Summary
Denne protokol beskriver teknikker til kvantificering og karakterisering af kromosomafvigelser in vitro i RAW264.7 mus makrofager efter behandling med den omgivende luft partikler.
Abstract
Udsættelse for partikler (PM) er en af verdens største sundhedsproblem, der kan ødelægge forskellige cellulære komponenter, herunder den nukleare genetiske materiale. For at vurdere virkningen af PM om nuklear genetiske integritet, er strukturelle kromosomafvigelser scoret i de metafasespredninger af mus RAW264.7 makrofagceller. PM er indsamlet fra den omgivende luft med en samlet høj lydstyrke suspenderede partikler sampler. Det opsamlede materiale solubiliseres og filtreres til at tilbageholde den vandopløselige, fin portion. Partiklerne er kendetegnet for kemisk sammensætning ved kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Forskellige koncentrationer af partikelsuspension bliver tilføjet på en in vitro-kultur af RAW264.7 musemakrofager til en samlet eksponeringstid på 72 timer, sammen med ubehandlede kontrolceller. Ved slutningen af eksponeringen, er kulturen behandlet med colcemid at anholde celler i metafase. Celler høstes dernæst, behandlet med hypotonisk opløsning, fikseret i acetomethanol, dropped på objektglas og endelig farvet med Giemsa-opløsning. Slides undersøges for at vurdere de strukturelle kromosomafvigelser (CAS) i metafase spreder på 1.000X forstørrelse ved hjælp af en lys-felt mikroskop. 50 til 100 metafasespredning scores for hver behandlingsgruppe. Denne teknik er tilpasset til detektion af strukturelle kromosomforandringer (CAS), såsom kromatidtypen-typen pauser, udveksling kromatidtypen-type, acentriske fragmenter, dicentric og ring kromosomer, dobbelt minutter, endoreduplikation og Robertsonian translokationer in vitro efter udsættelse for PM. Det er en kraftfuld metode til at knytte en veletableret cytogenetisk endpoint til epigenetiske ændringer.
Introduction
Det er blevet anslået, at eksponering for partikler (PM) forårsager over 3 millioner overskydende dødsfald årligt, primært fra hjerte-sygdomme og lungekræft 1. Faktisk PM blev anerkendt som kræftfremkaldende for mennesker af Det Internationale Agentur for Kræftforskning (gruppe 1), en øget risiko for lungekræft med stigende eksponering for PM er blevet vist 2. Interessant, næsten alle kræftceller havnen numeriske og / eller strukturelle kromosomafvigelser. Partikler organisk kulstof er en variant, kompleks og heterogen blanding, hvis sammensætning og størrelse fordeling afhænger af emissioner samt fysiske og kemiske omdannelser. Den tegner 35-55% af byerne PM 2,5 masse (PM 2,5 um i størrelse og mindre) og mere end 60% af baggrunden landdistrikter og kontinentale PM 2,5 masse 3, 4. Den vandopløselige fraktion udgør 30-90% af organisk aerosol. Et stort antal organiske forbindelserer blevet identificeret, herunder alifatiske carbonhydrider, polycykliske aromatiske kulbrinter og deres oxygenerede og nitroderivater, alifatiske aldehyder og alkoholer, frie fedtsyrer og deres salte, dicarboxylsyrer, multifunktionelle forbindelser, proteiner og humus-lignende makromolekyler (HULIS) under anvendelse kromatografiske metoder kombineret med massespektrometrisk teknikker 5-8. Disse forbindelser udgør mindre end 10-20% af partikulært organisk kulstof, og dermed de fleste af organisk kulstof er ukendt 9.
Eksperimentelle beviser antyder, at cytotoksicitet, oxidativt stress og inflammation er involveret i udviklingen af PM-associerede patologiske tilstande. Det har for nylig vist, dog, at eksponering for PM resulterer også i en række epigenetiske ændringer, herunder ændringer i DNA-methylering af repetitive elementer, i både eksperimentelle in vitro systemer og i humane individer 10-12. Af særlig interesse er virkningerne afPM på satellit-DNA - større og mindre satellitter - som findes i heterochromatic regionen omkring centromeren af kromosomer. Det blev vist, at disse virkninger kan være persistente af natur, da de kan påvises i mindst 72 timer efter eksponering 12. Ændringer i DNA-methylering, især omkring centromerer, kan føre til akkumulering af satellit-DNA-mRNA-transkripter, kompromis kromosomale integritet under celledeling og efterfølgende resultere i udvikling af en række forskellige patologiske tilstande 13.
Tilpasning af cytogenetisk fremgangsmåde til analyse af CA'er som et endepunkt af epigenetiske ændringer forårsaget af PM, således er af stor betydning. Her rapporterer vi tilgangen til den omgivende PM indsamling og forberedelse, in vitro eksponering og analyse af CA'er hjælp af murine makrofag RAW264.7 model system. Makrofager omfatter den første linje i forsvar mod de inhalerede fremmedlegemer og dermed thans cellelinie tjener som en etableret og de hyppigst anvendte model i partikel toksikologi 11, 12, 14, 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Particle Indsamling og klargøring
- Kalibrering af den samlede høj lydstyrke suspenderede partikler sampler
- Afbryd sampler motor fra massestrømsstyreenheden og forbinde motoren til en stabil vekselstrømskilde (figur 1).
BEMÆRK: bruges ikke Et filter under denne procedure. - Monter kalibrator blænde og top loading adapterplade til sampler. Stram de øverste lastning adapter hold-down nødder sikkert til sikre, at ingen utætheder er til stede. Tillad sampler motor til at varme op til normal driftstemperatur (ca. 10-15 min).
- Foretag en tæthedsprøve ved at dække hullerne på toppen af hanen åbningen og pres på åbningen med hænderne. Lyt til en højfrekvent hvinende lyden fra undslippe luft. Hvis denne lyd høres, re-spænd top lastning adapter hold-down nødder som en lækage er til stede. Hvis lyden er lavere, lækagen er nær en af de andre pakninger i system.
- Slut den ene side af en vand manometer til trykket hanen på siden af åbningen med en gummi vakuumrør. Efterlad den modsatte side af manometeret åbent mod atmosfæren. Hold et manometer lodret for at sikre nøjagtige målinger. Trykker på bagsiden af den stadige strøm-optageren vil bidrage til at centrere pen og give nøjagtige aflæsninger.
- Gentag trin 1.1.2 ved anvendelse fem strømningshastigheder repræsenterer opererer strømningshastigheder fra 30 til 60 fod / min (ca. hver 5-6 ft3 / min). Indstil knappen på variabel åbning til fem forskellige positioner og tage fem forskellige aflæsninger.
- Registrer omgivende lufttemperatur, omgivende barometertryk, sampler serienummer, åbning serienummer, hældning blænde og skæringspunkt med dato sidste certificeret, dato, sted placering, og operatørens initialer på kalibreringen ark.
- Afbryd sampler motor fra massestrømsstyreenheden og forbinde motoren til en stabil vekselstrømskilde (figur 1).
- Samlede samling suspenderede partikler prøve og gravimetrisk analyse
- Wrap en8 "x 10" kvarts fiber filter i to lag aluminiumsfolie. Placer indpakket filter i ovnen og temperaturen indstilles ved 550 ° C. Bag filtret i mindst 4 timer. Lad ovnen afkøles og hente filteret. Placer filteret i ekssikkator med CaCO3.
- Afvej filteret i en mikrovægt med en præcision på 10 ug. Gentag målingen tre gange i løbet af en dag. De enkelte målinger skal være inden for 25 ug. Hvis dette ikke opnås, returnere den indpakkede filteret til ekssikkator og gentage processen den følgende dag.
- Åbn ly låg (figur 2). Fjern filterholderen ramme ved at løsne de fire vingemøtrikker, så messing bolte og skiver til at svinge ned af vejen. Fold filteret fra aluminiumsfolie, og bruge rensede pincet til forsigtigt centrere det, grovere opad, på den understøttende skærmen. Korrekt justere filteret på skærmen.
- Placer rammen på skærmen, og fastgør det medmessing bolte og skiver, mens der gælder tilstrækkeligt tryk for at undgå luft lækage ved kanterne. Tør støv fra hele filterholderen med en ren klud. Luk husly låg omhyggeligt og sikre det.
- Sørg for at alle ledninger er tilsluttet deres passende beholder stikkontakter og slangen mellem blæsermotor pres hanen og kontinuerlig strøm optageren er tilsluttet.
- Forbered flow-optageren. Tryk pen arm lifter at hæve pen punkt og indsætte et nyt diagram. Juster på fanen af diagrammet til drevet hub optageren og tryk med tommelfingeren for at sænke diagram center på navet. Indstil tid ved at dreje drevnavet uret indtil den korrekte tid på diagrammet er på linje med tiden index pointer.
- Manuelt tænde for sampler og starte samlingen. Overvåg optageren for at være sikker på det er rentegning korrekt og den forløbne tid indikatoren til at være sikker på at den fungerer korrekt.
- Ved afslutningen af prøvetagningsperioden, slukke sampler, rekordden forløbne tid og hente diagrammet. Fjerne rammen at eksponere filteret. Fjern den udsatte filter fra den understøttende skærmen ved at holde det forsigtigt i enderne med tangen. Fold filteret på langs, så prøve rører prøve to gange og pak det i den oprindelige alufolie.
- Opbevar filteret i en ekssikkator med CaCO 3 i mindst 24 timer før vejning. Gentag trin 1.2.2 til vejning af filtrene efter prøveudtagningen. Placer filteret i en zip plastpose og gemme det i -80 ° C indtil analyse.
- Analyse af indsamlede total svævestøv prøve
- Hent den lagrede filter, folde aluminiumsfolie og overføre filteret på en ren teflon overflade. Ved hjælp af pincet og skalpel, skæres ydre (hvid) del af filteret og bortskaffes.
- Dernæst skæres filteret i 0,5 "x 0,5" stykker og placere stykker i en 100 ml kolbe. Tilsæt 50 ml ultrarent vand. Kolben anbringes i en ultralydbad og soniker i 60 minutter ved 33 ± 3 kHz.
- Filter ekstrakt gennem et 0,45 um polypropylen sprøjtefilter til en 100 ml rundbundet kolbe. Fordampe vandet under anvendelse af en rotationsinddamper instrument under tryk ved 50 ° C, indtil ca. 5 ml ekstrakt forbliver i kolben.
- Fordampe det resterende vand i et 15 ml pæreformet kolbe med kendt vægt. Kolben vejes med den tørre ekstrakt og registrere massen af den tørre ekstrakt.
- Den tørre prøve med 400 pi D2O opløses ved lydbehandling i 15 minutter og overføres til en 5 mm standard NMR-rør. Centrifuger i 5 minutter ved 12.000 xg ved stuetemperatur til fjernelse af eventuelt uopløst stof.
- Gentag med 300 pi D 2 O. Tilsæt 10 pi NaN3 1,4% (slutkoncentration .: 0,02% vægt / volumen) i NMR-rør. Tilsæt 10 pi (32 mg) af total svævestøv (TSP) -d4 (3,2 mg / ml) til D2O (slutkoncentration 0,258 mM) i NMR rør.
- Erhverve 1 H NMR-spektre ved anvendelse af et NMR-spektrometer, der arbejder ved 600,17 MHz.
- Indsæt NMR-rør ind i tredobbelt resonans cryoproben. Kalibrer instrumentet i følgende rækkefølge: lås, tune, shim, 90 ° puls længde kalibrering og modtager gain justering.
- Måle spektre ved 25 ° C med en 1 D excitation sculpting sekvens under anvendelse 180 vand-selektive impulser i Digitale Quad detekteringstilstand, 8.192 scanninger, 4 dummy scanninger, sweep bredde på 8012,57 Hz, frekvensforskydning for vand signalhæmning fastsat til 4,70 ppm, 1,70 sek erhvervelse tid, 32,768 tidsdomænet datapunkter (TD), 1 ms varighed gradient (P16), 100 mikrosekunder opsving forsinkelse efter gradient (d16).
- Proces 1H NMR-spektre ved at anvende en linjeudvidelse på 1 Hz og nul fyldning med en faktor 2 (65.536 datapunkter). Ret fasen og baseline manuelt og integrere. Set TSP-d4 toppen ved 0,0 ppm.
- Hent den lagrede filter, folde aluminiumsfolie og overføre filteret på en ren teflon overflade. Ved hjælp af pincet og skalpel, skæres ydre (hvid) del af filteret og bortskaffes.
2. Partikel Eksponering
- Kultur oprettet
- Varm komplette vækstmedier indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) og penicillin-streptomycin-opløsning (100 U / ml), 0,25% trypsin-opløsning og calcium magnesium free phosphatbuffer saltvand (PBS) i et vandbad (ved 37 ° C) i mindst 30 minutter før kultur indvielse.
- Tag en T75 kolbe fra 5% CO2 inkubator indeholdende dyrkede RAW264.7-celler og vask af cellerne med 2 ml forvarmet PBS to gange.
- Løsne adhærente RAW264.7-celler fra bunden af karret vævskultur anvendelse af 1 ml forvarmet trypsin opløsning efterfulgt af skrabning.
- Opsamle cellerne fra vævskultur fartøj og gøre en enkelt cellesuspension ved gentagen pipettering. Tæl antallet af celler med trypanblåt og plade med en tæthed på 8.000 / cm 2 (500.000 celler total) i en 100 mm vævskulturskål med forvarmet fuldstændige medier. Juster medier volumen til 10 ml i en slutkoncentration på 50.000 cellerper ml.
BEMÆRK: fordoble antallet af plader, hvis DNA-methylering analyse også udføres. - Placer de nyligt udpladede RAW264.7 celler tilbage i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C og tillade at vedhæfte i 24 timer.
- Også i et biosikkerhed skab, resuspender filtrerede partikler. For eksempel fortyndes partikler ved en koncentration på 0,5 mg / ml i sterilt PBS i en 5 ug / ml dosis behandling og ved 5 mg / ml til en 50 ug / ml dosis behandling. Fortyndinger kan fremstilles op til måned i forvejen og opbevares ved -80 ° C.
- Behandling med partikler
- Tag cellerne fra 5% CO2 inkubator og kontrollere under 10x forstørrelse under anvendelse af et omvendt mikroskop for cellevækst, cellemorfologi, dyrkningsbetingelser og kontamination. Man bør forvente at have mindst 30% konfluerende celler på dette stadium.
- Aseptisk, aspireres mediet ved hjælp steriliseret pipette og vaske kultur fartøj med 2 ml 37 ° C PBSto gange for helt at fjerne medierne og flydende eller døde celler.
- Tilføj forudbestemt dosis af partikler med frisk medium i dyrkningsbeholdere og inkuberes i ønskede tidsrum ved 37 ° C i 5% CO2-inkubator. I denne undersøgelse behandle RAW264.7-celler med PM i 72 timer til parallelle eksponeringen for samtidig genotoksisk og epigenotoxic analyse.
BEMÆRK: Cytotoksicitet kan have en negativ indflydelse på kvaliteten af det cytogenetiske analyser. Derfor er yderligere assays, såsom cytotoksicitet, DNA-methylering, Western blotting, eller genekspression analyse udføres typisk på behandlede celler. Expose celler som beskrevet og fortsætte med specifik analyse ønskes. Uerfarne brugere kan også vælge at inkludere en positiv kontrol såsom methyl methansulfonat til at teste deres evne til at opdage CA'er.
3. Cytogenetisk Assay
- Behandling til at anholde celler på metafase
- Varm colcemid sålution (10 ug / ml) i et 37 ° C vandbad i 30 min. Tør låget med 70% alkohol under en biosikkerhed kabinet for at minimere risikoen for forurening
- Helt fjerne medierne aseptisk og vaske dyrkningsbeholdere med 2 ml forvarmet PBS to gange.
- Tilføj forvarmet frisk medium (2 ml medium / 10 6 celler) indeholdende colcemid opløsning (5 ul / ml) i dyrkningsbeholderen og inkuberes i 2 timer.
- Cell høst
- Varm trypsinopløsning og PBS i et vandbad holdt ved 37 ° C i 30 min. Fra dette trin fremefter, er der ikke behov for at opretholde aseptiske betingelser.
- Helt at fjerne mediet, vask dyrkningsbeholderne med 2 ml 37 ° C PBS i to gange, tilføje nødvendige mængde forvarmet trypsin-opløsning (sædvanligvis 2 ml for 60 mm dyrkningsskål eller T25 kolbe og 4 ml til 100 mm skål eller T75 kolbe ), og placer dyrkningsbeholderen igen 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 1 min.
- Take ud dyrkningsbeholderen, frigøre cellerne under anvendelse af en skraber, og der tilsættes 10 ml PBS for at stoppe trypsin handling.
- Pipette op og ned mindst ti gange for at gøre enkelt celle suspension og overføre celler i en 15 ml konisk bund centrifugerør.
- Centrifuge cellesuspension ved 400 xg i 5 minutter i en gynge ud centrifuge ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten, bryde cellepelleten ved en let banken, tilsættes 10 ml PBS, og igen centrifugeres i fem minutter.
- Hypotonisk behandling og fiksering
- Pre-varm 0,075 M kaliumchloridopløsning i et 37 ° C vandbad i det mindste i 30 minutter.
- Fjern supernatanten uden at forstyrre cellepelleten og efterlade ca. 0,5 ml PBS.
- Forsigtigt bryde cellepelleten og gøre enkelt cellesuspension under anvendelse af en P200 pipette.
- Tilsæt 4 ml forvarmet kaliumchloridopløsning dråbevis med forsigtig rystning.
- Inkubér cellerne i hypotonisk potassium chloridopløsning i et 37 ° C vandbad i 20 min.
- Foretag frisk acetomethanol ved tilsætning 3-dele methanol med 1-del iseddike. Hold dette frisklavet fiksativ ved stuetemperatur.
- Efter hypotonisk behandling, der tilsættes samme mængde (4 ml) af fiksativ i røret og forsigtigt blande opløsningen ved at vende røret.
- Centrifuger ved 400 x g i 5 min ved stuetemperatur, og supernatanten fjernes. På dette stadium celle pellet størrelse stiger, bliver hvidlig og mere synlig.
- Fjern supernatanten, tilsættes 4 ml frisk fiksativ og holde ved stuetemperatur i 30 min.
- Centrifuger ved 400 xg i 5 min, fjern supernatant, og give yderligere to vaske med 4 ml fiksativ.
- Slide rengøring og metafase spread forberedelse
- Fordybe objektglas fuldstændigt i 10% flydende detergent i 30 min.
- Glassene skylles grundigt i koldt rindende postevand i 30 min.
- Rinse slides tre gange med destilleret vand til helt at fjerne vaskemiddel, fordybe i destilleret vand, og opbevar i køleskabet til senere brug.
BEMÆRK: Rengøring slides før brug letter ensartethed for spredning og øger metafase kvalitet. - Drop 10 pi cellesuspension på kølet våde objektglas og lad det lufttørre natten over ved stuetemperatur.
- Farvning og montering
- Forbered 50 ml Giemsa farveopløsning ved at blande en del af Giemsa farve opløsningen med en del af PBS og hæld i en Coplin-skål.
- Fordyb dias i farveopløsning i 20 min.
- Skyl dias i destilleret vand for at fjerne overskydende pletten og straks tørre dias ved hjælp af en hårtørrer.
- Lad dias ved stuetemperatur natten over.
- Påfør en enkelt dråbe montering medium på dias, blidt placere et dækglas på montering medium, gøre det muligt for mediet til at sprede langsomt over slæden, og fjerndet overskydende medium med en køkkenrulle. Tillad den monterede dias til tørre i mindst 1 time forud for at flytte eller visning under et mikroskop for at undgå bevægelse af dækglasset.
Advarsel: Det er vigtigt at placere dækglasset forsigtigt uden at danne nogen bobler i dette trin. Anvendelsen af overdreven varme for at fjerne bobler kan ikke anbefales.
- Mikroskopisk observation og aberration typer
- Undersøg de strukturelle CA'er i metafase spreder ved 100X forstørrelse ved hjælp af en god kvalitet, lyse-felt mikroskop.
- Score mindst 50 til 100 metafasespredninger for hver behandlingsgruppe for behandlinger, der inducerer et stort antal CA'er. For mindre effektstørrelser er analysen af op til 300 metafasespredninger tilrådes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stor omhu bør tages i at vælge placeringen af TSP sampler, samt den tid af året, hvor kollektionen er udført. Den kemiske sammensætning samt størrelsen af partikler kan i det væsentlige påvirke resultatet. Det indsamlede materiale skal være synlig mod den hvide filter. En normal mus metafase spredning vil have 40 acentriske kromosomer. Målet med den teknik er at påvise en ændring (eller fravær deraf) i andelen af unormale kromosomer i behandlede celler i forhold til kontroller. Denne ændring kan derefter kvantificeres (antal unormale kromosomer) og kvalificeret (type abnormaliteter).
Normalt muse metafasespredning vil have 40 acentriske kromosomer (figur 3A). Behandling med partikler inducerer forskellige CA'er som vist i figur 3, såsom kromatid pause (3b), acentriske fragment (
Figur 1. Den store mængde total svævestøv (TSP) sampler. Billedet viser TSP sampler installeret i et tag i et byområde at indsamle omgivende partikler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Loaded kvarts fiber filter efter indsamlingen ved hjælp af den store mængde TSP sampler. Close-up på filteret installeret på TSP sampler, efter brug. Bemærk, at farven af filteret skiftede fra hvid til grå. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. mikrofotografi, der viser repræsentative eksempler på forskellige typer af strukturelle ændringer induceret i RAW264.7 celler efter behandling med forskellige koncentrationer af partikler. Aberrationerne er angivet med pile. (A) normal metafasespredning med 40 acrocentriske kromosomer, (B) kromatidtypen pause (CTB), (C) acentriske fragment (acentrics), (D) ring kromosom, (E) dicentric kromosom (DIC), (F) dobbelt min (Dimn), (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytogenetisk undersøgelse eller mikroskopisk analyse af tal eller strukturer af kromosomer, primært i metafase spreads, giver oplysninger afgørende for prognose, risikovurdering, og behandling af forskellige sygdomme. Det er nu veletableret, at cytogenetiske abnormaliteter er forbundet med progression og udviklingen af flere sygdomme, herunder cancer. Til dato har CA'er blevet fundet i alle større tumortyper. CA'er kan opstå spontant eller ved enten eksterne eller interne stimuli, såsom ioniserende stråling (IR) - en af de vigtigste risikofaktorer eksterne, der kan fremkalde forskellige former for cytogenetisk ændringer 16. Analyse af CA'er hjælpemidler i vurderingen af den absorberede strålingsdosis (kaldet cytogenetisk stråling biodosimetry). Desuden analyse af hyppigheden og typen af specifik aberration indeholder også oplysninger vigtig for bestemmelse af kvaliteten af strålingen blive absorberet 17, 18. Cytogenetisk undersøgelse giver et direkte billede af iIRKNING af skadelige stoffer på DNA. Dette er i modsætning til indirekte teknikker såsom comet assay. Imidlertid har cytogenetisk undersøgelse blevet underudnyttet på områder uden for stråling, dels på grund af de mange hands-on trin involveret.
Selv udsættelse for organisk kulstof til stede i PM er kendt for at påvirke vores helbred, få studier rapporterer biologiske virkninger omfatter deres sammensætning 9. Dette skyldes de dyre og besværlige chromatografiske metoder, der kræver arbejdskrævende ekstraktion, forarbejdning, koncentrationer og derivatisering protokoller, idet de kun give indsigt for en lille delmængde af en meget specifik type af forbindelser hver gang. Endvidere protokollerne resultere i væsentlig manipulering eller ødelæggelse af den oprindelige prøve således yderligere afprøvning kan ikke udføres. Fordele ved kernemagnetisk resonans (NMR) analyse omfatter, at NMR er en ikke-destruktiv metode; det kræver en meget begrænset antal steps (udvinding, koncentration) forud for analyse, og højfrekvente NMR-instrumenter (fra 400 MHz til 900 MHz) er tilgængelige i mange, hvis ikke alle, universiteter inden kernen facilitet. En omfattende gennemgang af atmosfærisk aerosol NMR studier er for nylig blevet offentliggjort 19. Endelig på grund af dens evne til at tilvejebringe strukturel information og bindinger mellem grupper, NMR er overlegen i forhold til andre spektrometriske metoder såsom FT-IR, UV-Vis, og Raman-spektrometri, som kun leverer data af typen af funktionelle grupper. Hvis det er nødvendigt, kan morfologisk karakterisering af PM udføres i tillæg til NMR-spektrometri med anvendelse af scanningselektronmikroskopi.
Selv fra et enkelt sted, indsamlet sammensætningen af PM kan variere afhængigt af tidspunktet på året. En stor nok mængde af materiale skal behandles og opbevares ved -80 ° C for gentagne eksperimenter eller komplementære assays. Trin 2.1.1 gennem 3.1.3 skal udføres aseptisk i en biosikkerhed kabinet. Hvis der observeres forurening eller kompromitteret cellulær morfologi, ikke fortsætte med resten af protokollen. Den trypsinbehandling tid skal justeres baseret på celletype. Her, makrofager er meget klæbende og vi har fundet, at en kombination af 1 min trypsin og skrabning fungerer bedst, men trypsin alene i 5 minutter virker for de fleste celletyper. Hypotonisk behandling varierer også afhængigt af celletype og skal standardiseres. Dosis og behandlingstid på colcemid er de vigtigste parametre for kromosom forberedelse; en over-dosis kan dræbe cellerne eller stall cellecyklussen. Vi beskriver her betingelser for RAW264.7-celler, og optimering er påkrævet for andre celletyper. Manglende finde ideelle betingelser i dette trin kan påvirke Mitoseindeks samt kromosom morfologi, der påvirker resultaterne. Det anbefales også at vurdere niveauet af cytotoksicitet af PM før cytogenetisk analyse og vælg doserne i overensstemmelse hermed.
in vitro toksikologiske vurderinger er begrænset af typen af anvendte celler, eksponering størrelsesorden og partikelkoncentrationer. Endvidere i denne undersøgelse, vi udnyttet den vandopløselige ekstrakt af PM, og derfor kan der ikke redegøres potentiale vanduopløselige arter til at forårsage cytogenetiske aberrationer. Andre begrænsninger er forbundet med tilstedeværelsen af "polymorfe varianter" - variationer i centromerregionen regioner og korte arme af kromosom; nogle submikroskopisk eller kryptiske omlejringer, der kan misfortolkes og tilstedeværelsen af komplekse karyotyper.
Her viser vi, at indførelsen af cytogenetisk analyse kan støtte i identifikationen af PM-induceret skade på DNA og kan potentielt tjene som en prædiktiv endepunkt i vurdering af de sundhedsmæssige virkninger af udsættelse for omgivende PM. Vores undersøgelse er, så vidt vi ved, den første til at indikere CA'er som reaktion på PM. Replikation af disse resultater er,ønskeligt at bekræfte vores resultater. Denne protokol kan også tilpasses til at vurdere næsten enhver type formodet DNA-ødelæggende middel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet delvist af National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [tilskud nummer 1P20GM109005], Arkansas Space Grant Consortium gennem National Aeronautics and Space Administration [tilskud nummer NNX15AK32A], og det nationale institut for Occupational Safety and Sundhed (NIOSH) [tilskud nummer 2T420H008436]. Forfatterne vil gerne takke Christopher Fettes for korrekturlæsning og redigering dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , Springer. 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
