directement dans le milieu de culture.
NOTE: S'il y a des signes d'acidification indiqués par l'indicateur de pH dans le milieu, remplacer la moitié du milieu avec un milieu de culture préchauffé. - Récolte des cellules dendritiques immatures au jour 5 pouren aval des expériences de pipetage des cellules cultivées sur la plaque de 6 puits et dans un tube centrifuge de 50 ml après pipetage le milieu de culture et à quelques reprises.
- Compter les cellules et colorer un échantillon de monocytes isolés avec des anticorps anti-CD11b humain contre, CD11c et DC-SIGN / CD209, conjointement avec un colorant de viabilité cellulaire. Afin d'éviter une liaison non spécifique des anticorps lors de la coloration de surface, l'utilisation du récepteur Fc de réactifs de blocage ou d'albumine de sérum bovin (BSA) tampons est fortement recommandée.
- Analyser l'échantillon en utilisant le colorant de viabilité des cellules, selon le protocole du fabricant, en effectuant une cytométrie de flux pour évaluer la pureté et la viabilité des iDC générés.
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Representative Results
Après centrifugation du sang anticoagulé à l' aide d' un coussin de saccharose, les cellules mononucléaires du sang périphérique (CMSP) sont enrichis en une interphase au - dessus du milieu de gradient de densité (figure 1). Une fois que les PBMC sont soutirés, l' analyse FACS est effectuée pour caractériser les différentes populations de cellules dans les PBMC en utilisant des marqueurs de la lignée (par exemple, CD3 pour les lymphocytes T, les monocytes CD14 pour et CD19 des lymphocytes B). La figure 2A présente les résultats d'une analyse FACS représentatifs des PBMC recueillies et colorées après centrifugation en gradient de densité. Sur la population fermée (Figure 2A, tracé supérieur), nous avons détecté 4,03% de lymphocytes B, 28,20% de monocytes, et 67,62% d' autres cellules (Figure 2A, tracé au milieu), dont 43,62% étaient des lymphocytes T (Figure 2A, courbe inférieure ).
PBMC sont ensuite incubés wdes particules magnétiques ième CD14 et, après incubation sur un aimant, la fraction négative contenant les lymphocytes du sang périphérique (PBL) sont analysées par FACS en utilisant la sélection de marqueurs de lignée précités. Par rapport à CMSP, nous avons mesuré des pourcentages similaires de lymphocytes B (4,65%, Figure 2B, tracé au milieu), des pourcentages plus élevés d'autres cellules (88.61 de%, Figure 2B, tracé au milieu), et les pourcentages fortement réduits de monocytes (6,59%, Figure 2B , terrain au milieu). Caractérisation de la fraction positive (figure 3) a démontré une grande efficacité de séparation, puisque la pureté des cellules isolées est plus de 97% (Figure 3, parcelle de gauche), dont 99,56% (figure 3, graphique de droite) a exprimé des niveaux élevés de CD14 sur la surface cellulaire.
IL4 et GM-CSF stimulation des monocytes pendant 5 jours se traduit par une différenciation en cellules dendritiques dérivées de monocytess, qui sont comparables à voie cutanée des cellules dendritiques dans la morphologie, le comportement et l' expression du récepteur 19. Analyse FACS des cellules dendritiques dérivées de monocytes au jour 5 montre une population homologue (Figure 4, tracé de gauche) exprimant des niveaux élevés de CD11b, CD11c (non représenté) et la lectine de type C de DC-SIGN. Aucune expression du DC marqueur de maturation CD83 est détectée (Figure 4, graphique de droite), et les cellules perdent aussi le CD14 marqueur de monocytes (non représenté).
Figure 1: La séparation des constituants du sang par centrifugation en gradient de densité. Les PBMC sont enrichies en une interphase au-dessus du milieu de séparation par centrifugation en gradient de densité. Couches avant (à gauche) et après (à droite) centrifugation sont présentés. S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Analyse cytométrique de flux des PBMC (A) et PBL (B). (A) Les PBMC sont récoltées, colorées pour les marqueurs de lignée (anticorps CD3, CD14 et CD19 de souris anti-humain), et analysées par cytométrie en flux. parcelles Dot d'un résultat représentatif sont présentés. (B) La fraction négative contenant des PBL est caractérisée par des marqueurs de lignée (CD3 de souris anti-humaine, CD14, CD19 et des anticorps) et analysées par cytométrie en flux. parcelles Dot d'un résultat représentatif sont présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: analyse cytométrie en flux de cellules dendritiques dérivées de monocytes. Les monocytes sont stimulés pendant 5 jours avec l'IL4 et du GM-CSF et colorées pour les marqueurs caractéristiques de courant continu, comme CD11b, CD11c (non représenté), la lectine de type C de DC-SIGN, CD83 et le marqueur de maturation. parcelles Dot d'un résultat représentatif sont présentés.
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Discussion
Ce protocole décrit la génération de cellules dendritiques dérivées de monocytes (MDDC) l'isolement des monocytes humains du sang anticoagulé à l'aide d'un dosage à base de nanoparticules magnétiques. Dans ce protocole, les étapes de centrifugation sont effectuées en amont de la procédure d'isolement des cellules, ce qui conduit à un enrichissement de la fraction des CMSP. Bien que les cellules sont perdues au cours de la centrifugation, pour recouvrir le contenu de tout un paquet de sang sur un milieu à gradient de densité, il faudrait 200 à 300 ml du milieu de gradient de densité et ne peut donc pas être considéré comme rentable. En outre, l'enrichissement des PBMC par les résultats de la centrifugation dans une population de cellules plus propre, ce qui influe positivement sur la fixation des particules magnétiques CD14 anti-humain au cours du processus d'isolement. L' isolement des nanoparticules magnétiques des monocytes se traduit par une population de monocytes viables, qui peuvent être en outre utilisés pour la différenciation in vitro de différents sous - ensembles à courant continu ou des macrophages.
En variante, les cellules dendritiques peuvent être directement isolés à partir de biopsies muqueuses ou par voie cutanée ou peuvent être développées à partir de cellules CD34 + progénitrices hématopoïétiques isolées à partir d' échantillons de sang de cordon ombilical obtenues ex utero.
Néanmoins, MDDCs sont le modèle le plus largement utilisé pour les cellules dendritiques, car l'isolement direct des PED à partir de biopsies est plus complexe à réaliser. Il peut aussi conduire à des nombres de cellules inefficaces qui varient souvent en raison de différences dans la qualité des donateurs. Des problèmes similaires peuvent se produire lorsque les DC sont générées à partir de cellules souches CD34 + isolées du sang du cordon ombilical.
Pour des applications futures, les cellules souches pluripotentes inductibles (CISP) pourraient être utilisés à la place du bourrelet d'isolement CD14 magnétique des monocytes provenant du sang. Les avantages de l'utilisation CSPi sont que non seulement des sous-ensembles DC, mais toutes les cellules hématopoïétiques d'intérêt, peuvent être générés à partir d'un donneur (cellules T, les cellules B et NK caunes), et que iPSCs spécifiques à un patient peuvent être utilisés pour caractériser les interactions entre les cellules immunitaires autologues de façon personnalisée.
L'étape la plus critique lors de l'isolement des monocytes est l'étape de centrifugation à gradient de densité, étant donné que la séparation précise des globules rouges et blancs est atteint que si le frein de la centrifugeuse est mis hors tension. Cela détermine le résultat de l'efficacité de l'isolement en aval.
En conclusion, ce protocole est un moyen très rapide, efficace et rentable pour générer une population de cellules dendritiques dérivées de monocytes viable et homogène grâce à l'isolement des monocytes humains du sang anti-coagulé.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25 ml Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
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