Introduction
Дендритные клетки (ДК) являются наиболее важными специализированными антиген-представляющих клеток нашей иммунной системы. Незрелые РС (IDCS) находятся в коже или в тканях слизистой оболочки и поэтому среди первых иммунных клеток, чтобы взаимодействовать с вторгающихся патогенов. Контроллеры домена представляют собой мост между врожденной и адаптивной иммунной системы 1, так как они могут активировать Т- и В-клеточные реакции после обнаружения патогенных микроорганизмов. Кроме того, они способствуют провоспалительных иммунных реакций, из-за выделения больших количеств цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и IL-12. Контроллеры домена также активирует клетки NK и привлечь другие иммунные клетки к месту инфекции хемотаксиса.
Контроллеры домена могут быть разделены на незрелые дендритные клетки (МССД) и зрелых дендритных клеток (MDCs) 2 на основе их морфологии и функции. После распознавания чужеродных антигенов одним из множества распознающих рецепторов (например, Toll-подобные рецепторы, С-типалектины, или дополнять рецепторы) в большом количестве экспрессируется на поверхности клетки, IDCS претерпит серьезные изменения и начинают созревать. Во время этого процесса созревания, рецепторы для захвата антигена вниз регулируется, в то время как молекулы , необходимые для презентации антигена являются повышающей регуляции 3. Зрелые контроллеры домена до регулировать основных комплексов гистосовместимости I и II (MHC I и II), Co-стимулирующего молекулы, такие как CD80 и CD86, которые имеют важное значение для презентации антигена и активации Т-лимфоцитов. Кроме того, экспрессия рецептора хемокина CCR7 на поверхности клеток индуцируется, что позволяет миграцию контроллеров домена из периферических тканей к лимфатическим узлам. Миграция способствует "прокатки" ДК вдоль хемокинным лиганда 19 (CCL19 / MIP-3b) и хемокина лиганд 21 (CCL21 / SLC) градиента к лимфатическим узлам 4-6.
После миграции, MDCs представить обработанный антиген наивных CD4 + и CD8 + Т - клеток, таким образом , иниtiating адаптивный иммунный ответ против вторгшегося возбудителя 7. Это взаимодействие с Т - клетками в лимфатических узлах , также связано с распространением вируса 8. Другие исследования в пробирке показали , что контроллеры домена эффективно захвата и передачи ВИЧ Т - клеток и что это результаты передачи в энергичном инфекции 9-12. Эти эксперименты подчеркивают , что в естественных условиях РС ВИЧ подвиги , как челноки от периферии к лимфатическим узлам. Во время презентации антигена, контроллеры домена выделяют ключевые интерлейкины, которые формируют дифференциацию эффекторных Т-клеток-хелперов, и, следовательно, исход всего иммунного ответа против микроба определяется при этом самого взаимодействия. Помимо типа 1 (Th1) и типа 2 (Th2) эффекторные Т - клетки, другие подмножества клеток - хелперов CD4 + Т (например, тип 17 (Th17) и тип 22 (Th22) Т - клетки) были описаны, и их индукция и функции были тщательно исследованы. ДК, кроме того, участвует вгенерация регуляторных Т - клеток (Tregs) 13,14. Эти клетки являются иммунодепрессивное и могут остановить или понижающей регуляции индукции или пролиферации эффекторных Т-клеток и, таким образом, решающее значение для развития иммунитета и толерантности.
Человеческие обычные контроллеры домена (CDCs) содержат несколько подмножеств клеток с миелоидного происхождения (т.е. клеток Лангерганса (LCS) и кожная и интерстициальные РСУ) или лимфоидной происхождения (т.е. плазмоцитов контроллеры домена (PDCs)). Для экспериментов в пробирке или стратегии вакцинации DC, моноцитов контроллеры домена , которые обычно используются в качестве модели для кожными контроллеров домена. Эти клетки демонстрируют сходство в физиологии, морфологии и функции с обычными миелоидные дендритные клетки. Они генерируются путем добавления интерлейкина 4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) , моноцитов , выделенных из здоровых доноров 12,15-18. Дендритные клетки также могут быть непосредственно выделены из дермальных или слизистыми биопсий, или может даже бе развился из CD34 + гемопоэтических клеток - предшественников , выделенных из образцов пуповинной крови , полученных ех внутриутробного развития. Здесь показано, как моноциты изолированы и стимулировали от анти-свернувшегося крови человека после того, как мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) обогащения центрифугированием в градиенте плотности. После инкубации в течение 5 дней, моноциты человека при определенных условиях дифференцированы в IDCS и готовы к экспериментальным процедурам в доклинических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика заявление: письменное информированное согласие было получено от всех участвующих доноров крови Центрального института переливания крови и отдела иммунологические, Инсбрук, Австрия. Использование обезличенных образцов оставшимися в научных целях было одобрено Комитетом по этике Медицинского Университета Инсбрука мимо.
1. Обогащение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)
- Концентрация МНПК центрифугированием.
- Открыть пакет крови и раздвоение кровь в стерильные 50 мл центрифужные пробирки, в зависимости от количества крови, полученной.
- При необходимости, отрегулировать громкость до 50 мл на каждую пробирку со стерильной Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (D-PBS).
- Место труб в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) без тормоза.
- Откачать верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, используя стерильный 10 мл серологические пипетки, оставляя boundarу слоя ненарушенных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если аутологичной плазмы вместо FCS используется в дополнение к культуральной среды, плазма должна быть собрана и термоинактивировали на этом этапе. - Сбор мононуклеарных клеток (пограничные слои) из двух 50 мл центрифужные пробирки и переносят их в одну стерильный 50 мл трубки с помощью стерильной 10 мл серологические пипетки.
- Отрегулируйте громкость до 50 мл на каждую пробирку с использованием стерильной D-PBS.
- Место труб в центрифугу и вращать их со скоростью 400 мкг в течение 15 мин при комнатной температуре без тормоза.
- Откачать верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, используя стерильный 10 мл серологические пипетки, в результате чего пограничный слой нетронутой.
- Сбор мононуклеарных клеток (пограничные слои) из центрифужные пробирки по 50 мл и переносят их на две стерильные 50 мл пробирки для сбора с использованием стерильного 10 мл серологические пипетки.
- Отрегулируйте громкость до 50 мл на каждую пробирку со стерильным D-PBS.
- разделениеМНПК путем центрифугирования в градиенте плотности (рис 1).
- Подготовьте четыре 50 мл пробирки и пипетки 15 мл градиента плотности среды в каждую пробирку.
- Возьмите 25 мл объединенном клеток / крови из коллекторной трубки (этап 1.1.10) и тщательно наложения градиента плотности среды.
- Место труб в центрифугу и вращать их со скоростью 700 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре без тормоза.
- Сбор и очистка МНПК.
- Откачать верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, используя стерильный 10 мл серологические пипетки, оставляя слой РВМС без помех.
- Соберите интерфазу РВМС из всех трубок и объединить клетки в двух стерильных 50 мл пробирки с помощью стерильной 25 мл серологические пипетки.
- Отрегулируйте громкость до 50 мл на каждую пробирку со стерильным D-PBS. Место труб в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 15 мин при 4 ° C с тормозом.
- Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливатьКлетки в стерильном D-PBS. Объединяют клетки с обеих трубок и регулировать объем до 50 мл стерильной D-PBS.
- Место труб в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
- Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать клетки в стерильном D-PBS. Настройка громкости до 50 мл стерильной D-PBS и 50 мкл в 1,5 мл пробирку, содержащую 450 мкл D-PBS.
- Вихревой 1,5 мл трубки энергично и подсчета клеток в камере Neubauer или любой другой инструмент подсчета клеток.
- Поместите 50 мл пробирки в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
2. Выделение моноцитов с помощью анти-CD14 человека магнитных частиц
- Маркировку МНПК с магнитными частицами.
- Отрегулируйте концентрацию РВМС до 8 × 10 7 клеток / мл с использованием буфера изоляции.
- Вихревые магнитные частицы CD14 против человеческого thoroughlу и добавить 50 мкл частиц на каждые 1 × 10 7 МНПК.
- Смешайте суспензии клеток-частиц тщательно и инкубировать ее при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Разделение положительных и отрицательных фракций.
- Отрегулируйте объем до 12 мл с использованием буфера изоляции.
- Подготовьте шесть стерильных круглым дном пробирки и пипетки 2 мл клеточной суспензии частиц в каждую пробирку.
- Немедленно поместить пробирки на магните. Выдержите их в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Держите трубки на магнит и осторожно оттянуть супернатант. Супернатант содержит негативную фракцию.
- Снимите трубку от магнита и добавьте 2 мл буфера изоляции.
- Аккуратно повторно приостанавливать клетки пипетированием вверх и вниз.
- Поместите трубки обратно на магнит. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Держите трубки на магнит и осторожно оттянуть супернатант. Супернатант содержит негативную фракцию.
- Удалить труб из магнита и добавляют 2 мл буфера изоляции в каждую пробирку. Аккуратно повторно приостанавливать клетки пипетированием вверх и вниз.
- Перенести положительную фракцию в стерильный 50 мл трубки и регулировать громкость до 50 мл с помощью стерильного D-PBS.
3. Стимуляция изолированных моноцитов с IL-4 и GM-CSF
- Поместите пробирку в центрифугу и вращать его при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
- Аспирата супернатант и повторно приостанавливать клетки в 50 мл D-PBS.
- 50 мкл в 1,5 мл пробирку, содержащую 450 мкл D-PBS. Vortex 1,5 мл трубки энергично и подсчета клеток в камере Neubauer или другого счета сотового инструмента.
- Поместите 50 мл пробирку в центрифугу и вращать его при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если отрицательная фракция, содержащая лимфоциты периферической крови (PBL,), также требуется, выполнить промывку и подсчета шагов похож на тшланг положительной фракции (шаги 3.1-3.5). - Регулировка концентрации клеток до 1 × 10 6 / мл с помощью подогретого культуральной среды (RPMI 1640 , дополненной 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% L-глутамина раствор) и пипеткой 3 мл / лунку на 6-луночных планшетах.
Примечание: При использовании инактивированной нагреванием аутологичной плазмы, заменить 10% FCS с 1-5% аутологичной плазмы, в соответствии с экспериментальной установки. - Стимулируют моноцитов с рекомбинантного человеческого ИЛ-4 (250 ед / мл) и рекомбинантного человеческого GM-CSF (1000 ед / мл) с помощью пипетки цитокины непосредственно в культуральную среду. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО 2.
- Повторно стимулируют клетки ИЛ-4 (250 ед / мл) и GM-CSF (1000 ед / мл) через 48 ч пипеткой цитокины непосредственно в культуральную среду.
Примечание: Если есть какие-либо признаки подкисления, показанные индикатором рН в среде, заменить половину среды с подогретого культуральной среды. - Урожай незрелых дендритных клеток на 5-й день в течениевниз по течению экспериментов пипетированием культивируемые клетки из 6-луночного планшета и в 50 мл центрифужные пробирки после пипеткой культуральной среды вверх и вниз несколько раз.
- Граф клеток и окрашивать образец изолированных моноцитов с анти-человеческим антителам против CD11b, CD11c, и, DC-SIGN / CD209, вместе с жизнеспособность клеток красителя. Для того, чтобы избежать неспецифического связывания антител во время окрашивания поверхности, настоятельно рекомендуется использование рецептора Fc блокирующих реагентов или бычий сывороточный альбумин (БСА) буферы.
- Анализ образца, используя жизнеспособность клеток краситель, в соответствии с протоколом производителя, выполняя проточной цитометрии для оценки чистоты и жизнеспособность генерируемых IDCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После центрифугирования анти-свернувшейся крови , используя подушку сахарозы, одноядерные клетки периферической крови (РВМС) обогащены в интерфазе на верхней части градиента плотности среды (рисунок 1). После того , как МНПК отсасывают, анализ FACS выполняется для характеристики различных клеточных популяций в МНПК с использованием маркеров клональные (например, CD3 для Т - лимфоцитов, CD14 для моноцитов и CD19 для В - лимфоцитов). На фиг.2А показаны результаты анализа FACS представительные МНПК , собранных и окрашивают после центрифугирования в градиенте плотности. Из закрытого типа населения (Фигура 2А, верхний участок), мы обнаружили 4,03% В - лимфоцитов, 28,20% моноцитов и 67,62% других клеток (Фигура 2А, средний участок), из которых 43,62% были Т - лимфоциты (фиг.2А, нижний участок ).
МНПК затем инкубируют WIth CD14 магнитные частицы и, после инкубации на магните, отрицательная фракция, содержащая лимфоциты периферической крови (PBL,) анализируют с помощью FACS с использованием выбора вышеуказанных маркеров линии дифференцировки. По сравнению с МНПК, мы измерили аналогичные проценты В - лимфоцитов (4,65%, рис 2B, средний участок), более высокий процент других клеток (88,61%, рис 2B, средний участок), а также сильно снижается процент моноцитов (6,59%, рис 2B , средний участок). Характеристика положительной фракции (рисунок 3) показали высокую эффективность разделения, так как чистота выделенных клеток составляет более 97% (рисунок 3, левый участок), из которых 99,56% (рисунок 3, правый график) выражены высокие уровни CD14 на поверхности клетки.
IL-4 и GM-CSF, стимуляция моноцитов в течение 5 дней, приводит к дифференциации в моноцитов дендритные клеткиs, которые сопоставимы с дермальные дендритных клеток в морфологии, поведении и экспрессии рецепторов 19. FACS - анализ моноцитов дендритные клетки на 5 -й день показывает гомогенную популяцию (рисунок 4, левый график) , выражающую высокие уровни CD11b, CD11c (не показан), а С-типа лектинов DC-SIGN. Нет экспрессии маркера CD83 Созревание DC не обнаружено (рисунок 4, правый график), а также клетки теряют маркер CD14 моноцитов (не показан).
Рисунок 1: Разделение компонентов крови путем центрифугирования в градиенте плотности. МНПК обогащены межфазной поверх разделяющей среды путем центрифугирования в градиенте плотности. Слои до (слева) и после (справа) центрифугирования показаны. пожалуйстаНажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Цитометрический анализ РВМС (А) и PBL , (B). (A) РВМС собирают, окрашивают на линии дифференцировки маркеров (мышь-анти-CD3 человека, CD14, CD19 и антитела), и анализировали с помощью проточной цитометрии. Точечные участки представительного результата показаны. (В) Отрицательная фракция , содержащая PBL , характеризуется линии дифференцировки маркеров (мышь-анти-CD3 человека, CD14, CD19 и антитела) и анализировали с помощью проточной цитометрии. Точечные участки представительного результата показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Цитометрический анализ моноцитов дендритные клетки. Моноциты стимулировали в течение 5 дней с ИЛ4 и GM-CSF и окрашивали для характерных маркеров постоянного тока, как CD11b, CD11c (не показан), С-тип лектин DC-SIGN, и созреванию маркера CD83. Точечные участки представительного результата показаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает генерацию моноцитов дендритные клетки (MDDCs) через изоляцию человеческих моноцитов из анти-свернувшейся крови с использованием магнитной наночастицы на основе анализа. В этом протоколе, этапы центрифугирования выполняют перед процедурой выделения клеток, что приводит к обогащению фракции РВМС. Хотя клетки теряются во время центрифугирования, чтобы перекрывать содержимое всего пакета крови на градиенте плотности среды, потребуется 200-300 мл градиента плотности среды, и, следовательно, не может считаться экономически эффективным. Кроме того, обогащение МНПК по результатам центрифугирование в более чистой популяции клеток, что положительно влияет на прикрепление магнитных частиц CD14 антигуманных в процессе выделения. Магнитно-наночастица изоляция моноцитов приводит в жизнеспособном моноцитов населения, которые могут быть дополнительно использованы для дифференциации на различные подмножества DC или макрофаги в пробирке.
В качестве альтернативы, дендритные клетки могут быть непосредственно выделены из дермальных или слизистыми биопсий или могут быть разработаны с CD34 + гемопоэтических клеток - предшественников , выделенных из образцов пуповинной крови , полученных ех внутриутробного развития.
Тем не менее, MDDCs являются наиболее широко используемой моделью для дендритных клеток, так как прямая изоляция ГЦ из биопсий является более сложным для выполнения. Это также может привести к неэффективному количества клеток, которые часто изменяются из-за различий в качестве донора. Подобные проблемы могут возникнуть , когда контроллеры домена генерируются из стволовых клеток CD34 + , выделенных из пуповинной крови.
Для будущих применений, индуцируемые плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть использованы вместо CD14-магнитный шарик выделения моноцитов из крови. Преимущества использования ИПСК является то, что не только подмножества DC, но все кроветворные клетки интерес, могут быть получены из одного донора (Т-клетки, В-клетки и NK-Cгезов) и что иПСК конкретного пациента могут быть использованы для характеристики взаимодействий аутологичных иммунных клеток в персонализированным способом.
Наиболее важным шагом в процессе выделения моноцитов является центрифугирование в градиенте плотности, так как точно выделен красных и белых кровяных клеток достигается только при условии тормоз центрифуге выключен. Это определяет исход эффективности изоляции вниз по течению.
В заключение, этот протокол является очень быстрым, эффективным и экономически эффективный способ создания жизнеспособной и гомогенной моноцитов популяцию дендритных клеток путем выделения человеческих моноцитов из анти-свернувшейся крови.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25 ml Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
