Introduction
Dendrittiske celler (DCS) er de viktigste spesialiserte antigenpresenterende celler i immunforsvaret vårt. Umodne DC (IDCS) bor i huden eller i slimhinnene vev og er derfor blant de første immunceller til å samhandle med invaderende patogener. DC representerer bro mellom det medfødte og det adaptive immunsystemet 1, siden de kan aktivere T- og B-celle responser etter deteksjon av patogen. Videre bidrar de til pro-inflammatoriske immunrespons på grunn av sekresjon av høye mengder av cytokiner, slik som IL-1β, IL-6 og IL-12. DCs aktiverer også NK-celler og tiltrekke seg andre immunceller til stedet for infeksjon av chemotaxis.
DC kan deles inn i umodne dendrittceller (IDCS) og modne dendrittiske celler (mDCs) 2 basert på deres morfologi og funksjon. Etter erkjennelsen av fremmede antigener ved en av de mange mønstergjenkjenning reseptorer (f.eks toll-like reseptorene, C-typelektiner, reseptorer eller komplement) rikelig uttrykt på celleoverflaten, IDCS gjennomgå store forandringer og begynner å modnes. Under denne modningsprosess, er reseptorer for antigenerobring nedregulert, mens molekyler avgjørende for antigen presentasjon er oppregulert tre. Moden DCs up-regulere vevstypeantigen I og II (MHC I og II), co-stimulerende molekyler som CD80 og CD86, som er avgjørende for antigen presentasjon og aktivering av T-lymfocytter. I tillegg er ekspresjonen av kjemokinreseptoren CCR7 på celleoverflaten induseres, som muliggjør vandring av DC fra perifere vev til lymfeknutene. Migrasjonen er tilrettelagt av å "rulle" av DCs langs en chemokin ligand 19 (CCL19 / MIP-3b) og chemokin ligand 21 (CCL21 / SLC) gradient til lymfeknuter 4-6.
Etter migrasjon, mDCs presentere behandlet antigen til naive CD4 + og CD8 + T-celler, og dermed iniforhandle en adaptiv immunrespons mot invaderende patogen 7. Denne interaksjonen med T-celler i lymfeknutene er også forbundet med spredningen av viruset 8. Andre in vitro studier viste at DC effektivt fange og overføre HIV til T-celler, og at denne overføringen resulterer i en kraftig infeksjon 9-12. Disse eksperimentene markere at in vivo HIV utnytter DC som skyttelbussene fra periferien til lymfeknutene. Under antigen presentasjon, DCs utsondre nøkkel interleukiner som former differensiering av effektor T-hjelpeceller, og derfor er utfallet av hele immunrespons mot mikroben fastsatt i dette samspillet. Bortsett fra type 1 (Th1) og type 2 (Th2) effektor T-celler, andre undergrupper av CD4 + T-hjelpeceller (f.eks, type 17 (Th17) og type 22 (Th22) T-celler) har blitt beskrevet, og deres induksjon og funksjonen har blitt grundig undersøkt. DC er dessuten involvert igenerering av regulatoriske T-celler (tregs) 13,14. Disse cellene er immunundertrykkende og kan stoppe eller ned-regulere induksjon eller proliferasjon av effektor-T-celler og er således avgjørende for utvikling av immunitet og toleranse.
Menneskekonvensjonelle DC (CDC) omfatter flere undergrupper av celler med en myeloid opprinnelse (dvs. Langerhans-celler (LCS) og dermal og interstitiell DCs) eller en lymfoid opprinnelse (dvs. plasmacytoid DC (PDCs)). For in vitro eksperimenter eller DC vaksinasjonsstrategier, er moncyttavledede DC rutinemessig brukt som modell for dermal DC. Disse cellene viser likheter i fysiologi, morfologi, og funksjonen til vanlige myeloide dendrittiske celler. De er dannet ved tilsetning av interleukin 4 (IL-4) og granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) til monocytter ble isolert fra friske donorer 12,15-18. Dendrittiske celler kan også bli direkte isolert fra dermal eller slimhinne biopsier, eller kan til og med be utviklet seg fra CD34 + hematopoetiske stamceller isolert fra navlestreng blodprøver innhentet ex utero. Her viser vi hvordan monocytter blir isolert og stimulert fra anti-koagulert humant blod etter perifert blod mononukleære celler (PBMC) anrikning av tetthetsgradient-sentrifugering. Etter inkubasjon i 5 dager, humane monocytter under spesielle forhold er differensiert i IDCS og er klar for eksperimentelle prosedyrer i en ikke-klinisk setting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle deltakende blodgivere ved Sentralinstitutt for blodoverføring og Immunologisk Institutt, Innsbruck, Østerrike. Bruk av anonymiserte left prøver for vitenskapelige formål ble godkjent av etikkomiteen ved Medical University of Innsbruck.
1. Anrikning av perifere mononukleære blodceller (PBMC)
- Konsentrasjon av PBMC ved sentrifugering.
- Åpne blod-pakken og delt blod i sterile 50 ml sentrifugerør i henhold til mengden av blod mottatt.
- Om nødvendig, justere volumet til 50 ml for hvert rør med sterilt Dulbeccos Phosphate-saltvann (D-PBS).
- Plasser rørene inn i en sentrifuge og spinne dem ved 400 xg i 15 minutter ved romtemperatur (RT) uten brems.
- Trekke ut det øvre lag inneholdende plasma og blodplater ved hjelp av en steril 10 ml serologisk pipette, slik at grenselinjeny lag uforstyrret.
MERK: Hvis autologt plasma istedenfor FCS brukes til å supplere kulturmediet, må plasmaet samles og varme-inaktivert i dette trinnet. - Samle mononukleære celler (grensesjikt) fra to 50 ml sentrifugerør og overføre dem til en steril 50 ml tube med en steril 10 ml serologisk pipette.
- Juster volumet til 50 ml for hvert rør ved hjelp av steril D-PBS.
- Plasser rørene inn i en sentrifuge og spinne dem ved 400 xg i 15 min ved romtemperatur uten brems.
- Trekke ut det øvre lag inneholdende plasma og blodplater ved hjelp av en steril 10 ml serologisk pipette, slik at grensesjiktet uforstyrret.
- Samle mononukleære celler (grensesjikt) fra 50 ml sentrifugerør og overføre dem til to sterile 50 ml samling rør ved hjelp av en steril 10 ml serologisk pipette.
- Juster volumet til 50 ml for hvert rør med sterilt D-PBS.
- Atskillelseav PBMC ved tetthetsgradient-sentrifugering (figur 1).
- Fremstille fire 50 ml rør og pipette 15 ml densitetsgradient medium inn i hvert rør.
- Ta 25 ml oppsamlet celler / blod fra oppsamlingsrøret (trinn 1.1.10) og forsiktig overlappe densitetsgradient medium.
- Plasser rørene inn i en sentrifuge og spinne dem ved 700 xg i 30 minutter ved romtemperatur uten brems.
- Oppsamling og rensing av PBMC.
- Trekke ut det øvre lag inneholdende plasma og blodplater ved hjelp av en steril 10 ml serologisk pipette, slik at den PBMC-lag uforstyrret.
- Samle PBMC inter fra alle rør og basseng cellene i to sterile 50 ml rør med en steril 25 ml serologisk pipette.
- Juster volumet til 50 ml for hvert rør med sterilt D-PBS. Plasser rørene inn i en sentrifuge og spinne dem ved 400 xg i 15 min ved 4 ° C med bremsen.
- Aspirer supernatanten og re-suspendereceller i sterile D-PBS. Pool cellene fra både rør og justere volumet til 50 ml med steril D-PBS.
- Plasser rørene inn i sentrifugen og spinne dem ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med brems.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere cellene i steril D-PBS. Juster volumet til 50 ml med steril D-PBS og pipette 50 mL til et 1,5 ml tube inneholder 450 mL av D-PBS.
- Vortex 1,5 ml rør kraftig og telle cellene i et Neubauer kammer eller hvilken som helst annen celle telleinstrument.
- Plasser 50 ml rør inn i sentrifugen og spinne dem ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med brems.
2. Isolering av monocytter ved anti-human CD14 magnetiske partikler
- Merking av PBMC med magnetiske partikler.
- Juster PBMC konsentrasjon til 8 x 10 7 celler / ml ved hjelp av isolasjonsbuffer.
- Vortex anti-human CD14 magnetiske partikler thoroughly og tilsett 50 mL av partikler for hver 1 x 10 7 PBMC.
- Bland celle-partikkelsuspensjon grundig og inkuberes det ved RT i 30 min.
- Separasjon av de positive og negative fraksjoner.
- Juster volumet opp til 12 ml ved hjelp av isolasjon buffer.
- Fremstille seks sterile rundbunnet rør og pipettes 2 ml av den celle-partikkel-suspensjonen i hvert rør.
- Umiddelbart rørene på magnet. Inkubere dem i 10 minutter ved RT.
- Hold rørene på magnet og nøye trekke ut supernatanten. Supernatanten inneholder den negative fraksjon.
- Fjern røret fra magneten og tilsett 2 ml av isolasjon buffer.
- Forsiktig resuspendere cellene ved å pipettere opp og ned.
- Plasser rørene tilbake på magneten. Inkuber i 5 min ved RT.
- Hold rørene på magnet og nøye trekke ut supernatanten. Supernatanten inneholder den negative fraksjon.
- Fjern rørene fra magneten og tilsett 2 ml av isolasjon buffer i hvert rør. Forsiktig resuspendere cellene ved å pipettere opp og ned.
- Overfør den positive brøk til et sterilt 50 ml rør og juster volumet til 50 ml ved bruk av sterilt D-PBS.
3. Stimulering av Isolert Monocytter med IL-4 og GM-CSF
- Sett røret inn i sentrifugen og snurre den ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med brems.
- Aspirer supernatanten og re-suspendere cellene i 50 ml D-PBS.
- Pipetter 50 ul i et 1,5 ml rør inneholdende 450 ul av D-PBS. Vortex 1,5 ml rør kraftig og telle cellene i et Neubauer skammer eller en annen celle telling instrument.
- Plasser 50 ml røret inn i sentrifugen og spinne det ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med brems.
MERK: Hvis den negative fraksjon, som inneholder perifert blod lymfocytter (PBL), er også nødvendig, utføre vasking og telling trinn lik tslange av den positive fraksjon (trinn 3.1 til 3.5). - Juster cellekonsentrasjonen til 1 x 10 6 / ml med forvarmet kulturmedium (RPMI 1640 medium supplert med 10% varme-inaktivert FBS, 1% L-glutamin-løsning) og pipette 3 ml / brønn i 6-brønns plater.
MERK: Hvis du bruker varme inaktivert autolog plasma, erstatte 10% FCS med 1-5% autolog plasma, ifølge den eksperimentelle oppsett. - Stimulere monocytter med rekombinant humant IL-4 (250 U / ml) og rekombinant, human GM-CSF (1000 U / ml) ved pipettering av cytokiner direkte i dyrkningsmediet. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2.
- Re-stimulere cellene med IL-4 (250 U / ml) og GM-CSF (1000 U / ml) etter 48 timer ved pipettering av cytokiner direkte i dyrkningsmediet.
MERK: Hvis det er noen tegn til forsuring vist ved pH-indikator i mediet, erstatte halvparten av mediet med forvarmet dyrkingsmedium. - Høste umodne dendrittiske celler på dag 5 etternedstrøms eksperimenter ved pipettering av dyrkede celler ut av den 6-brønns plate og inn i et 50 ml sentrifugerør etter pipettering kulturmediet opp og ned noen ganger.
- Tell cellene og flekke en prøve av isolerte monocytter med anti-humane antistoffer mot CD11b, CD11c, og DC-SIGN / CD209, sammen med en cellelevedyktighet fargestoff. For å unngå uspesifikk binding av antistoffene under overflaten flekker, er bruken av Fc-reseptor-blokkerende reagenser eller bovint serumalbumin (BSA) buffere sterkt anbefalt.
- Analysere prøven ved hjelp av cellenes levedyktighet fargestoff, i henhold til produsentens protokoll ved å utføre strømningscytometri for å vurdere renheten og levedyktigheten av de genererte IDCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter sentrifugering av anti-koagulert blod ved hjelp av en sukrose pute, er perifere mononukleære blodceller (PBMC) anriket i en interfase på toppen av tettshetsgradient medium (figur 1). Når PBMC-er trukket av, FACS-analyse utført for å karakterisere de forskjellige cellepopulasjoner i løpet av de PBMC ved hjelp avstamning markører (f.eks CD3 for T-lymfocytter, CD14 for monocytter, og CD19 på B-lymfocytter). Figur 2A viser resultatene av et representativt FACS-analyse av PBMC innsamlet og farget etter tetthetsgradient-sentrifugering. Ut av gated befolkningen (figur 2A, øvre tomten), vi har oppdaget 4.03% B-lymfocytter, 28.20% monocytter og 67,62% andre celler (figur 2A, midt tomt), 43,62% var T-lymfocytter som (figur 2A, lavere tomten ).
PBMC blir deretter inkubert wed CD14 magnetiske partikler og, etter inkubasjon på en magnet er den negative fraksjonen inneholdende de perifere blodlymfocytter (PBLs) analysert ved FACS ved hjelp av utvalget av ovennevnte avstamning markører. Sammenlignet med PBMC, målte vi tilsvarende prosenter av B-lymfocytter (4,65%, figur 2B, midt tomt), høyere prosenter av andre celler (88,61%, figur 2B, midt tomt), og sterkt reduserte prosenter av monocytter (6,59%, figur 2B , midt tomten). Karakterisering av de positive fraksjon (figur 3) viste en høy separasjonseffektivitet, fordi renheten av de isolerte celler er over 97% (figur 3, venstre plott), hvorav 99,56% (figur 3, høyre plott) uttrykte høye nivåer av CD14 på celleoverflaten.
IL4 og GM-CSF-stimulering av monocytter i 5 dager fører til differensiering til monocytt-avledede dendrittcelles, som er sammenlignbare med dermal dendrittiske celler i morfologi, oppførsel, og reseptorekspresjon 19. FACS-analyse av monocytt-avledede dendrittceller på dag 5 viser en homolog populasjon (figur 4, venstre plott) som uttrykker høye nivåer av CD11b, CD11c (ikke vist), og C-type lektin DC-SIGN. Ingen ekspresjon av DC modning markør CD83 detekteres (figur 4, høyre tomt), og cellene også miste monocyttaktiveringsanalysen markør CD14 (ikke vist).
Figur 1: Separasjon av blodkomponenter ved tetthetsgradient sentrifugering. PBMC-er beriket i en interfase på toppen av separasjonsmediet ved tetthetsgradient sentrifugering. Lag før (venstre) og etter (høyre) sentrifugering vises. Vær så snillKlikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Flow-cytometrisk analyse av PBMC (A) og PBL-er (B). (A) PBMC høstes, farget for avstamning markører (mus-anti-human CD3, CD14, og CD19 antistoffer), og analysert ved flowcytometri. Prikkplott av et representativt resultat vises. (B) Den negative Fraksjonen som inneholdt PBL-er karakterisert ved avstamning markører (mus-anti-human CD3, CD14 og CD19-antistoff), og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Prikkplott av et representativt resultat vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Flow-cytometrisk analyse av monocytt-avledede dendrittceller. Monocytter blir stimulert i 5 dager med IL4 og GM-CSF og farget for karakteristiske DC markører, som CD11b, CD11c (ikke vist), C-type lectin DC-SIGN, og modningen markør CD83. Prikkplott av et representativt resultat vises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver dannelsen av monocytt-avledede dendrittceller (MDDCs) gjennom isoleringen av humane monocytter fra antikoagulert blod ved hjelp av et magnetisk nanopartikkel-baserte analysen. I denne protokollen blir sentrifugeringstrinn utføres oppstrøms cellen isolasjonsprosedyren, noe som fører til en anrikning av PBMC fraksjon. Selv om celler er mistet under sentrifugeringen, for å overlappe innholdet i en hel blod pakke ved densitetsgradient medium ville kreve 200-300 ml av densitetsgradient medium og kan derfor ikke betraktes som kostnadseffektivt. I tillegg er den anrikning av PBMC ved sentrifugering resulterer i en renere cellepopulasjon, som positivt påvirker bindingen av de anti-humane CD14 magnetiske partikler under isoleringsprosessen. Magnetisk-nanopartikkel isolering av monocytter resulterer i en levedyktig populasjon monocytter, som kan videre anvendes for in vitro differensiering til forskjellige DC-undergrupper eller makrofager.
Alternativt kan dendrittiske celler bli direkte isolert fra dermal eller slimhinne biopsier eller kan utvikles fra CD34 + hematopoetiske stamceller isolert fra navlestreng blodprøver innhentet ex utero.
Likevel, MDDCs er de mest brukte modell for dendrittiske celler, ettersom den direkte isolering av DC fra biopsier er mer komplisert å utføre. Det kan også føre til ineffektiv celle tall som varierer ofte på grunn av forskjeller i donor kvalitet. Lignende problemer kan oppstå når DC genereres fra CD34 + stamceller isolert fra navlestrengsblod.
For fremtidige applikasjoner, kan induserbare pluripotente stamceller (iPSCs) brukes i stedet for CD14-magnetiske kuler isolering av monocytter fra blod. Fordelene med å bruke iPSCs er at ikke bare DC-undergrupper, men alle hematopoietiske celler av interesse, kan dannes fra en donor (T-celler, B-celler og NK calen) og at pasientspesifikke iPSCs kan brukes til å karakterisere interaksjonen mellom autologe immunceller på en personlig måte.
Den mest kritiske trinn under isolering av monocytter er det tetthetsgradient sentrifugeringstrinnet, siden nøyaktig separering av de røde og hvite blodlegemer er bare oppnås når bremse av sentrifugen er slått av. Dette bestemmer utfallet av nedstrøms isolasjon effektivitet.
I konklusjonen, er denne protokollen en svært rask, effektiv og kostnadseffektiv måte å generere en levedyktig og homogen monocyttlignende avledet dendrittiske cellen befolkningen gjennom isolering av humane monocytter fra anti-koagulert blod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25 ml Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
