Introduction
樹状細胞（DC）は、我々の免疫系の最も重要な特殊な抗原提示細胞です。未成熟DC（iDCを）は、皮膚または粘膜組織に存在し、侵入する病原体と対話するための最初の免疫細胞の間で、したがってあります。彼らは病原体検出、次のTおよびB細胞応答を活性化することができますので、DCは、先天性および適応免疫系1との間のブリッジを表します。さらに、それらは、IL-1β、IL-6、およびIL-12などのためのサイトカインの多量の分泌の前炎症性免疫応答に寄与する。 DCはまた、NK細胞を活性化および走化性によって感染部位に他の免疫細胞を引き付けます。
DCは、未成熟樹状細胞（iDCを）とその形態および機能に基づいて、成熟樹状細胞（mDCの）2に分けることができます。多くのパターン認識受容体（ 例えば、Toll様受容体、C型の1による外来抗原の認識後レクチン、または豊富に細胞表面に発現）受容体を補完する、iDCをは大きな変化を受け、成熟し始めます。この成熟過程の間に、抗原捕獲のための受容体はダウンレギュレートされ、抗原提示に必須の分子がアップレギュレートされている一方、3。成熟DCアップレギュレート主要組織適合遺伝子複合体の抗原提示およびTリンパ球の活性化に必須であるCD80およびCD86のようなIおよびII（MHC I及びII）、共刺激分子、。さらに、細胞表面上のケモカイン受容体CCR7の発現は、リンパ節への末梢組織からのDCの移動を可能にする、誘導されます。移行は、リンパ節4-6のケモカインリガンド19（CCL19 / MIP-3B）およびケモカインリガンド21（CCL21 / SLC）の勾配に沿ってDCの「ローリング」によって促進されます。
移行後、mDCのは、このように、INI、CD4 +およびCD8 + T細胞をナイーブために処理抗原を提示します侵入病原体7に対する適応免疫応答をtiating。リンパ節におけるT細胞とのこの相互作用は、ウイルス8の広がりに関連しています。他のインビトロの研究では、DCが効率的に捕捉し、活発な感染9-12にこの送信結果T細胞へとすることをHIVを移すことを明らかにしました。これらの実験は、リンパ節への周囲からのシャトルバスとしてそのin vivoでの HIVの悪用のDCを強調表示します。抗原提示の間、DCは、エフェクターTヘルパー細胞の分化を形成し、したがって、微生物に対する全免疫応答の結果は、この非常に相互作用で決定されたキーのインターロイキンを分泌します。別にタイプ1（のTh1）および2型（Th2の）エフェクターT細胞、CD4 + Tヘルパー細胞の他のサブセット（ 例えば、タイプ17（Th17細胞）およびタイプ22（TH22）T細胞）が記載されており、それらの誘導から、および機能は徹底的に研究されてきました。 DCはさらに、に関与しています制御性T細胞（Treg）13,14の世代。これらの細胞は免疫抑制性であり、停止または誘導またはエフェクターT細胞の増殖をダウンレギュレートし、従って免疫寛容を開発するために重要であることができます。
人間従来のDC（のCDC）は、骨髄起源（ すなわち、ランゲルハンス細胞（LCS）と皮膚との間質のDC）またはリンパ系起源（ すなわち、形質のDC（pDCに））を用いた細胞のいくつかのサブセットを含みます。 インビトロ実験またはDCワクチン接種戦略は、単球由来のDCは、日常的に、皮膚のDCのモデルとして使用されています。これらの細胞は、従来の骨髄樹状細胞への生理、形態学、および機能の類似性を示します。これらは、健康なドナー12,15-18から単離された単球のインターロイキン4（IL-4）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を添加することによって生成されます。樹状細胞は、直接、皮膚または粘膜生検から単離することができる、またはできても、Beは子宮外を得た臍帯血サンプルから単離したCD34 +造血前駆細胞から開発します。ここでは、単球を単離し、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（PBMC）、濃縮した後、抗凝固処理ヒト血液から刺激される方法を示しています。 5日間インキュベートした後、特定の条件下でヒト単球は、iDCをに分化され、非臨床設定において実験手順の準備ができています。
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Protocol
倫理の声明：書面によるインフォームドコンセントは、輸血＆免疫学専攻、インスブルック、オーストリア中央研究所によってすべての参加血液ドナーから得ました。科学的な目的のために匿名残りの標本の使用はインスブルック医科大学の倫理委員会によって承認されました。
末梢血単核細胞（PBMC）の1濃縮
- 遠心分離によるPBMCの濃度。
- 受け取った血液の量に応じて滅菌50ミリリットルの遠心分離管に血液パックとスプリット血液を開きます。
- 必要に応じて、無菌のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）で各チューブのために50ミリリットルにボリュームを調整します。
- 遠心分離にチューブを配置し、ブレーキなしで室温（RT）で15分間400×gでそれらをスピン。
- boundarを残し、滅菌10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて血漿および血小板を含む上層をオフに描きますy層を乱さ。
注：代わりに、FCSの自己血漿を培養培地を補充するために使用される場合、血漿を回収しなければならず、この段階で熱不活性化。 - 2 50mlの遠心管から単核細胞（境界層）を収集し、滅菌した10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、1つの無菌50mlチューブに移します。
- 滅菌D-PBSを用いて各チューブのための50ミリリットルにボリュームを調整します。
- 遠心分離にチューブを配置し、ブレーキなしでRTで15分間、400×gでそれらをスピン。
- 邪魔されずに境界層を残し、滅菌10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて血漿および血小板を含む上層をオフに描画します。
- 50mlの遠心分離管から単核細胞（境界層）を収集し、滅菌した10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、2つの滅菌50ミリリットルのコレクションチューブに移します。
- 滅菌D-PBSで各チューブのための50ミリリットルにボリュームを調整します。
- 分離密度勾配遠心分離によりPBMCの（図1）。
- 各チューブに密度勾配媒体の4 50mlチューブおよびピペット15ミリリットルを準備します。
- コレクションチューブ（ステップ1.1.10）からプールした細胞/血液の25ミリリットルを取り、慎重に密度勾配媒体を重ねます。
- 遠心分離にチューブを配置し、ブレーキなしでRTで30分間、700×gでそれらをスピン。
- PBMCの回収および精製。
- 滅菌10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて、血漿および血小板、乱されていないPBMC層を残すことを含む上層をオフに描画します。
- すべての管からのPBMCの間期を収集し、滅菌した25ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、2つの無菌50mlチューブに細胞をプール。
- 滅菌D-PBSで各チューブのための50ミリリットルにボリュームを調整します。遠心分離にチューブを配置し、ブレーキを4℃で15分間400×gでそれらをスピン。
- 上清を吸引除去し、再懸濁滅菌D-PBSで細胞。両方の管からの細胞をプールし、滅菌D-PBSで50ミリリットルにボリュームを調整します。
- 遠心分離にチューブを配置し、ブレーキを4℃で10分間400×gでそれらをスピン。
- 上清を吸引除去し、滅菌D-PBSで細胞を再懸濁。 D-PBS450μlのを含む1.5 mlチューブに滅菌D-PBSで50mlピペットを50μlにボリュームを調整します。
- 渦1.5mlチューブ激しくノイバウアー室または他の細胞計数器で細胞を数えます。
- 遠心分離機に50ミリリットルチューブを配置し、ブレーキを4℃で10分間400×gでそれらをスピン。
抗ヒトCD14磁性粒子による単球の2の単離
- 磁性粒子とのPBMCの標識。
- 分離緩衝液を使用して8×10 7細胞/ mlのPBMCの濃度を調整します。
- 渦抗ヒトCD14磁性粒子thoroughlyおよびすべての1×10 7のPBMCのために、粒子の50μlを添加します。
- 徹底的細胞粒子懸濁液を混合し、室温で30分間静置します。
- 正と負の分画の分離。
- 分離バッファを使用して12ミリリットルにボリュームを最大に調整します。
- 各チューブに細胞粒子懸濁液の6滅菌丸底チューブ、ピペット2ミリリットルを準備します。
- すぐに磁石上にチューブを置きます。 RTで10分間それをインキュベートします。
- 磁石上にチューブを保持し、上清を注意深く取り除きます。上清は陰性画分が含まれています。
- 磁石からチューブを外し、分離バッファの2ミリリットルを追加します。
- 静かにピペッティングにより細胞を再懸濁します。
- 背面磁石にチューブを入れます。 RTで5分間インキュベートします。
- 磁石上にチューブを保持し、上清を注意深く取り除きます。上清は陰性画分が含まれています。
- 磁石からチューブを取り外し、各チューブに分離バッファの2ミリリットルを追加します。静かにピペッティングにより細胞を再懸濁します。
- 滅菌50mlチューブに陽性画分を移し、滅菌D-PBSを用いて50ミリリットルにボリュームを調整します。
IL-4およびGM-CSFと分離された単球の3刺激
- 遠心分離機の中にチューブを配置し、ブレーキを4℃で10分間400×gで、それをスピン。
- 吸引した上清とD-PBS 50ml中で細胞を再懸濁します。
- D-PBS450μlのを含む1.5 mlチューブにピペットを50μl。渦1.5mlチューブ激しくノイバウアー室または他の細胞計数器で細胞を数えます。
- 遠心分離機に50ミリリットルチューブを配置し、ブレーキを4℃で10分間400×gで、それをスピン。
注：末梢血リンパ球（PBLの）を含む陰性画分は、また、必要な場合は、洗浄を行い、カウントは、Tと同様の工程陽性画分のホース（3.1から3.5ステップ）。 - 予め温めた培地（RPMI 1640、10％熱不活性化FBSおよび1％L-グルタミン溶液を添加した培地）およびピペット3ミリリットル/ウェル、6ウェルプレートに1×10 6個 / mlに細胞濃度を調整します。
注：熱不活化自己血漿を使用している場合は、実験のセットアップに応じて1〜5％の自己血漿と10％のFCSを交換してください。 - 培養培地中に直接サイトカインをピペッティングすることによって、組換えヒトIL-4（250 U / ml）および組換えヒトGM-CSF（千U / ml）を用いて単球を刺激します。 37℃で培養し、5％CO 2。
- 培養培地中に直接サイトカインをピペッティングすることにより48時間後のIL-4（250 U / ml）およびGM-CSF（1,000 U / ml）で細胞を再刺激します。
注：培地中のpH指示薬により示される酸性化の兆候がある場合は、予め温めた培地で培地の半分を交換してください。 - 収穫はのために5日目に、樹状細胞を未成熟しました最大数回上下培地をピペッティングした後、6ウェルプレートのうち、50mlの遠心管に培養細胞をピペッティングすることにより、ダウンストリーム実験。
- 細胞をカウントし、一緒に細胞生存率色素で、のCD11b、CD11cの、およびDC-SIGN / CD209に対する抗ヒト抗体を用いて、単離された単球のサンプルを染色。表面染色時の抗体の非特異的結合を回避するために、試薬またはウシ血清アルブミン（BSA）のバッファをブロックするFc受容体の使用を強くお勧めします。
- 生成されたiDCの純度および生存率を評価するためにフローサイトメトリーを行うことにより、製造業者のプロトコルに従って、細胞生存色素を使用してサンプルを分析します。
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Representative Results
スクロースクッションを用いて抗凝固処理血液の遠心分離後、末梢血単核細胞（PBMC）は、密度勾配媒体（ 図1）の上に中間相が富化されています。 PBMCを引き出された後、FACS分析は、（Bリンパ球のために、例えば、Tリンパ球のためのCD3、単球のためのCD14、およびCD19）系列マーカーを用いたPBMC内の異なる細胞集団を特徴付けるために行われます。 図2Aは、密度勾配遠心分離後に回収し、染色したPBMCの代表的なFACS分析の結果を示します。ゲートされた人口（ 図2A、上のプロット）のうち、我々は、4.03パーセントのBリンパ球、28.20パーセントの単球、および43.62パーセントは、Tリンパ球（ 図2A、下のプロットそのうち67.62パーセント、他の細胞（ 図2A、中央のプロット）を、検出されました）。
PBMCは、次にwをインキュベートします磁石のインキュベーション後のi番目のCD14磁性粒子は、末梢血リンパ球（PBLの）を含む陰性画分は、上記の系統マーカーの選択を使用してFACSにより分析します。 6.59パーセント、 図2BをしたPBMCと比較すると、我々は、Bリンパ球（4.65パーセント、 図2B、中段プロット）、他の細胞（88.61パーセント、 図2B、中段プロット）のより高い割合の同様の割合を測定し、単球の強力減少割合（ 、中央のプロット）。陽性画分（ 図3）の特徴は、単離された細胞の純度は97％（ 図3、左のプロット）、これは99.56％で（ 図3、右のプロット）であるため、高い分離効率を実証したCD14を高レベルで発現し細胞表面上。
5日間単球のIL4およびGM-CSF刺激は、単球由来樹状細胞への分化をもたらします匹敵するのは、形態学、行動、および受容体の発現19における樹状細胞を真皮します。 5日目の単球由来樹状細胞のFACS分析は、のCD11b、CD11cの（図示せず）、およびC型レクチンDC-SIGNを高レベルで発現する相同な集団（ 図4、左のプロット）を示しています。 DC成熟マーカーCD83の発現は（ 図4、右のプロット）が検出されず、細胞は、単球マーカーCD14（図示せず）を失います。
図1：密度勾配遠心分離により血液成分の分離。 PBMCを密度勾配遠心分離により分離媒体の上に相間に富んでいます。 （左）と後（右）遠心分離前の層が示されています。 お願いしますこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：フローサイトメトリーは、PBMCを（A）とのPBL（B）の分析します。 （A）PBMCを回収系統マーカー（マウス抗ヒトCD3、CD14、およびCD19抗体）について染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析します。代表的な結果のドットプロットが示されています。 （B）のPBLを含む陰性画分は系統マーカー（マウス抗ヒトCD3、CD14、およびCD19抗体）を特徴とし、フローサイトメトリーにより分析します。代表的な結果のドットプロットが示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： フローサイトメトリーは、単球由来樹状細胞の解析します。単球は、IL4およびGM-CSFで5日間刺激し、特性のCD11b、CD11cの（図示せず）のようなDCマーカー、C型レクチンDC-SIGN、および成熟マーカーCD83について染色されています。代表的な結果のドットプロットが示されています。
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Discussion
このプロトコルは、磁性ナノ粒子ベースのアッセイを用いて抗凝固血液からヒト単球の単離を通して単球由来樹状細胞（MDDCs）の生成を説明しています。このプロトコルでは、遠心分離工程は、PBMC画分の濃縮につながる細胞単離手順、上流で行われます。細胞を遠心分離中に失われているが、密度勾配媒体200〜300ミリリットル必要とする密度勾配媒体の全血パックの内容をオーバーレイし、したがって、コスト効率的と考えることができません。また、積極的分離プロセス中に抗ヒトCD14磁性粒子の付着に影響クリーナー細胞集団における遠心分離結果のPBMCの濃縮。さらに、様々なDCサブセットまたはマクロファージのインビトロ分化のために使用することができる生存可能な単球集団における単球結果、磁性ナノ粒子の分離。
あるいは、樹状細胞は、直接、皮膚または粘膜生検から単離することができ、またはex子宮を得た臍帯血サンプルから単離されたCD34 +造血前駆細胞から開発することができます。
生検からのDCの直接単離が実行するより複雑であるので、それにもかかわらず、MDDCsは、樹状細胞のために最も広く使用されているモデルです。それはまた、多くの場合、ドナーの品質の違いによる変化する非効率的な細胞数をもたらすことができます。 DCは、臍帯血から単離されたCD34 +幹細胞から生成された場合にも同様の問題が発生することができます。
将来のアプリケーションのために、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）は、代わりに、血液からの単球のCD14磁気ビーズ分離を使用することができます。 iPS細胞を使用する利点は、DCサブセットが、関心のあるすべての造血細胞だけでなく、一人のドナー（T細胞、B細胞、およびNK Cから生成することができることですells）その患者特有の性IPSCは、パーソナライズされた方法で自己免疫細胞の相互作用を特徴付けるために使用することができます。
遠心分離機のブレーキをオフにすると、赤と白の血液細胞の正確な分離のみ達成されるので、単球の単離の間に最も重要なステップは、密度勾配遠心分離工程です。これは、ダウンストリームの分離効率の結果を決定します。
結論として、このプロトコルは、抗凝固血液からヒト単球の単離を通じて実行可能で均質な単球由来樹状細胞集団を生成するために、非常に、高速で効率的、かつ費用対効果の高い方法です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25 ml Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
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