Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטות כימות ואפיון של סטיות כרומוזומליות במבחנה מקרופאגים העכבר RAW264.7 לאחר הטיפול עם חומר חלקיקי באוויר הסביבה.
Abstract
חשיפה לחומר חלקיקי (PM) הוא החשש העיקרי בעולם הבריאות, אשר עשוי לגרום נזק לרכיבים תאיים שונים, לרבות החומר הגנטי גרעיני. כדי להעריך את ההשפעה של PM על שלמות גנטית גרעינית, סטיות כרומוזומליות מבניות הבקיע מתפשט metaphase של תאי מקרופאג העכבר RAW264.7. PM נאסף מאוויר הסביבה עם סמפלר חלקיקים מרחף הכולל בנפח גבוה. החומר שנאסף solubilized ומסוננים לשמור על מסיסים במים, חלק בסדר. החלקיקים מאופיינים עבור הרכב כימי על ידי ספקטרוסקופיה בתהודה מגנטית גרעינית (NMR). ריכוזים שונים של השעית חלקיק מתווספים על תרבות במבחנה של מקרופאגים עכבר RAW264.7 במשך זמן חשיפה כולל של 72 שעות, יחד עם לתאי קבוצת ביקורת. בסוף החשיפה, התרבות מטופלת עם colcemid לעצור תאי metaphase. תאים אז שנקטפו, שטופלו פתרון hypotonic, קבוע acetomethanol, דropped גבי שקופיות זכוכית ולבסוף מוכתם פתרון Giemsa. שקופיות נבדקות כדי להעריך את סטיות כרומוזומליות מבניות (CA) ב metaphase פורשת בהגדלה 1,000X באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר. 50 עד 100 התפשטות metaphase הם הבקיע עבור כל קבוצת הטיפול. טכניקה זו מותאמת לצורך זיהוי של סטיות כרומוזומליות מבניות (CA), כגון הפסקות כרומטידה מסוג כרומטידה מהסוג חילופי, שברי acentric, כרומוזומים dicentric וטבעת, דקות כפולות, endoreduplication, ו טרנסלוקציות Robertsonian במבחנה לאחר חשיפת PM. זוהי שיטה רבת עוצמה כדי לשייך הסיום ציטוגנטית ומבוססת לשינויים אפיגנטיים.
Introduction
הערכה הוא כי חשיפה לחומר חלקיקים (PM) גורמת מעל 3 מיליון מקרי מוות מדי שנה עודפת, בעיקר ממחלות לב-ריאה וסרטן ריאות סרטן 1. ואכן, אחר הצהריים הוכר מסרטנים לבני אדם על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן (קבוצה 1), כמו סיכון מוגבר לסרטן ריאות עם העלייה ברמות החשיפה PM הוכח 2. מעניין לציין שכמעט כל תאי סרטן נמל ליקויים מספריים ו / או מבניים כרומוזומליות. פחמן אורגן חלקיקים הנו נגזר, מורכב, תערובת הטרוגנית, אשר תלוי הפצת רכב וגדל על פליטה גם לשינויים פיסיים וכימיים. זה החשבונות של 35-55% ממסת עירוני PM 2.5 (PM 2.5 מיקרומטר בגודל קטן יותר) ויותר מ 60% של PM רקע כפריים קונטיננטלית 2.5 המונית 3, 4. השבר המסיס במים מהווה 30-90% של תרסיס אורגני. מספר רב של תרכובות אורגניותזוהה, כולל פחמימנים אליפטיות, פחמימנים ארומטיים פוליציקליים, ונגזר מחומצן ו הניטריות שלהם, אלדהידים ו כהלי aliphatic, חומצות שומן חופשיות ומלחיהם, חומצות קרבוקסיליות-di, תרכובות רבות תכליתיות, חלבונים, מקרומולקולות דמוי גומין (HULIS) באמצעות שיטות chromatographic בשילוב עם טכניקות ספקטרומטריה 5-8. תרכובות אלה מהוות פחות מ 10-20% של פחמן אורגן חלקיקים, ובכך ביותר של פחמן אורגני היא 9 ידוע.
ראיה נסיונית עולה כי cytotoxicity, סטרס חמצוני, ודלקת מעורבים בהתפתחות מצבים פתולוגיים הקשורים PM. הוכח לאחרונה, עם זאת, כי חשיפת PM גם תוצאות מספר שינויים אפיגנטיים, כוללים שינויי מתילציה DNA של אלמנטים חוזרים, בשני ניסיוני במערכות במבחנה בבני אדם 10-12. מעניין במיוחד הן ההשפעות שלPM על DNA לווין - לווינים ראשיים ומשניות - אשר נמצאים באזור הטרוכרומטין ברחבי centromere של הכרומוזומים. זה היה הראה כי תופעות אלה עשויות להיות עקביות מטבעו, כפי שהם יכולים להיות מזוהים לפחות 72 שעות לאחר חשיפת 12. שינויים מתילציה DNA, במיוחד סביב צנטרומר, עלול לגרום להצטברות של תעתיקי mRNA DNA לווין, פשרה שלמות כרומוזומליות במהלך חלוקת התא, ולאחר מכן, לגרום להתפתחות של מגוון מצבים פתולוגיים 13.
התאמת הגישה ציטוגנטית לניתוח CAs כמו שינויי נקודת סיום של אפיגנטיים הנגרמים על ידי ראש הממשלה, ובכך, היא בעלת חשיבות גבוהה. כאן אנו מדווחים הגישה לאיסוף PM הסביבה והכנת, בחשיפה במבחנה וניתוח של רשויות אישורים באמצעות מערכת מודל בעכברים מקרופאג RAW264.7. המקרופאגים מהווים את קו ההגנה הראשון נגד הגופים הזרים בשאיפה, ולכן לאקו התאו משמש הקים את המודל הנפוץ ביותר ב טוקסיקולוגיה חלקיקי 11, 12, 14, 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חלקיקי איסוף הכנה
- כיול של סמפלר החלקיקים המרחפים הכולל נפח גבוה
- ניתקתי את מנוע סמפלר מבקר הזרימה ההמונית ולחבר את המנוע למקור חשמל AC יציב (איור 1).
הערה: מסנן אינו משמש במהלך הליך זה. - הר פתח כיל צלחת מתאם טעינת הדף אל סמפלר. הדק את האומים בהמתנה למטה מתאם טעינת הדף באופן מאובטח, כדי לוודא ששום דליפות אוויר נוכחים. הנח למנוע סמפלר להתחמם לטמפרטורת התפעול הרגילה שלו (כ 10-15 דקות).
- לערוך בדיקת דליפה ידי כיסוי החורה על גבי הברז פתח ולחץ על הפתח עם ידות. תקשיב עבור צליל חריקה צורמני שנעשה על ידי שפרץ אוויר. אם זה נשמע נשמע, הדק מחדש את האגוזים בהמתנה למטה מתאם טעינת הדף כמו דליפה הוא ההווה. אם הצליל הוא נמוך, ההדלפה היא ליד אחד האטמים האחרים sysTEM.
- חבר צד אחד של מד המים אל הברז הלחץ בצד של פתח עם צינור ואקום גומי. השאירו את הצד הנגדי של מד פתוח לאטמוספרה. חזק מנומטר אנכית כדי להבטיח קריאה מדויקת. קשה על הישבן של מקליט הזרימה הרציף יעזור כדי למרכז את העט ולספק קריאה מדויקת.
- חזור על שלב 1.1.2 באמצעות חמש ספיקות המייצג ספיקות הפעלה מ -30 ל -60 רגל / דקה (בערך כל 5-6 ft 3 / min). התאם את הידית על הפתח משתנה עד חמש עמדות שונות ולקחת חמש קריאות שונות.
- רשום את טמפרטורת אוויר הסביבה, לחץ הברומטרי סביבה, מספר סידורי סמפלר, מספר סידורי פתח, מדרון פתח וליירט עם תאריך המוסמך האחרון, התאריך, מיקום אתר, וראשי התיבות של המפעיל על גיליון הכיול.
- ניתקתי את מנוע סמפלר מבקר הזרימה ההמונית ולחבר את המנוע למקור חשמל AC יציב (איור 1).
- אוסף מדגם חלקיקים סה"כ מושעה גרווימטריה
- לעטוף8 "x 10" מסנן סיבים קוורץ בשתי שכבות של נייר אלומיניום. מניחים את המסנן עטוף בכבשן ולהגדיר את הטמפרטורה C ° 550. אופים את המסנן לפחות שעה 4. תן מגניב התנור ולאחזר את המסנן. מניח את מסנן הייבוש עם קאקו 3.
- לשקול את המסנן בתוך microbalance בדייקנות של 10 מיקרוגרם. חזור שלוש פעמים המדידות במהלך יום. מדידות פרט צריכות להיות בתוך 25 מיקרוגרם. אם זה לא יושג, להחזיר את המסנן העטוף אל הייבוש וחזור על התהליך למחרת.
- פתח את המכסה מחסה (איור 2). סור מסגרת בעל מסנן ידי שחרור ארבעת אגוזי הכנף, המאפשרים מנעולי פליז דיסקיות להניף מטה מהדרך. לפתוח את הסינון מכל רדיד האלומיניום, להשתמש במלקחיים ניקו למרכז אותו בזהירות, בצד מחוספס למעלה, על המסך תומך. כראוי ליישר את המסנן על המסך.
- מניח את המסגרת על המסך לאבטח אותו עםאת הברגים דיסקיות פליז תוך הפעלת לחץ מספיק כדי למנוע דליפת אוויר בקצוות. נגב כל הצטברות אבק מרחבי בעל מסנן עם מטלית נקייה. מכסה מחסה קרובה בזהירות את הדלת במקומה.
- ודא את כל כבלי מחוברים לאותה שקעי הקיבול המתאימים שלהם ואת הצינורות בין ברז לחץ מנוע מפוח ואת מקליט הזרימה הרציף מחוברים.
- הכן את מקליט הזרימה. לדכא מרים זרוע עט להעלות נקודת עט וכנס תרשים חדש. יישר את הכרטיסייה של התרשים לרכזת הכונן של הצורב ולחץ עם אגודל להנמיך מרכז תרשים על רכזת. גדר זמן על ידי החלפה של רכזת הכונן חכם שעון עד השעה הנכונה על תרשים מיושרת עם מצביע מדד הזמן.
- ידני לעבור על סמפלר ולהתחיל האוסף. צג המקליט כדי להיות בטוחים שזה הוא דיות כראוי ומחוון הזמן שחלף כדי להיות בטוח שזה פועל כהלכה.
- בסוף תקופת הדגימה, לכבות את סמפלר, שיאשחלף זמן ולאחזר בתרשים. הסר את המסגרת לחשוף את המסנן. הסר את המסנן החשוף מהמסך התומכים ידי החזיק אותו בעדינות בקצות עם המלקחיים. מקפלים את המסנן לאורכו כך מדגם נוגע מדגם פעמיים ולעטוף אותו בנייר אלומיניום המקורי.
- אחסן את מסנן ייבוש עם קאקו 3 עבור לפני 24 שעות לפחות מלשקול. חזור על שלב 1.2.2 למדוד את המשקל של מסננים לאחר הדגימה. מניחים את המסנן בתוך שקית ניילון zip ולאחסן אותו -80 ° C עד הניתוח.
- ניתוח של מדגם חלקיקים מרחפים שנגבו
- תחזר את המסנן המאוחסן, ופתח את רדיד האלומיניום ולהעביר את המסנן על משטח טפלון נקי. בעזרת מלקחי אזמל, לחתוך חיצוני (לבן) חלק המסנן ועושה.
- בשלב הבא, לחתוך את המסנן 0.5 חתיכות "x 0.5" ופיסות מקום בבקבוק 100 מ"ל. הוסף 50 מ"ל מים ultrapure. מניחים את הבקבוק ב אולטרסאונדאמבטיה sonicate במשך 60 דקות ב 33 ± 3 קילוהרץ.
- תמצית סינון דרך מסנן מזרק פוליפרופילן 0.45 מיקרומטר בבקבוק 100 מ"ל עגול התחתונה. לאדות את המים באמצעות מכשיר rotavap בלחץ על 50 מעלות צלזיוס עד כ -5 מ"ל של תמצית נשאר בבקבוק.
- לאדות את המים שנותרו בבקבוק 15 מ"ל בצורת אגס במשקל ידוע. לשקול את הבקבוק עם התמצית היבשה ולהקליט את המסה של התמצית היבשה.
- ממיסים את המדגם יבש עם 400 μl של D 2 O על ידי sonicating במשך 15 דקות ולהעביר לתוך צינור NMR 5 מ"מ סטנדרטי. צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 12,000 בטמפרטורת החדר כדי להסיר כל חומר שלא נמס.
- אני חוזר עם 300 μl של D 2 O. הוסף 10 μl של NaN 3 1.4% (קונצרט כלשהו הסופי .: 0.02% w / v) בצינור NMR. הוסף 10 μl (32 מיקרוגרם) של חלקיקים מרחפים (TSP) -d4 (3.2 מ"ג / מ"ל) ל D 2 O (ריכוז סופי 0.258 מ"מ) בצינור NMR.
- רוכשת 1 ספקטרום NMR H באמצעות ספקטרומטר תמ"ג הפועל 600.17 MHz.
- הכנס NMR צינור לתוך cryoprobe התהודה המשולש. כייל את המכשיר על פי הסדר הבא: מנעול, מנגינה, שים, 90 כיול אורך ° דופק וכוונון רווח מקלט.
- מדוד ספקטרום של 25 מעלות צלזיוס עם רצף פיסול עירור 1 D באמצעות 180 פולסים מים סלקטיבית מצב זיהוי Quad הדיגיטלי, 8,192 סריקות, 4 סריקות דמה, רוחב לטאטא של 8012.57 הרץ, תדר לקזז עבור דיכוי אות מים נקבע על 4.70 ppm, 1.70 שניות זמן רכישה, 32,768 זמן נקודות נתונים מושלמים (TD), 1 שיפוע משך msec (p16), 100 μsec עיכוב התאוששות לאחר השיפוע (D16).
- תהליך 1 ספקטרום NMR H ידי החלת הרחבת קו של 1 הרץ ואפס מילוי בפקטור של 2 (65,536 נקודות נתונים). תקן את הפאזה בסיס ידני ולשלב. גדר שיא TSP-D4 ב 0.0 עמודים לדקה.
- תחזר את המסנן המאוחסן, ופתח את רדיד האלומיניום ולהעביר את המסנן על משטח טפלון נקי. בעזרת מלקחי אזמל, לחתוך חיצוני (לבן) חלק המסנן ועושה.
חשיפת חלקיקים 2.
- תרבות להגדיר
- תקשורת צמיחה להשלים חמה המכילה 10% בסרום שור עובר (FBS) פתרון סטרפטומיצין פניצילין (100 U / ml), פתרון טריפסין 0.25% ו חיץ מלוח פוספט חינם מגנזיום סידן (PBS) באמבט מים (ב 37 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות לפחות לפני תחילת התרבות.
- להוציא בבקבוק T75 מן החממה 5% CO 2 המכילה תאי RAW264.7 תרבותיים לשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של פעמים מחוממות מראש שני PBS.
- לסלק תאים RAW264.7 חסיד מתחתית כלי התרבות רקמות באמצעות 1 מ"ל של תמיסת טריפסין מחומם מראש ואחריו גירוד.
- אוסף את תאי מאוניה בתרבית רקמה ולעשות השעית תא בודדת על ידי pipetting חזר. ספירת תאים עם כחול צלחת trypan בצפיפות של 8,000 / 2 ס"מ (500,000 תאים בסך הכל) בצלחת תרבות 100 מ"מ רקמת עם התקשורת להשלים מחומם מראש. כיוון עוצמת התקשורת ל -10 מ"ל ריכוז סופי של 50,000 תאיםלכל מיליליטר.
הערה: להכפיל את מספר צלחות אם הניתוח מתילציה DNA הוא גם ביצע. - מניח את תאי RAW264.7 המצופים החדש בחזרה 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ולאפשר לצרף למשך 24 שעות.
- גם בתוך ארון בטיחות ביולוגית, resuspend חלקיקים מסוננים. לדוגמה, לדלל חלקיקים בריכוז של 0.5 מ"ג / מ"ל ב PBS סטרילי עבור מנה טיפול 5 מיקרוגרם / מ"ל ו 5 מ"ג / מ"ל עבור מנה טיפול 50 מיקרוגרם / מ"ל. דילולים יכול להיות מוכן עד חודש מראש ולאחסן ב -80 ° C.
- טיפול עם חומר חלקיקי
- קח את התאים מן החממה 5% CO 2 ולבדוק בהגדלה 10x באמצעות מיקרוסקופ הפוכה עבור צמיחת תאים, מורפולוגיה התא, מצב התרבות, וזיהום. אף אחד יכול לצפות שיהיו לפחות תאים ומחוברים 30% בשלב זה.
- בסביבה נקייה מחיידקים, לשאוב את התקשורת באמצעות פיפטה מעוקרים לשטוף את כלי התרבות עם 2 מ"ל 37 ° C PBSפעמיים כדי להסיר את המדיה ואת צף או תאים מתים לגמרי.
- להוסיף מנה שנקבעה מראש של חומר חלקיקים עם תקשורת טריה בכלי תרבות דגירה במשך זמן רצוי על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 באינקובטור. במחקר זה, לטפל בתאים RAW264.7 עם ראש הממשלה במשך 72 שעות כדי מקבילים החשיפה לשמש לניתוח genotoxic ו epigenotoxic במקביל.
הערה: Cytotoxicity עשוי להשפיע לרעה על איכות הניתוח ציטוגנטית. לכן, מבחנים נוספים כגון רעילות, מתילציה DNA, מערבי סופגים, או ניתוח ביטוי גנים בדרך כלל מבוצעים על בתאים שטופלו. לחשוף תאים כמתוארים והמשך עם assay הספציפי רצוי. משתמשים לא מנוסים מומלץ גם לכלול שליטה חיובית כגון methanesulphonate מתיל כדי לבחון את היכולת שלהם לזהות CAS.
3. Assay ציטוגנטית
- טיפול לעצור תאים metaphase
- מומלץ לחמם את colcemid כךlution (10 מיקרוגרם / מ"ל) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. נגבו את המכסה עם אלכוהול 70% מתחת לארון biosafety כדי למזער את הסיכון של זיהום
- להסיר לחלוטין את התקשורת בסביבה נקייה מחיידקים ולשטוף את כלי תרבות עם 2 מ"ל פעמים מחומם מראש שני PBS.
- הוסף מדיה טריה מחומם מראש (2 מיליליטר מדיה / 10 6 תאים) המכיל פתרון colcemid (5 μl / מיליליטר) ב כלי תרבות דגירה במשך שעה 2.
- תא קציר
- פתרון טריפסין חם PBS באמבט מים על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. משלב זה ואילך, אין צורך לשמור על מצב ספטית.
- להסיר לגמרי את התקשורת, לשטוף את כלי תרבות עם 2 מ"ל 37 ° C PBS עבור שתי פעמים, להוסיף נפח הנדרש פתרון טריפסין מחומם מראש (בדרך כלל 2 מ"ל למנה תרבות 60 מ"מ או בקבוק T25 ו -4 מ"ל עבור 100 מ"מ צלחת או בקבוק T75 ,) ומקום כלי התרבות בחזרה 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
- טאקדואר את כלי התרבות, לנתק את התאים באמצעות מגרד, ולהוסיף 10 מ"ל של PBS להפסיק פעולה טריפסין.
- פיפטה מעלה ומטה לפחות עשר פעמים לעשות ההשעיה תא בודד ותאי העברת צינור צנטריפוגות התחתונה חרוטי 15 מ"ל.
- צנטריפוגה השעית תא ב 400 XG במשך 5 דקות בתוך ונדנדה צנטריפוגות בטמפרטורת חדר.
- הסר את supernatant, לשבור את התא גלולה על ידי הקשה עדינה, ולהוסיף 10 מ"ל של PBS, ושוב צנטריפוגות במשך חמש דקות.
- טיפול וקיבוע hypotonic
- טרום חם 0.075 פתרון כלוריד M אשלגן באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לפחות למשך 30 דקות.
- הסר supernatant מבלי להפריע גלולה התא ולהשאיר כ 0.5 מ"ל של PBS.
- בעדינות לשבור את התא גלול ולעשות השעית תא בודדת באמצעות פיפטה P200.
- הוסף 4 מ"ל של ירידה פתרון כלוריד מחומם מראש אשלגן אחר טיפה עם רעד עדין.
- דגירת תאי p hypotonicפתרון כלוריד otassium באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
- בצע פתרון acetomethanol טרי ידי הוספת מתנול 3-חלקים עם חומצה אצטית קרחונית 1-חלק. שמור טרי זה מקבע מוכן בטמפרטורת החדר.
- לאחר טיפול hypotonic, להוסיף נפח שווה (4 מ"ל) של מקבע בצינור בעדינות לערבב את הפתרון על ידי צינור היפוך.
- צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולהסיר את supernatant. בשעה מגדילה גודל תא גלולה בשלב זה, להיות לבנבן ועוד גלוי.
- הסר supernatant, להוסיף 4 מ"ל מקבע טרי לשמור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה ב 400 XG במשך 5 דקות, להסיר supernatant, ולתת שתי שוטף יותר עם מקבע 4 מ"ל.
- ניקוי שקופיות והכנת התפשטות metaphase
- לטבול שקופיות זכוכית לחלוטין בנוזל כביסה 10% למשך 30 דקות.
- יש לשטוף את השקופיות ביסודיות במי ברז קרים למשך 30 דקות.
- ריןse מחליק שלוש פעמים במים מזוקקים כדי להסיר חומר ניקוי לחלוטין, לטבול במים מזוקקים, ולאחסן במקרר לשימוש עתידי.
הערה: ניקוי שקופיות לפני השימוש הופך לפשוט אחידות מתפשטת ומגדיל איכות metaphase. - זרוק השעית תא 10 μl בשקופית רטובה מצוננת ולאפשר לו לאוורר לילה יבש בטמפרטורת חדר.
- מכתים ואת הרכבה
- הכן 50 מ"ל פתרון מכתים Giemsa ידי ערבוב חלק אחד של פתרון צביעת גימזה עם חלק אחד של PBS ויוצקים בצנצנת Coplin.
- לטבול את השקופיות פתרון מכתים במשך 20 דקות.
- יש לשטוף את השקופיות במים מזוקקים כדי להסיר את הכתם עודף ומיד לייבש את השקופיות באמצעות מייבש שיער.
- השאירו את השקופיות בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- למרוח טיפה אחת של הרכבה בינונית בשקופית, בעדינות במקום coverslip על הרכבה בינונית, לאפשר המדיום להתפשט על פני שקופיות לאט, ולהסירהמדיום העודף עם מגבת נייר. אפשר השקופית רכובה להתייבש במשך לפחות שעה 1 לפני שהם עוברים או הצגה תחת מיקרוסקופ כדי למנוע תנועה של coverslip.
זהירות: חשוב למקם את coverslip בזהירות מבלי להרכיב כל בועות במהלך שלב זה. השימוש חום מופרז כדי להסיר בועות אינו מומלץ.
- סוגי התבוננות סטייה מיקרוסקופיות
- לבחון את הרשויות המבניות metaphase פורש בהגדלת 100X באמצעות מיקרוסקופ באיכות טובה שדה בהיר.
- ציון לפחות 50 עד 100 metaphase מתפשטים לכל קבוצת טיפול טיפולי משרי מספר רב של רשויות אישורים. עבור גודלי אפקט קטן, הניתוח של עד 300 מתפשט metaphase מומלץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בזהירות רבה יש לנקוט בבחירת המיקום של סמפלר TSP, כמו גם את הזמן של השנה כאשר מתבצע איסוף. ההרכב הכימי כמו גם את הגודל של חלקיקים עשויים להשפיע על התוצאות באופן משמעותי. החומר שנאסף צריך להיות גלוי נגד המסנן הלבן. התפשט metaphase עכבר רגיל יהיו 40 כרומוזומים acentric. מטרת הטכניקה היא להפגין שינוי (או ובהעדרו) בשיעור של כרומוזומים לא נורמלים בתאים שטופלו לעומת נבדקי ביקורת. שינוי זה ניתן לכמת אז (מספר כרומוזומים נורמלי) ומוסמך (סוג של מומים).
התפשטות עכבר metaphase הרגילה תהיה 40 כרומוזומים acentric (איור 3 א). טיפול בענייני חלקיקי גורם CAs השונה כפי שמוצג באיור 3, כגון הפסקת כרומטידה (3B), שבר acentric (
איור 1. חלקיקים הכולל מושעה בנפח גבוה (TSP) סמפלר. התמונה מציגה את סמפלר TSP מותקן גג באזור עירוני לאסוף חלקיקי סביבה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. טעון קוורץ מסנן סיבים אוסף הבאים באמצעות s TSP בנפח גבוהampler. מקרוב על המסנן מותקן על סמפלר TSP, לאחר השימוש. ראוי לציין, כי הצבע של המסנן השתנה מלבן לאפור. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. Photomicrograph מראה דוגמאות מייצגות של סוגים שונים של סטיות מבניות מושרות בתאי RAW264.7 לאחר טיפול עם ריכוזים שונים של חומר חלקיקים. הסטיות מסומנות על ידי חצים. (א) התפשטות נורמלי metaphase עם 40 כרומוזומים acrocentric, (ב) הפסקה כרומטידה מסוג (CTB), (ג) שבר acentric (acentrics), (ד) טבעת כרומוזום, (E) כרומוזום dicentric (DIC), (F) כפול דקות (Dimn), (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר ציטוגנטית או ניתוח מיקרוסקופי של מספרים או מבנים של כרומוזומים, בעיקר מתפשט metaphase, מספק מידע חיוני עבור הפרוגנוזה, הערכת סיכונים, וטיפול במחלות שונות. עכשיו זה מבוסס היטב, כי אבנורמליות ציטוגנטית מקושרת עם ההתקדמות והתפתחות של מחלות שונות, לרבות סרטן. נכון להיום, קאש נמצא בכל סוגי הגידולים העיקריים. CAs עלול להתעורר באופן ספונטני או על ידי אחד לגירויים חיצוניים או פנימיים, כגון קרינת מייננת (IR) - אחד מגורמי הסיכון החיצוניים הגדולים שיכול לגרום סוגים שונים של שינויים ציטוגנטית 16. ניתוח של עזרי CAs בהערכה של מינון הקרינה הנספגת (המכונה biodosimetry קרינה ציטוגנטית). יתר על כן, הניתוח של תדירות וסוג הסטייה ספציפית גם מספק מידע חשוב בקביעת איכות הקרינה להיקלט 17, 18. מחקר ציטוגנטית מספק תמונה ישירה של impact של סוכנים המזיקות על DNA. זאת בניגוד לטכניקות עקיפות כגון assay השביט. עם זאת, המחקר ציטוגנטית כבר מתחת מנוצל בתחומים מחוץ קרינה, בין השאר בגלל הידיים על רבים השלבים הכרוכים.
למרות החשיפה הנוכחית פחמן אורגני PM ידוע להשפיע לרעה על בריאותנו, כמה מחקרים המדווחים על השפעות ביולוגיות נמנים הרכב שלהם 9. זאת בשל שיטות chromatographic היקרות ומסורבלות הדורשות מיצוי עתיר עבודה, עיבוד, ריכוזים, ופרוטוקולי derivatization, בזמן שהם רק לספק תובנה עבור קבוצה קטנה של סוג מסוים מאוד של תרכובות בכל פעם. יתר על כן, הפרוטוקולים לגרום מניפולציה או הרס המשמעותי של המדגם המקורי, ובכך, בדיקות נוספות לא ניתן לבצע. יתרונותיו של ניתוח תהודה מגנטית גרעינית (NMR) כוללים כי התמ"ג היא שיטה בלתי הרסניות; זה דורש מספר מצומצם מאוד של steנ.ב. (מיצוי, ריכוז) לפני הניתוח, ומכשירי NMR בתדירות גבוהה (מ -400 MHz ל -900 MHz) זמינים רבים, אם לא כולם, אוניברסיטות בתוך מתקן הליבה. סקירה מקיפה של מחקרי תמ"ג אירוסול אטמוספרי פורסמה 19 לאחרונה. לבסוף, בשל יכולתה לספק מידע מבני הקשרים בין קבוצות, NMR עדיפה על שיטות spectrometric אחרות כגון FT-IR, UV-Vis, ו ספקטרומטריית ראמאן שרק לספק נתונים על הסוג של קבוצות פונקציונליות. במידת הצורך, אפיון מורפולוגי של PM ניתן לבצע בנוסף ספקטרומטריית NMR עם השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
גם ממיקום יחיד, הרכב PM שנאסף עשוי להשתנות תלוי בזמן של השנה. כמות מספיקה גדולה של חומר צריכה להיות מעובד והמשיכה ב -80 מעלות צלזיוס במשך ניסויים חוזרים או מבחני משלימים. צעדים 2.1.1 דרך 3.1.3 צריכה להתבצע בסביבה נקייה מחיידקים בתוך ה- BIOS ארון afety. אם זיהום או מורפולוגיה תאית נפגעת הוא ציין, לא להמשיך עם שאר הפרוטוקול. שעת טיפול טריפסין צריכה להיות מותאמת המבוססת על סוג התא. הנה, מקרופאגים הם מאוד חסידים מצאנו כי שילוב של 1 הדק 'טריפסין גירוד עובד הכי טוב, אבל טריפסין לבד במשך 5 יצירות דקות עבור סוגי התאים ביותר. זמן טיפול hypotonic גם משתנה בהתאם לסוג תא צריך להיות אחיד. השעה המינון וטיפול colcemid הם הפרמטרים החשובים ביותר להכנת כרומוזום; במינון מעל יכול להרוג את התאים או לעכב את מחזור התא. אנו מתארים כאן תנאי תאי RAW264.7, ואופטימיזציה נדרש עבור סוגי תאים אחרים. אי למצוא תנאים אידיאליים בשלב זה עלול להשפיע לרעה על מדד mitotic וכן מורפולוגיה כרומוזום, אשר השפיעו על התוצאות. מומלץ גם כדי להעריך את רמות רעילות של ראש הממשלה לפני ניתוח ציטוגנטית ובחר את המינונים בהתאם.
= "jove_content"> מבחינה מושגית, במבחנה הערכות טוקסיקולוגית מוגבלים על ידי סוג של תאים המשמשים, גודל החשיפה, וריכוזי החלקיקים. יתר על כן, במחקר זה, השתמשנו תמצית המסיסה במים של ראש הממשלה, אם כן, את הפוטנציאל של מיני מים מסיסים לגרום סטיות ציטוגנטית עשוי לא יילקח בחשבון. מגבלות אחרות קשורות עם הנוכחות של "גרסות צורות" - וריאציות באזורי centromeric וזרועות קצרות של כרומוזום; כמה submicroscopic או rearrangements נסתר כי עלול להתפרש שלא כהלכה ואת הנוכחות של קריוטיפ מורכב.
הנה, אנחנו מדגימים כי הנהגת ניתוח ציטוגנטית עשויה לסייע בזיהוי של נזק הנגרם PM ל- DNA, וייתכן לשמש נקודת הסיום מידע צופה פני הערכה של ההשפעות הבריאותיות הנגרם על ידי חשיפה PM הסביבה. המחקר שלנו הוא, למיטב ידיעתנו, הראשון לציון CAs בתגובת PM. שכפול של התוצאות הללו הוארצוי לאשר את הממצאים שלנו. פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם כדי להעריך כמעט כל סוג של סוכן מזיק DNA חשד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
העבודה נתמכה, בין השאר, על ידי המכון הלאומי של המרכז לבריאות של אקסלנס למחקר ביולוגי [מספר מענק 1P20GM109005], הקונסורציום ארקנסו שטח גרנט דרך התעופה הלאומית שטח המינהל [NNX15AK32A מספר מענק], לבין המכון הלאומי לבטיחות תעסוקתית בריאות (NIOSH) [מספר מענק 2T420H008436]. המחברים מבקשים להודות כריסטופר Fettes עבור הגהה ועריכה כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , Springer. 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
