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JoVE Journal Genetics
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Genetics

परिवेश पार्टिकुलेट मैटर प्रेरित गुणसूत्र aberrations के विश्लेषण से एक का उपयोग Published: December 21, 2016 doi: 10.3791/54969
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 3
1Department of Occupational and Environmental Health, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Environmental Health Sciences, University of Alabama at Birmingham, 3Division of Radiation Health, University of Arkansas for Medical Sciences

Summary

इस प्रोटोकॉल परिवेशी वायु बात कण के साथ उपचार के बाद मात्रा का ठहराव और RAW264.7 माउस मैक्रोफेज में इन विट्रो में गुणसूत्र aberrations के लक्षण वर्णन के लिए तकनीक का वर्णन है।

Abstract

बात कण (प्रधानमंत्री) के संपर्क में एक प्रमुख विश्व स्वास्थ्य चिंता का विषय है, जो परमाणु आनुवंशिक सामग्री सहित विभिन्न सेलुलर घटकों, नुकसान हो सकता है। परमाणु आनुवंशिक अखंडता पर प्रधानमंत्री के प्रभाव का आकलन करने के लिए, संरचनात्मक गुणसूत्र aberrations माउस RAW264.7 मैक्रोफेज कोशिकाओं की metaphase फैलता में रन बनाए हैं। प्रधानमंत्री एक उच्च मात्रा की कुल निलंबित कणों पारखी के साथ परिवेशी वायु से एकत्र किया जाता है। एकत्र सामग्री solubilized और पानी में घुलनशील है, ठीक भाग बनाए रखने के लिए फ़िल्टर किया जाता है। कणों परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा रासायनिक संरचना के लिए विशेषता है। कण निलंबन के विभिन्न सांद्रता 72 घंटा की कुल जोखिम समय के लिए RAW264.7 माउस मैक्रोफेज की इन विट्रो संस्कृति पर जोड़ा जाता है, अनुपचारित नियंत्रण कक्षों के साथ। जोखिम के अंत में, संस्कृति metaphase में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने colcemid के साथ व्यवहार किया जाता है। कोशिकाओं तो काटा, hypotonic समाधान, acetomethanol में तय हो, डी के साथ व्यवहार कर रहे हैंगिलास स्लाइड पर ropped और अंत में Giemsa समाधान के साथ दाग। स्लाइड में संरचनात्मक गुणसूत्र aberrations (सीए) metaphase फैलता 1,000X बढ़ाई पर एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग आकलन करने के लिए जांच कर रहे हैं। 50 से 100 metaphase प्रसार प्रत्येक उपचार के समूह के लिए रन बनाए हैं। इस तकनीक को इस तरह के chromatid प्रकार टूटता है, chromatid प्रकार के आदान-प्रदान, acentric टुकड़े, dicentric और अंगूठी गुणसूत्रों, डबल मिनट, endoreduplication, और प्रधानमंत्री से संपर्क के बाद इन विट्रो में Robertsonian ट्रांसलोकेशन के रूप में संरचनात्मक गुणसूत्र aberrations (कैस), का पता लगाने के लिए अनुकूलित है। यह epigenetic परिवर्तन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित cytogenetic समापन बिंदु संबद्ध करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका है।

Introduction

यह अनुमान लगाया गया है कि बात कण (प्रधानमंत्री) के लिए जोखिम 3 लाख से अधिक लोगों की मृत्यु सालाना अतिरिक्त, मुख्य रूप से हृदय रोग और फेफड़ों के कैंसर का कारण बनता है 1 से किया गया है। दरअसल, प्रधानमंत्री, अनुसंधान कर्क राशि के लिए अंतरराष्ट्रीय एजेंसी (समूह 1) द्वारा मनुष्य के लिए कैंसर के रूप में मान्यता दी गई थी के रूप में प्रधानमंत्री के लिए जोखिम के स्तर को बढ़ाने के साथ फेफड़ों के कैंसर का खतरा बढ़ 2 दिखाया गया है। दिलचस्प है, लगभग सभी कैंसर की कोशिकाओं संख्यात्मक और / या संरचनात्मक गुणसूत्र असामान्यताओं बंदरगाह। पार्टिकुलेट कार्बनिक कार्बन एक संस्करण है, जटिल है, और विषम मिश्रण, जिसकी संरचना और आकार के वितरण के उत्सर्जन के साथ ही भौतिक और रासायनिक परिवर्तनों पर निर्भर करता है। यह शहरी PM 2.5 द्रव्यमान का 35-55% (प्रधानमंत्री 2.5 माइक्रोन आकार में और छोटे) और ग्रामीण पृष्ठभूमि और महाद्वीपीय PM 2.5 बड़े पैमाने पर 3, 4 के 60% से अधिक से खातों। पानी में घुलनशील अंश कार्बनिक एयरोसोल का 30-90% के लिए खातों। कार्बनिक यौगिकों की एक बड़ी संख्यापहचान की गई है स्निग्ध हाइड्रोकार्बन, पॉलीसाइक्लिक सुरभित हाइड्रोकार्बन, और उनके ऑक्सीजन और nitrated डेरिवेटिव, स्निग्ध एल्डीहाइड और एल्कोहल, मुक्त फैटी एसिड और उनके लवण, डि-कार्बोक्जिलिक एसिड, multifunctional यौगिकों, प्रोटीन, और humic-जैसे बड़े अणुओं (HULIS) का उपयोग भी शामिल chromatographic तरीकों बड़े पैमाने पर spectrometric तकनीक 5-8 के साथ मिलकर। इन यौगिकों, कण जैविक कार्बन का कम से कम 10-20% का प्रतिनिधित्व करते हैं, इस प्रकार जैविक कार्बन के सबसे अज्ञात 9 है।

प्रायोगिक सबूत बताते हैं कि cytotoxicity, oxidative तनाव, सूजन और प्रधानमंत्री से जुड़े रोग राज्यों के विकास में शामिल रहे हैं। यह हाल ही में दिखाया गया है, हालांकि, प्रधानमंत्री के लिए है कि जोखिम भी दोहराए तत्वों के डीएनए मेथिलिकरण में परिवर्तन सहित epigenetic परिवर्तन की एक संख्या में, इन विट्रो प्रणालियों में और मानव विषयों 10-12 में यह परिणाम दोनों प्रयोगात्मक में। खास रुचि के प्रभाव हैंबड़े और छोटे उपग्रहों - - गुणसूत्रों के गुणसूत्रबिंदु आसपास heterochromatic क्षेत्र में पाए जाते हैं जो उपग्रह डीएनए पर PM। यह दिखाया गया था इन प्रभावों, स्वभाव से लगातार हो सकता है कि के रूप में वे जोखिम 12 के बाद कम से कम 72 घंटे के लिए पता लगाया जा सकता है। डीएनए मेथिलिकरण में बदलाव, विशेष रूप से centromeres के आसपास, कोशिका विभाजन के दौरान उपग्रह डीएनए mRNA टेप, समझौता गुणसूत्र अखंडता के संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और बाद में, रोग राज्यों 13 की एक किस्म के विकास में परिणाम।

पीएम की वजह से epigenetic परिवर्तन की एक अंत बिंदु के रूप में सीए के विश्लेषण के लिए cytogenetic दृष्टिकोण के अनुकूलन, इस प्रकार, उच्च महत्व का है। यहाँ, हम परिवेश PM संग्रह और तैयारी के लिए दृष्टिकोण, इन विट्रो जोखिम और कैस के विश्लेषण में murine बृहतभक्षककोशिका RAW264.7 मॉडल प्रणाली का उपयोग करते हुए रिपोर्ट। मैक्रोफेज साँस विदेशी वस्तुओं के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति में शामिल है और, इसलिए, टीउसके सेल लाइन की स्थापना की एक और कण विष विज्ञान 11, 12, 14, 15 में सबसे अक्सर इस्तेमाल किया मॉडल के रूप में कार्य करता है।

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Protocol

1. कण संग्रह और तैयारी

  1. उच्च मात्रा की कुल निलंबित कणों पारखी की कैलिब्रेशन
    1. जन प्रवाह नियंत्रक से पारखी मोटर डिस्कनेक्ट और एक स्थिर एसी शक्ति के स्रोत (चित्रा 1) के लिए मोटर कनेक्ट।
      ध्यान दें: एक फिल्टर इस प्रक्रिया के दौरान उपयोग नहीं किया है।
    2. अंशशोधक छिद्र और नमूना करने के लिए शीर्ष लोड हो रहा है अनुकूलक प्लेट माउंट। सुरक्षित रूप से शीर्ष लोड हो रहा है एडाप्टर पकड़ नीचे नट कस सुनिश्चित करें कि कोई हवा लीक मौजूद हैं। पारखी मोटर अपनी सामान्य ऑपरेटिंग तापमान (लगभग 10-15 मिनट) के लिए गर्म करने के लिए अनुमति दें।
    3. हाथों से छिद्र पर छिद्र और दबाव नल के शीर्ष पर छेद को कवर द्वारा एक रिसाव परीक्षण का संचालन। एक अनिमेष चिल्ला हवा से बचने के द्वारा किए गए ध्वनि के लिए सुनो। यदि यह आवाज सुनी है, फिर से कस शीर्ष लोड हो रहा है एडाप्टर पकड़ नीचे पागल के रूप में एक दरार मौजूद है। ध्वनि कम है, तो रिसाव व्यवस्था में अन्य गास्केट से एक के पास हैमंदिर।
    4. एक रबर वैक्यूम ट्यूब के साथ छिद्र के पक्ष पर दबाव नल एक पानी नापने का यंत्र के एक तरफ से कनेक्ट। दबाव नापने का यंत्र वातावरण के लिए खुला के विपरीत दिशा में छोड़ दें। एक दबाव नापने का यंत्र खड़ी पकड़ो सटीक रीडिंग सुनिश्चित करने के लिए। सतत प्रवाह रिकॉर्डर की पीठ दोहन कलम केंद्र और सटीक रीडिंग प्रदान करने में मदद मिलेगी।
    5. दोहराएँ कदम 1.1.2 30 से 60 फुट / मिनट (लगभग हर 5-6 फीट 3 / मिनट) से परिचालन प्रवाह दरों का प्रतिनिधित्व करने वाले पांच प्रवाह दरों का उपयोग कर। पांच अलग-अलग पदों के लिए चर छिद्र पर घुंडी को समायोजित करें और पाँच अलग अलग रीडिंग ले।
    6. परिवेशी वायु तापमान, परिवेश बैरोमीटर का दबाव, पारखी सीरियल नंबर, सीरियल नंबर छिद्र, छिद्र ढलान और अवरोधन अंतिम तिथि प्रमाणित है, तिथि, साइट स्थान, और अंशांकन शीट पर ऑपरेटर के हस्ताक्षर के साथ रिकॉर्ड।
  2. कुल निलंबित कणों नमूना संग्रह और विश्लेषण gravimetric
    1. लपेटें एक8 "एक्स 10" एल्यूमीनियम पन्नी की दो परतों में क्वार्ट्ज फाइबर फिल्टर। भट्ठी में लिपटे फिल्टर जगह और 550 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर निर्धारित किया है। कम से कम 4 घंटे के लिए फिल्टर सेंकना। भट्ठी शांत करते हैं और फिल्टर निकालते हैं। CaCO 3 के साथ desiccator में फिल्टर रखें।
    2. 10 माइक्रोग्राम की परिशुद्धता के साथ एक Microbalance में फिल्टर वजन। एक दिन के दौरान माप तीन बार दोहराएँ। अलग-अलग माप 25 माइक्रोग्राम के भीतर होना चाहिए। यदि यह हासिल नहीं है, desiccator को लपेटा फिल्टर लौटने और प्रक्रिया अगले दिन दोहराएँ।
    3. आश्रय ढक्कन (चित्रा 2) खोलें। चार पंख पागल ढीला पीतल बोल्ट और वाशर रास्ते से बाहर नीचे स्विंग करने की अनुमति देकर फिल्टर धारक फ्रेम निकालें। एल्यूमीनियम पन्नी से फिल्टर प्रकट करना, और साफ संदंश का उपयोग सावधानी से इसे केंद्र के लिए, rougher ऊपर की ओर, समर्थन स्क्रीन पर। ठीक तरह से स्क्रीन पर फिल्टर संरेखित।
    4. स्क्रीन पर फ्रेम की जगह है और साथ सुरक्षितपीतल बोल्ट और वाशर, जबकि पर्याप्त दबाव लागू करने के किनारों पर हवा रिसाव से बचने के लिए। एक साफ कपड़े से फिल्टर धारक के चारों ओर से किसी भी धूल संचय साफ कर लें। बंद आश्रय ढक्कन ध्यान से और सुरक्षित।
    5. सुनिश्चित करें कि सभी डोरियों उनके उचित गोदाम कुर्सियां ​​में खामियों को दूर कर रहे हैं और धौंकनी मोटर दबाव नल और सतत प्रवाह रिकॉर्डर के बीच ट्यूबिंग जुड़ा हुआ है।
    6. प्रवाह रिकॉर्डर तैयार करें। दबाना कलम हाथ चोर कलम बिंदु बढ़ाने के लिए और एक नया चार्ट डालने के लिए। रिकॉर्डर की ड्राइव हब के लिए चार्ट का टैब संरेखित करें और अंगूठे हब पर चार्ट केंद्र को कम करने के साथ दबाएँ। ड्राइव हब घूर्णन घड़ी के लिहाज से जब तक चार्ट पर सही समय समय सूचकांक सूचक के साथ गठबंधन किया है द्वारा समय निर्धारित करें।
    7. मैन्युअल पारखी पर स्विच और संग्रह शुरू करते हैं। रिकॉर्डर मॉनिटर यकीन है कि इसे सही ढंग से भनक जाता है और गुजरे समय सूचक यकीन है कि यह ठीक से काम कर रहा है होना करने के लिए किया जाना है।
    8. नमूना अवधि के अंत में, पारखी, रिकॉर्ड स्विच बंदसमय बीत और चार्ट निकालते हैं। फिल्टर का पर्दाफाश करने के लिए फ्रेम निकालें। संदंश के साथ समाप्त होता है पर धीरे इसे धारण करके समर्थन स्क्रीन से अवगत कराया फिल्टर निकालें। फिल्टर लंबाई मोड़ो इतना है कि नमूना छू लेती नमूना दो बार और मूल एल्यूमीनियम पन्नी में लपेट।
    9. फिल्टर तौल करने से पहले कम से कम 24 घंटे के लिए CaCO 3 के साथ Desiccator में स्टोर। दोहराएँ कदम 1.2.2 नमूना लेने के बाद फिल्टर का वजन को मापने के लिए। एक ज़िप प्लास्टिक की थैली में फिल्टर की जगह और विश्लेषण जब तक -80 डिग्री सेल्सियस की दुकान में।
  3. एकत्र की कुल निलंबित कणों नमूने के विश्लेषण
    1. संग्रहीत फिल्टर निकालते एल्यूमीनियम पन्नी प्रकट करना और एक साफ Teflon सतह पर फिल्टर हस्तांतरण। संदंश और छुरी का प्रयोग, कट फिल्टर के बाहरी (सफेद) हिस्सा है और निपटान के।
      1. अगले, एक 100 मिलीलीटर फ्लास्क में 0.5 "x 0.5" टुकड़े और जगह टुकड़ों में फिल्टर काटा। ultrapure पानी की 50 मिलीलीटर जोड़ें। एक अल्ट्रासाउंड में कुप्पी की जगहस्नान और 33 ± 3 kHz पर 60 मिनट के लिए Sonicate।
    2. एक 100 मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी के लिए एक 0.45 माइक्रोन polypropylene सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर निकालने। निकालने के बारे में 5 मिलीलीटर तक 50 डिग्री सेल्सियस पर पानी के दबाव के तहत एक rotavap साधन का उपयोग कर लुप्त हो जाना कुप्पी में रहता है।
      1. ज्ञात वजन की एक 15 मिलीलीटर नाशपाती के आकार का फ्लास्क में शेष पानी लुप्त हो जाना। सूखी निकालने के साथ कुप्पी वजन और सूखी निकालने की बड़े पैमाने पर रिकॉर्ड है।
    3. 15 मिनट के लिए sonicating द्वारा डी ओ 2 के 400 μl के साथ सूखी नमूना भंग और एक 5 मिमी मानक एनएमआर ट्यूब में हस्तांतरण। कमरे के तापमान पर 12,000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र किसी भी undissolved बात हटा दें।
    4. डी 2 के 300 μl के साथ दोहराएँ ओ एनएमआर ट्यूब में NaN 3 1.4% के 10 μl (v अंतिम सान्द्र .: 0.02% w /) जोड़ें। डी 2 ओ (अंतिम एकाग्रता 0.258 मिमी) एनएमआर ट्यूब में करने के लिए कुल निलंबित कणों (टीएसपी) -d4 (3.2 मिलीग्राम / एमएल) के 10 μl (32 माइक्रोग्राम) जोड़ें।
    5. मोल 1 एच एनएमआर एक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर 600.17 मेगाहर्ट्ज पर परिचालन का उपयोग कर स्पेक्ट्रा।
      1. ट्रिपल गूंज cryoprobe में एनएमआर ट्यूब डालें। इस क्रम में साधन जांचना: ताला, धुन, शिम, 90 ° पल्स लंबाई अंशांकन और रिसीवर लाभ समायोजन।
      2. एक 1 डी उत्तेजना sculpting अनुक्रम डिजिटल ट्रैक्टर का पता लगाने मोड में 180 पानी चयनात्मक दाल, 8,192 स्कैन, 4 डमी स्कैन, 8012.57 हर्ट्ज की झाडू चौड़ाई का उपयोग के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर स्पेक्ट्रा उपाय, आवृत्ति पानी संकेत दमन 4.70 पीपीएम पर सेट, 1.70 के लिए ऑफसेट सेकंड अधिग्रहण समय, 32,768 समय डोमेन डेटा अंक (टीडी), 1 मिसे अवधि ढाल (P16), ढाल (D16) के बाद 100 μsec वसूली देरी।
    6. प्रक्रिया 1 2 (65,536 डेटा अंक) का एक पहलू से 1 हर्ट्ज और शून्य भरने का एक लाइन का विस्तार लगाने से एच एनएमआर स्पेक्ट्रा। मैन्युअल चरण और आधारभूत सही और एकीकृत। 0.0 पीपीएम पर टीएसपी-D4 शिखर सेट करें।

2. कण एक्सपोजर

  1. संस्कृति की स्थापना
    1. गर्म पूर्ण विकास के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (100 यू / एमएल), 0.25% trypsin समाधान और कैल्शियम मैग्नीशियम मुक्त फॉस्फेट बफर खारा एक नहाने के पानी में (पीबीएस) (37 डिग्री सेल्सियस) से युक्त मीडिया संस्कृति दीक्षा से पहले कम से कम 30 मिनट।
    2. से 5% सीओ 2 सुसंस्कृत RAW264.7 कोशिकाओं से युक्त इनक्यूबेटर एक T75 कुप्पी बाहर ले जाओ और पूर्व गर्म पीबीएस दो बार के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    3. स्क्रैप के द्वारा पीछा पूर्व गर्म trypsin समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग ऊतक संस्कृति पोत के नीचे से पक्षपाती RAW264.7 कोशिकाओं को बेदखल।
    4. टिशू कल्चर पोत से कोशिकाओं को इकट्ठा और दोहराया pipetting द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन बनाते हैं। पूर्व गर्म पूरा मीडिया के साथ एक 100 मिमी टिशू कल्चर डिश में 8000/2 सेमी (कुल 500,000 कोशिकाओं) के घनत्व पर trypan नीले और थाली के साथ कोशिकाओं की संख्या की गणना। 50,000 कोशिकाओं के अंतिम एकाग्रता के लिए 10 मिलीलीटर करने के लिए मीडिया मात्रा समायोजित करेंमिलीलीटर प्रति।
      नोट: प्लेटों की संख्या दोगुनी यदि डीएनए मेथिलिकरण विश्लेषण भी किया जाता है।
    5. नव चढ़ाया RAW264.7 कोशिकाओं 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में वापस 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें और 24 घंटे के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देते हैं।
    6. इसके अलावा एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, फ़िल्टर कणों resuspend। उदाहरण के लिए, 0.5 मिलीग्राम / 5 माइक्रोग्राम / एमएल उपचार खुराक के लिए बाँझ पीबीएस में एमएल की एकाग्रता में कणों को कमजोर और 5 मिलीग्राम / एक 50 माइक्रोग्राम / एमएल उपचार खुराक के लिए मिलीलीटर पर। Dilutions अग्रिम में महीने के लिए तैयार है और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
  2. बात कण के साथ उपचार
    1. से 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर कोशिकाओं बाहर ले जाओ और सेल के विकास, सेल आकृति विज्ञान, संस्कृति हालत, और प्रदूषण के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग 10x बढ़ाई के तहत की जाँच करें। एक इस चरण में कम से कम 30% मिला हुआ कोशिकाओं की उम्मीद करनी चाहिए।
    2. Aseptically, निष्फल पिपेट का उपयोग कर मीडिया aspirate और 2 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ संस्कृति पोत धोनेदो बार पूरी तरह से मीडिया और अस्थायी या मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए।
    3. संस्कृति वाहिकाओं में ताजा मीडिया के साथ बात कण के पूर्व निर्धारित खुराक जोड़ने और 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर वांछित समय के लिए सेते हैं। इस अध्ययन में, समवर्ती genotoxic और epigenotoxic विश्लेषण के लिए इस्तेमाल जोखिम समानांतर 72 घंटे के लिए प्रधानमंत्री के साथ RAW264.7 कोशिकाओं का इलाज।
      नोट: cytotoxicity नकारात्मक cytogenetic विश्लेषण की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, इस तरह cytotoxicity, डीएनए मेथिलिकरण, पश्चिमी सोख्ता, या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के रूप में अतिरिक्त assays आम तौर पर इलाज किया कोशिकाओं पर प्रदर्शन कर रहे हैं। के रूप में वर्णित कोशिकाओं को बेनकाब करने और वांछित विशिष्ट परख के साथ आगे बढ़ें। अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं को भी एक सकारात्मक नियंत्रण मिथाइल methanesulphonate जैसे सीए पता लगाने के लिए उनकी क्षमता का परीक्षण करने के लिए शामिल करने के लिए चाहते हो सकता है।

3. Cytogenetic परख

  1. उपचार metaphase पर कोशिकाओं की गिरफ्तारी के लिए
    1. colcemid गर्म इसलिएlution (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के 30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत 70% शराब के साथ ढक्कन साफ ​​कर लें संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए
    2. पूरी तरह से aseptically मीडिया को हटाने और 2 मिलीलीटर पूर्व गरम पीबीएस दो बार के साथ संस्कृति वाहिकाओं धो लें।
    3. पूर्व गर्म ताजा मीडिया जोड़ें (2 मिलीलीटर मीडिया / 10 6 कोशिकाओं) संस्कृति पोत में colcemid समाधान (5 μl / एमएल) युक्त और 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  2. सेल फसल
    1. गर्म trypsin समाधान और पीबीएस एक नहाने के पानी में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा। इस कदम के बाद से, मम्मियाँ हालत बनाए रखने के लिए कोई जरूरत नहीं है।
    2. पूरी तरह से मीडिया को दूर, दो बार के लिए 2 मिलीलीटर 37 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के साथ संस्कृति वाहिकाओं धोने, पूर्व गर्म trypsin समाधान के लिए आवश्यक मात्रा में जोड़ने के लिए (आमतौर पर 60 मिमी संस्कृति डिश या T25 कुप्पी के लिए 2 मिलीलीटर और 100 मिमी पकवान या T75 कुप्पी के लिए 4 मिलीलीटर ), और संस्कृति पोत 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में वापस 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए जगह है।
    3. Takबाहर ई संस्कृति पोत, एक खुरचनी का उपयोग कोशिकाओं को अलग, और trypsin कार्रवाई को रोकने के लिए पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. पिपेट ऊपर और नीचे कम से कम दस बार एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकल कक्ष निलंबन और स्थानांतरण की कोशिकाओं बनाने के लिए।
    5. बाहर एक स्विंग कमरे के तापमान पर अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र सेल निलंबन।
    6. सतह पर तैरनेवाला निकालें, कोमल दोहन द्वारा सेल गोली तोड़ने, पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ने, और फिर पांच मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
  3. Hypotonic उपचार और निर्धारण
    1. पूर्व गर्म 0.075 एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के कम से कम 30 मिनट के लिए स्नान में एम पोटेशियम क्लोराइड समाधान।
    2. सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें और पीबीएस के लगभग 0.5 मिलीलीटर छोड़ दें।
    3. धीरे सेल गोली तोड़ने के लिए और एक P200 पिपेट का उपयोग एकल कक्ष निलंबन बनाते हैं।
    4. कोमल झटकों के साथ ड्रॉप द्वारा पूर्व गर्म पोटेशियम क्लोराइड समाधान बूंद के 4 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. hypotonic पी में कोशिकाओं को सेते20 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में otassium क्लोराइड समाधान।
    6. 1-हिस्सा हिमनदों एसिटिक एसिड के साथ 3-भागों मेथनॉल जोड़कर ताजा acetomethanol समाधान करें। कमरे के तापमान पर इस हौसले से तैयार लगानेवाला रखें।
    7. hypotonic उपचार के बाद, ट्यूब में लगानेवाला के एक बराबर मात्रा (4 एमएल) जोड़ने और धीरे inverting ट्यूब द्वारा समाधान मिश्रण।
    8. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। इस चरण सेल गोली आकार बढ़ जाती है पर, श्वेताभ और अधिक दृष्टिगोचर हो।
    9. सतह पर तैरनेवाला निकालें, 4 मिलीलीटर ताजा लगानेवाला जोड़ने के लिए और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखने के लिए।
    10. 5 मिनट के लिए 400 XG पर अपकेंद्रित्र, तैरनेवाला हटाने, और 4 मिलीलीटर लगानेवाला के साथ दो और washes दे।
  4. स्लाइड सफाई और metaphase प्रसार तैयारी
    1. 30 मिनट के लिए 10% तरल डिटर्जेंट में पूरी तरह से कांच स्लाइड विसर्जित कर दिया।
    2. 30 मिनट के लिए ठंडा चल रहा पानी के नल में अच्छी तरह से स्लाइड कुल्ला।
    3. रिनएसई आसुत जल के साथ तीन बार स्लाइड पूरी तरह से, डिटर्जेंट हटाने आसुत जल में विसर्जित कर दिया, और भविष्य में उपयोग के लिए फ्रिज में स्टोर करने के लिए।
      नोट: स्लाइड साफ करने से पहले उपयोग के प्रसार की एकरूपता की सुविधा और metaphase गुणवत्ता बढ़ जाती है।
    4. ठंडा गीला स्लाइड पर 10 μl सेल निलंबन ड्रॉप और इसे कमरे के तापमान पर रातोंरात सूखे का प्रसारण करने के लिए अनुमति देते हैं।
  5. धुंधला और बढ़ते
    1. पीबीएस के एक भाग के साथ Giemsa दाग समाधान के एक भाग के मिश्रण से 50 मिलीलीटर Giemsa धुंधला समाधान तैयार है और एक Coplin जार में डाल देना।
    2. 20 मिनट के लिए धुंधला समाधान में स्लाइड्स विसर्जित कर दिया।
    3. आसुत जल में स्लाइड्स कुल्ला अतिरिक्त दाग हटाने और तुरंत सुखाने के लिए एक बाल सुखाने का उपयोग कर स्लाइड।
    4. कमरे के तापमान पर स्लाइड रात भर छोड़ दें।
    5. स्लाइड पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद भी लागू करें, धीरे बढ़ते मध्यम पर एक coverslip जगह, मध्यम स्लाइड के साथ धीरे धीरे प्रसार करने के लिए अनुमति देते हैं, और निकालेंएक कागज तौलिया के साथ अतिरिक्त मध्यम। घुड़सवार स्लाइड चलती है या एक खुर्दबीन के नीचे देखने coverslip के आंदोलन से बचने के लिए करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
      सावधानी: यह इस कदम के दौरान किसी भी बुलबुले के गठन के बिना ध्यान से coverslip जगह के लिए महत्वपूर्ण है। अत्यधिक गर्मी के उपयोग के बुलबुले को दूर करने के लिए सिफारिश नहीं है।
  6. सूक्ष्म अवलोकन और विपथन प्रकार
    1. संरचनात्मक सीए की जांच करने metaphase 100X बढ़ाई पर फैलता है एक अच्छी गुणवत्ता वाले उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करने में।
    2. स्कोर कम से कम 50 से 100 metaphase उपचार है कि सीए की एक बड़ी संख्या के लिए प्रेरित करने के लिए प्रत्येक उपचार के समूह के लिए फैलता है। छोटे प्रभाव आकार के लिए, अप करने के लिए 300 metaphase फैलता के विश्लेषण की सलाह दी है।

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Representative Results

महान देखभाल टीएसपी पारखी के स्थान, साथ ही साल के समय जब संग्रह किया जाता है के चयन में लिया जाना चाहिए। रासायनिक संरचना के साथ ही कणों का आकार काफी परिणामों को प्रभावित कर सकता है। एकत्र सामग्री सफेद फिल्टर के खिलाफ दिखाई जानी चाहिए। एक सामान्य माउस metaphase प्रसार 40 acentric गुणसूत्रों होगा। तकनीक के लक्ष्य के नियंत्रण बनाम इलाज कोशिकाओं में असामान्य गुणसूत्रों के अनुपात में परिवर्तन (या उसके अभाव) का प्रदर्शन है। यही कारण है कि परिवर्तन तो (असामान्य गुणसूत्रों की संख्या) और योग्य (असामान्यताओं के प्रकार) मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

सामान्य माउस metaphase प्रसार 40 acentric गुणसूत्रों (चित्रा 3 ए) होगा। कण मामलों के साथ उपचार ऐसे chromatid तोड़ने के रूप में विभिन्न कैस के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, (3 बी), acentric टुकड़ा (लाती (3 डी), dicentric गुणसूत्र (3E), डबल मिनट (3F), Robertsonian translocation (3 जी), और endoreduplication (3H)। पूर्ण परिणामों के लिए, हमारे प्रकाशित एक अध्ययन में 12 को देखें।

आकृति 1
चित्रा 1. उच्च मात्रा की कुल निलंबित कणों (टीएसपी) नमूना। तस्वीर को टीएसपी नमूना एक शहरी क्षेत्र में एक ही छत में स्थापित परिवेश के कणों को इकट्ठा करने से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. भरा क्वार्ट्ज फाइबर फिल्टर निम्नलिखित संग्रह उच्च मात्रा टीएसपी s का उपयोग करकेampler। फिल्टर टीएसपी पारखी पर स्थापित पर बंद हुआ, उपयोग के बाद। ध्यान दें कि फिल्टर के रंग धूसर सफेद से बदल दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. बात कण के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज के बाद RAW264.7 कोशिकाओं में प्रेरित संरचनात्मक aberrations के विभिन्न प्रकार के प्रतिनिधि उदाहरण दिखा सूक्ष्मदर्शीफ़ोटोग्राफ़। aberrations तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। (ए) 40 अग्रकेंद्रिक गुणसूत्रों के साथ सामान्य metaphase प्रसार, (बी) chromatid प्रकार तोड़ (CTB), (सी) acentric टुकड़ा (acentrics), (डी) अंगूठी गुणसूत्र, (ई) dicentric गुणसूत्र (डीआईसी), (एफ) डबल मिनट (Dimn), ( (एच) endoreduplication (दोहराया गुणसूत्रों एक साथ आयोजित की जाती हैं)। मूल बढ़ाई 100X, पैमाने बार = 5 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Cytogenetic अध्ययन या नंबर या गुणसूत्रों, मुख्य रूप से metaphase फैलता में की संरचनाओं का सूक्ष्म विश्लेषण, सूचना रोग का निदान, जोखिम मूल्यांकन, और विभिन्न रोगों के लिए इलाज के लिए महत्वपूर्ण है। अब यह अच्छी तरह से स्थापित है कि cytogenetic असामान्यताएं प्रगति और कैंसर सहित कई बीमारियों के विकास के साथ जुड़े हुए हैं। तिथि करने के लिए, सीए सभी प्रमुख ट्यूमर प्रकार में पाया गया है। प्रमुख बाहरी जोखिम कारक है कि cytogenetic परिवर्तन 16 के विभिन्न प्रकार पैदा कर सकते हैं में से एक - सीए अनायास या इस तरह के विकिरण (आईआर) के रूप में या तो बाहरी या आंतरिक उत्तेजनाओं, द्वारा उत्पन्न हो सकती है। अवशोषित विकिरण खुराक के आकलन में कैस एड्स का विश्लेषण (cytogenetic विकिरण biodosimetry कहा जाता है)। इसके अलावा, आवृत्ति और विशिष्ट विपथन के प्रकार के विश्लेषण भी जानकारी विकिरण की गुणवत्ता निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण अवशोषित किया जा रहा 17, 18 है। Cytogenetic अध्ययन मैं का एक सीधा छवि प्रदान करता हैडीएनए पर हानिकारक एजेंटों की mpact। इस तरह के धूमकेतु परख के रूप में की अप्रत्यक्ष तकनीकों के विपरीत है। हालांकि, cytogenetic अध्ययन आंशिक रूप से कई हाथ पर शामिल कदम की वजह से विकिरण के बाहर खेतों में कम उपयोग किया गया है।

हालांकि प्रधानमंत्री में कार्बनिक कार्बन पेश करने के लिए जोखिम प्रतिकूल हमारे स्वास्थ्य को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है, कुछ जैविक प्रभाव रिपोर्टिंग अध्ययनों उनकी संरचना 9 शामिल हैं। यह महंगा है और बोझिल chromatographic तरीकों कि श्रम प्रधान निकासी, प्रसंस्करण, सांद्रता, और derivatization प्रोटोकॉल की आवश्यकता की वजह से है, जबकि वे केवल एक समय यौगिकों का एक बहुत ही विशेष प्रकार के एक छोटे सबसेट के लिए अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। इसके अलावा, प्रोटोकॉल परिणाम पर्याप्त हेरफेर या मूल नमूना के विनाश में, इस प्रकार, अतिरिक्त परीक्षण नहीं किया जा सकता। परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) के विश्लेषण के लाभ में शामिल एनएमआर एक गैर विनाशकारी तरीका है कि; यह काएं की एक बहुत ही सीमित संख्या की आवश्यकता हैपी एस (निष्कर्षण, एकाग्रता) विश्लेषण करने से पहले, और उच्च आवृत्ति एनएमआर उपकरणों (900 मेगाहर्ट्ज के लिए 400 मेगाहर्ट्ज से), कई में उपलब्ध नहीं है, तो सभी कर रहे हैं कोर सुविधा के भीतर विश्वविद्यालयों। वायुमंडलीय एयरोसोल एनएमआर अध्ययन का एक व्यापक समीक्षा की हाल ही में 19 प्रकाशित किया गया है। अंत में, संरचनात्मक जानकारी और समूहों के बीच बांड प्रदान करने की क्षमता की वजह से, एनएमआर ऐसे फुट आईआर, यूवी विज़, और रमन स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में अन्य spectrometric तरीकों कि केवल कार्य समूहों के प्रकार पर डेटा प्रदान करने के लिए बेहतर है। यदि आवश्यक हो, प्रधानमंत्री की रूपात्मक लक्षण वर्णन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के उपयोग के साथ एनएमआर स्पेक्ट्रोमेट्री के अलावा किया जा सकता है।

यहां तक ​​कि एक ही स्थान से, प्रधानमंत्री की संरचना वर्ष के समय के आधार पर भिन्न हो सकते हैं एकत्र। सामग्री का एक बड़ा पर्याप्त राशि संसाधित और दोहराने प्रयोगों या पूरक assays के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाना चाहिए। कदम 2.1.1 3.1.3 के माध्यम से एक BIOS में aseptically किया जाना चाहिएafety कैबिनेट। संदूषण या समझौता सेलुलर आकारिकी मनाया जाता है, प्रोटोकॉल के बाकी के साथ आगे बढ़ना नहीं है। trypsin उपचार समय सेल प्रकार के आधार पर समायोजित करने की जरूरत है। इधर, मैक्रोफेज बहुत पक्षपाती हैं और हमने पाया है कि 1 मिनट trypsin और स्क्रैप का एक संयोजन सबसे अच्छा काम करता है, लेकिन सबसे अधिक प्रकार की कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के कार्यों के लिए अकेले trypsin। Hypotonic उपचार समय भी सेल के प्रकार पर निर्भर करता है और मानकीकृत किया जाना चाहिए। colcemid की खुराक और उपचार समय गुणसूत्र तैयारी के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर कर रहे हैं; एक से अधिक खुराक कोशिकाओं को मारने या सेल चक्र दुकान कर सकते हैं। हम RAW264.7 कोशिकाओं के लिए यहां की परिस्थितियों का वर्णन है, और अनुकूलन के अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए आवश्यक है। विफलता इस चरण में आदर्श स्थितियों पर प्रतिकूल mitotic सूचकांक को प्रभावित कर सकता है और साथ ही गुणसूत्र आकृति विज्ञान, परिणामों को प्रभावित करने खोजने के लिए। यह भी पहले की cytogenetic विश्लेषण करने के लिए प्रधानमंत्री की cytotoxicity के स्तर का आकलन और उसके अनुसार खुराक का चयन करने के लिए सिफारिश की है।

इन विट्रो विषाक्तता आकलन इस्तेमाल कोशिकाओं, जोखिम परिमाण, और कण सांद्रता के प्रकार के द्वारा सीमित हैं। इसके अलावा, इस अध्ययन में, हम प्रधानमंत्री के पानी में घुलनशील निकालने का उपयोग किया और, इसलिए, cytogenetic aberrations पैदा करने के लिए पानी में अघुलनशील प्रजातियों के संभावित जिम्मेदार नहीं किया जा सकता है। अन्य सीमाओं "बहुरूपी वेरिएंट" की उपस्थिति के साथ जुड़े रहे हैं - centromeric क्षेत्रों और गुणसूत्र की छोटी बाहों में बदलाव; कुछ submicroscopic या गुप्त rearrangements कि गलत व्याख्या की जा सकती है और जटिल karyotypes की उपस्थिति।

यहाँ, हम उस cytogenetic विश्लेषण की शुरूआत के डीएनए के लिए प्रधानमंत्री प्रेरित नुकसान की पहचान करने में सहायता कर सकते हैं और संभावित स्वास्थ्य परिवेश PM के लिए जोखिम की वजह से प्रभाव के मूल्यांकन में एक भविष्य कहनेवाला समापन बिंदु के रूप में सेवा कर सकते हैं प्रदर्शित करता है। हमारे अध्ययन से हमारे ज्ञान, प्रधानमंत्री के जवाब में कैस इंगित करने के लिए पहली बार एक के लिए है। इन परिणामों की प्रतिकृति हैहमारे निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए वांछनीय। इस प्रोटोकॉल भी संदिग्ध डीएनए हानिकारक एजेंट के लगभग किसी भी प्रकार का आकलन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Acknowledgments

काम समर्थित किया गया था, जैविक अनुसंधान उत्कृष्टता [अनुदान संख्या 1P20GM109005], नेशनल एयरोनॉटिक्स एंड स्पेस एडमिनिस्ट्रेशन [अनुदान संख्या NNX15AK32A] के माध्यम से अरकंसास अंतरिक्ष अनुदान कंसोर्टियम के स्वास्थ्य केंद्र के राष्ट्रीय संस्थान और व्यावसायिक सुरक्षा के लिए राष्ट्रीय संस्थान और से स्वास्थ्य (NIOSH) [अनुदान संख्या 2T420H008436]। लेखकों proofreading और इस पांडुलिपि संपादन के लिए क्रिस्टोफर Fettes को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Total suspended particulate sampler Tisch Environmental TE-5170
Bruker Avance III NMR spectrometer  Bruker NA
TopSpin 3.5/pl2 software Bruker NA
ACD/NMR Processor Academic Edition ACD/Labs NA
RAW264.7 murine macrophages ATCC ATCC TIB-71
High glucose DMEM GlutaMAX media ThermoFisher 10569010 Warm in a 37 °C waterbath before use
Fetal Bovine Serum ThermoFisher 16000044 Warm in a 37 °C waterbath before use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) ThermoFisher 15140163 Warm in a 37 °C waterbath before use
Trypsin-EDTA (0.25%) ThermoFisher 25200056 Warm in a 37 °C waterbath before use
PBS, pH 7.4 ThermoFisher 10010049 Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Colcemid Solution in PBS ThermoFisher 15212012 Warm in a 37 °C waterbath before use
KaryoMAX Potassium Chloride Solution ThermoFisher 10575090 Warm in a 37 °C waterbath before use
Methanol (HPLC) Fisher Scientific A452N1-19
Acetic Acid, Glacial Fisher Scientific BP1185-500
Decon Contrad 70 Liquid Detergent Fisher Scientific 04-355-1
Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions Fisher Scientific 23-200733
Permount Mounting Medium Fisher Scientific SP15-100
Axio Imager 2 Zeiss NA

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References

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आनुवंशिकी अंक 118 परिवेश बात कण वायु प्रदूषण गुणसूत्र aberrations cytogenetic, बात कण संग्रह
परिवेश पार्टिकुलेट मैटर प्रेरित गुणसूत्र aberrations के विश्लेषण से एक का उपयोग<em&gt; इन विट्रो</em&gt; सिस्टम
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Miousse, I. R., Koturbash, I., Chalbot, M. C., Hauer-Jensen, M., Kavouras, I., Pathak, R. Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System. J. Vis. Exp. (118), e54969, doi:10.3791/54969 (2016).

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