Summary
Dit protocol beschrijft technieken voor de kwantificatie en karakterisatie van chromosomale afwijkingen in vitro in RAW264.7 muis macrofagen na behandeling met de lucht zwevende deeltjes.
Abstract
Blootstelling aan fijn stof (PM) is een grote wereld gezondheids-zorg, waarin verschillende cellulaire componenten, met inbegrip van de nucleaire genetisch materiaal kunnen beschadigen. Om de impact van PM op de nucleaire genetische integriteit te beoordelen, zijn structurele chromosoomafwijkingen scoorde in de metafase spreads van de muis RAW264.7 macrofaag-cellen. PM wordt verzameld uit de lucht met een hoog volume totaal zwevende deeltjes sampler. Het verzamelde materiaal wordt opgelost en gefiltreerd om het in water oplosbare, fijn gedeelte behouden. De deeltjes worden gekenmerkt chemische samenstelling door middel van kernspinresonantie (NMR) spectroscopie. Verschillende concentraties deeltjessuspensie wordt toegevoegd aan een in vitro kweek van RAW264.7 muizenmacrofagen een totale blootstellingsduur van 72 uur, samen met onbehandelde controlecellen. Aan het einde van de blootstelling, is de cultuur behandeld met colcemide om cellen te arresteren in metafase. De cellen worden daarna geoogst, behandeld met een hypotone oplossing, in acetomethanol vaste, dropped op glasplaatjes en tenslotte gekleurd met Giemsa oplossing. Dia's worden onderzocht om de structurele chromosoomafwijkingen (CA's) in metafase spreads op 1000x met behulp van een bright-field microscoop te beoordelen. 50-100 metafase spread worden gescoord voor elke behandeling groep. Deze techniek is aangepast voor het vaststellen van structurele chromosoomafwijkingen (CA), zoals chromatidetype breaks, chromatidetype uitwisseling, acentrische fragmenten dicentrische en ring chromosomen, dubbele minuten endoreduplicatie en Robertsonian translocaties in vitro na blootstelling aan PM. Het is een krachtige methode om een gevestigde cytogenetische eindpunt epigenetische veranderingen associëren.
Introduction
Er wordt geschat dat blootstelling aan fijn stof (PM) zorgt ervoor dat meer dan 3 miljoen extra doden per jaar, vooral uit hart- en vaatziekten en longkanker 1. Inderdaad, PM werd erkend als kankerverwekkend voor de mens door het Internationaal Agentschap voor Kankeronderzoek (groep 1), zoals een verhoogd risico op longkanker met toenemende niveaus van blootstelling aan PM is aangetoond 2. Interessant bijna alle kankercellen haven numerieke en / of structurele chromosomale abnormaliteiten. Particulate organische koolstof is een variant, complex en heterogeen mengsel, waarvan de samenstelling en de grootte verdeling is afhankelijk van de emissie evenals fysieke en chemische transformaties. Zij vertegenwoordigt 35-55% van de stedelijke PM 2,5 massa (PM 2,5 micrometer in grootte en kleiner) en meer dan 60% van de landelijke en continentale achtergrond PM 2,5 massa 3, 4. Het water oplosbare fractie is goed voor 30-90% van de organische aerosol. Een groot aantal organische verbindingenzijn geïdentificeerd, waaronder alifatische koolwaterstoffen, polycyclische aromatische koolwaterstoffen en de geoxygeneerde en genitreerde derivaten, alifatische aldehyden en alcoholen, vrije vetzuren en zouten daarvan, di-carbonzuren, multifunctionele verbindingen, eiwitten en humus-achtige macromoleculen (HULIS) middels chromatografische methoden gekoppeld aan massaspectrometrische technieken 5-8. Deze verbindingen vertegenwoordigen minder dan 10-20% van de deeltjes organische koolstof, waardoor het grootste deel van organische koolstof is niet bekend 9.
Experimenteel bewijs suggereert dat cytotoxiciteit, oxidatieve stress en ontstekingen zijn betrokken bij de ontwikkeling van PM-geassocieerde pathologische toestanden. Onlangs is echter aangetoond dat blootstelling aan PM resulteert ook in een aantal epigenetische veranderingen, zoals veranderingen in DNA methylering van repetitieve elementen, in zowel experimentele in vitro systemen en bij de mens 10-12. Van bijzonder belang zijn de effecten vanPM op satelliet DNA - grote en kleine satellieten - die worden aangetroffen in de heterochromatische regio rond het centromeer van chromosomen. Er werd aangetoond dat deze effecten persistent van aard kunnen zijn, als ze kunnen worden gedetecteerd gedurende ten minste 72 uur na blootstelling 12. Veranderingen in DNA-methylering, met name rond centromeren, kan leiden tot ophoping van satelliet DNA mRNA transcripten, chromosomale integriteit compromis tijdens de celdeling en vervolgens leiden tot de ontwikkeling van een verscheidenheid aan pathologische toestanden 13.
Aanpassing van cytogenetische benadering voor de analyse van CA als eindpunt van epigenetische veranderingen veroorzaakt door PM dus van groot belang. Hier melden wij de aanpak voor de ambient PM collectie en de voorbereiding, in vitro blootstelling en analyse van CA's met behulp van de muizen macrofaag RAW264.7 modelsysteem. Macrofagen bestaat uit de eerste lijn van verdediging tegen de ingeademde vreemde voorwerpen en dus tZijn cellijn dient als een gevestigde en de meest gebruikte model in deeltje toxicologie 11, 12, 14, 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Particle Collection en Voorbereiding
- Kalibratie van het hoge volume totaal zwevende deeltjes sampler
- Koppel de sampler motor van de massastroom controller en de motor op een stabiele stopcontact (figuur 1).
OPMERKING: Een filter wordt niet gebruikt tijdens deze procedure. - Monteer de calibrator opening en bovenlader adapter plaat om de sampler. Draai de bovenlader adapter hold-down bouten vast om ervoor te zorgen dat er geen luchtlekken aanwezig zijn. Laat de sampler motor om op te warmen tot de normale bedrijfstemperatuur (ongeveer 10-15 minuten).
- Voer een lektest door het bedekken van de gaten op de top van de opening en de druk tik op de opening met de handen. Luister naar een hoge toon piepende geluid van ontsnappende lucht. Als dit geluid hoort, draai de bovenlader adapter hold-down noten als een lek aanwezig is. Als het geluid lager, het lek bij een van de andere pakkingen van de system.
- Sluit de ene kant van een water manometer om de druk kraan aan de zijkant van de opening met een rubberen vacuümbuis. Laat de tegenoverliggende zijde van de manometer open naar de atmosfeer. Houd een manometer verticaal om ervoor te zorgen nauwkeurige metingen. Door op de achterzijde van de continue stroom recorder zal helpen om de pen te centreren en zorgen voor nauwkeurige metingen.
- Herhaal stap 1.1.2 gebruikmaking van vijf stroomsnelheden die werkzaam stroomsnelheden van 30 tot 60 ft / min (ongeveer elke 5-6 ft3 / min). Stel de knop op de variabele opening vijf verschillende posities innemen en vijf metingen.
- Noteer de omgevingstemperatuur, ambient luchtdruk, sampler serienummer, opening serienummer, opening helling en snijpunt met datum laatste gecertificeerd, de datum, plaats locatie en initialen exploitant over de kalibratie vel.
- Koppel de sampler motor van de massastroom controller en de motor op een stabiele stopcontact (figuur 1).
- Totaal zwevende deeltjes monstername en gravimetrie
- wikkel een8 "x 10" kwartsvezelfilter filter in twee lagen aluminiumfolie. Plaats de ingepakte filter in de oven en de temperatuur op 550 ° C. Bak het filter gedurende tenminste 4 uur. Laat de oven afkoelen en ophalen van de filter. Plaats het filter in de exsiccator met CaCO 3.
- Weeg het filter in een microbalans met een nauwkeurigheid van 10 ug. Herhaal de meting drie keer gedurende een dag. Individuele metingen, moeten binnen 25 ug. Als dit niet wordt bereikt, de terugkeer van de gewikkeld filter in de exsiccator en herhaal het proces de volgende dag.
- Open het asiel deksel (figuur 2). Verwijder filterhouder kader door het losdraaien van de vier vleugelmoeren, waardoor de koperen bouten en ringen om af te zwaaien uit de weg. Ontvouwen het filter van de aluminiumfolie en gebruik gereinigd tang zorgvuldig centreren, ruwere omhoog, zo op het scherm. Goed uitlijnen van de filter op het scherm.
- Plaats het frame op het scherm en zet hem vast metde koperen bouten en rondsels terwijl het toepassen van voldoende druk om luchtlekkage aan de randen te voorkomen. Veeg stof ophoping van rond de filterhouder met een schone doek. Sluiten onderdak deksel zorgvuldig en zet hem vast.
- Zorg ervoor dat alle kabels zijn aangesloten op hun juiste bakje sockets en de slang tussen de blower motor druk van de tap en de continue stroom recorder is aangesloten.
- Bereid de stroom recorder. Druk pen arm lifter pen punt te verhogen en plaats een nieuwe kaart. Lijn het lipje van de grafiek om de aandrijfnaaf van de recorder en druk met de duim in kaart te brengen centrum verlagen op hub. Tijd instellen door het draaien van de aandrijfnaaf klok mee totdat de juiste tijd op grafiek in lijn is met de tijd index pointer.
- Handmatig te schakelen op de sampler en start de collectie. Bewaken van de recorder om zeker te zijn is juist inkten en de verstreken tijd indicator om te zorgen dat het goed werkt.
- Aan het einde van de bemonsteringsperiode, schakelt u de sampler, opnemende verstreken tijd en ophalen van de grafiek. Het frame om het filter bloot. Verwijder de belichte filter van het ondersteunende scherm door te oordelen voorzichtig aan de uiteinden van de tang. Vouw het filter in de lengte, zodat het monster raakt monster tweemaal en wikkel het in de oorspronkelijke aluminiumfolie.
- Bewaar het filter in een exsiccator met CaCO 3 ten minste 24 uur voorafgaand aan het wegen. Herhaal stap 1.2.2 om het gewicht van de filters te meten na de bemonstering. Plaats het filter in een zip plastic zak en bewaar het op -80 ° C tot analyse.
- Analyse van de verzamelde totaal zwevende deeltjes steekproef
- Haal de opgeslagen filter, vouw de aluminiumfolie en de overdracht van het filter op een schoon Teflon oppervlak. Met behulp van een tang en scalpel, snijd buitenste (wit) een deel van de filter en gooi.
- Daarna, snijd het filter in 0,5 "x 0,5" stukjes en doe stukken in een kolf van 100 ml. Voeg 50 ml ultrapuur water. Plaats de kolf in een echografiebad en ultrasone trillingen gedurende 60 min bij 33 ± 3 kHz.
- Filter extract door een 0,45 urn spuitfilter polypropyleen een 100 ml rondbodemkolf. Damp het water met behulp van een rotatieverdamper instrument onder druk bij 50 ° C tot ongeveer 5 ml extract blijft in de kolf.
- Damp het resterende water in een 15 ml peervormige kolf van bekend gewicht. Weeg de kolf met de droge extract en de massa van de droge stof op te nemen.
- Los het droge monster met 400 ul van D 2 O door sonicatie gedurende 15 min en de overdracht in een 5 mm standaard NMR-buis. Centrifugeer 5 min bij 12.000 xg bij kamertemperatuur om eventuele onopgeloste materiaal te verwijderen.
- Herhaal met 300 ui D 2 O. Voeg 10 ul van 1,4% NaN3 (eindconcentratie .: 0,02% w / v) in de NMR-buis. Voeg 10 ul (32 ug) totaal zwevende deeltjes (TSP) D4 (3,2 mg / ml) tot D 2 O (eindconcentratie 0,258 mM) in de NMR-buis.
- Verwerven 1 H NMR spectra met een NMR spectrometer die werkt bij 600,17 MHz.
- Steek NMR buis in de triple resonantie cryoprobe. Kalibreren van het instrument in de volgende volgorde: slot, tune, shim, 90 ° pulslengte kalibratie en ontvanger gain aanpassing.
- Meet spectra bij 25 ° C met een 1 D excitatie beeldhouwen sequentie met behulp van 180-water selectieve pulsen in Digital Quad detectie-modus, 8192 scans, 4 dummy scans, sweep breedte van 8012,57 Hz, frequentie offset voor water signaal onderdrukking vastgesteld op 4,70 ppm, 1,70 sec acquisitie tijd, 32768 keer domein datapunten (TD), 1 msec duur gradiënt (p16), 100 psec herstel vertraging na verloop (d16).
- Werkwijze 1 H NMR spectra door een lijnverbreding van 1 Hz en nul vullen met een factor 2 (65.536 gegevenspunten). Corrigeer de fase en de basislijn handmatig en te integreren. Stel TSP-d4 piek bij 0,0 ppm.
- Haal de opgeslagen filter, vouw de aluminiumfolie en de overdracht van het filter op een schoon Teflon oppervlak. Met behulp van een tang en scalpel, snijd buitenste (wit) een deel van de filter en gooi.
2. Particle Exposure
- Cultuur opgericht
- Warm volledige groei medium dat 10% foetaal runderserum (FBS) en penicilline-streptomycine-oplossing (100 E / ml), 0,25% trypsine-oplossing en calcium magnesium vrije fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) in een waterbad (bij 37 ° C) ten minste 30 minuten voor cultuurinitiatie.
- Neem een T75 kolf van 5% CO2 incubator bevattende gekweekte RAW264.7 cellen en was de cellen met 2 ml voorverwarmde PBS twee keer.
- Los hechtende RAW264.7 cellen van de bodem van weefselkweekvat gebruik 1 ml voorverwarmde trypsine-oplossing gevolgd door schrapen.
- Verzamel de cellen uit weefselkweek vat en een enkele celsuspensie door herhaald pipetteren. Tel het aantal cellen met trypan blauw en plaat bij een dichtheid van 8000 / cm2 (500.000 cellen totaal) in een 100 mm weefselkweekplaat met voorverwarmd compleet medium. Pas media volume op 10 ml voor een uiteindelijke concentratie van 50.000 cellenper ml.
LET OP: Verdubbel het aantal platen als DNA-methylatie analyse ook wordt uitgevoerd. - Plaats de nieuw uitgeplaat RAW264.7 cellen opnieuw in 5% CO2 incubator bij 37 ° C en laat hechten 24 uur.
- Ook in een bioveiligheid kast, mengen gefilterd deeltjes. Bijvoorbeeld verdund deeltjes in een concentratie van 0,5 mg / ml in steriel PBS voor een / dosering 5 ug ml behandeling en 5 mg / ml voor een / dosering 50 ug ml behandeling. Verdunningen kunnen worden bereid maand van tevoren en opgeslagen bij -80 ° C.
- Behandeling met deeltjes
- Haal de cellen van 5% CO 2 incubator en laat onder 10x vergroting met behulp van een omgekeerde microscoop voor celgroei, celmorfologie, cultuur staat, en vervuiling. Men zou verwachten dat ten minste 30% confluente cellen in dit stadium.
- Aseptisch, zuigen de media met behulp van gesteriliseerde pipet en was de cultuur schip met 2 ml 37 ° C PBStwee keer aan de media en drijvende of dode cellen volledig te verwijderen.
- Add vooraf bepaalde dosis deeltjes met vers medium in kweekvaten en incubeer gewenste tijd bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. In deze studie behandelen RAW264.7 cellen met PM voor 72 uur om de belichting gebruikt voor gelijktijdige genotoxische en epigenotoxic analyse parallel.
OPMERKING: Cytotoxiciteit kan een negatieve invloed op de kwaliteit van de cytogenetische analyse. Derhalve zijn bijkomende testen zoals cytotoxiciteit, DNA methylatie, Western blotting, of genexpressie typisch uitgevoerd op behandelde cellen. Expose cellen zoals beschreven en ga verder met de specifieke test gewenst. Onervaren gebruikers kunt ook een positieve controle, zoals methyl methaansulfonaat om hun vermogen om CA's te detecteren testen omvatten.
3. cytogenetische test
- Behandeling om cellen in metafase te arresteren
- Verwarm de colcemide zolutie (10 ug / ml) in een 37 ° C waterbad gedurende 30 minuten. Veeg het deksel met 70% alcohol onder toepassing van een bio kast om het risico op verontreiniging te minimaliseren
- Volledig verwijderen van de media aseptisch en was de kweekvaten met 2 ml voorverwarmd PBS twee keer.
- Add voorverwarmd vers medium (2 ml medium / 10 6 cellen) die colcemide oplossing (5 ul / ml) in het kweekvat en incubeer gedurende 2 uur.
- celoogst
- Warme trypsine oplossing en PBS in een waterbad gehandhaafd op 37 ° C gedurende 30 minuten. Vanaf deze stap geldt er geen noodzaak om aseptische toestand te handhaven.
- Volledig verwijderen media, was de kweekvaten met 2 ml 37 ° C PBS twee keer, voeg vereiste volume van voorverwarmde trypsine-oplossing (meestal 2 ml van 60 mm kweekschaal of T25 kolf en 4 ml van 100 mm schaal of T75 kolf ) en plaats het kweekvat opnieuw in 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 1 min.
- Take uit het kweekvat, los van de cellen met behulp van een schraper, en voeg 10 ml van PBS om trypsine actie stop te zetten.
- Pipet op en neer ten minste tienmaal enkelvoudige celsuspensie en overdracht cellen te maken in een 15 ml conische bodem centrifugebuis.
- Centrifugeer celsuspensie bij 400 g gedurende 5 min in een schommeling uit centrifuge bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant, breken de celpellet door voorzichtig tikken, voeg 10 ml PBS, en opnieuw gecentrifugeerd gedurende vijf minuten.
- Hypotone behandeling en fixatie
- Voorverwarmen 0,075 M kaliumchloride in een 37 ° C waterbad gedurende tenminste 30 minuten.
- Verwijder supernatant zonder verstoring van de cel pellet en laat ongeveer 0,5 ml PBS.
- Zachtjes breken de cel pellet en maak enkele celsuspensie met behulp van een P200 pipet.
- Voeg 4 ml voorverwarmd kaliumchloride druppelsgewijs onder zacht schudden.
- Incubeer de cellen in hypotone potassium-oplossing in een 37 ° C waterbad gedurende 20 min.
- Voeg vers acetomethanol door toevoeging van 3-delen methanol 1-deel ijsazijn. Houd dit vers bereide fixatief bij kamertemperatuur.
- Na hypotone behandeling, een gelijk volume (4 ml) van fixeermiddel in de buis en voorzichtig de oplossing te mengen door het buisje.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en de bovenstaande vloeistof. In dit stadium celpellet omvang toeneemt, worden witachtig en meer zichtbaar.
- Verwijder supernatant, voeg 4 ml vers fixeermiddel en laten kamertemperatuur gedurende 30 min.
- Centrifugeer bij 400 xg gedurende 5 minuten, verwijder supernatant, en geven twee wassen met 4 ml fixeermiddel.
- Slide reiniging en metafase spread voorbereiding
- Dompel glasplaatjes volledig in 10% vloeibaar wasmiddel voor 30 min.
- Spoel de dia's grondig in koud stromend leidingwater gedurende 30 minuten.
- rinse schuift drie keer met gedestilleerd water om schoonmaakmiddel volledig te verwijderen, onder te dompelen in gedestilleerd water en in de koelkast bewaren voor toekomstig gebruik.
LET OP: Het schoonmaken van dia's voor het gebruik vergemakkelijkt de gelijkmatigheid van de verspreiding en verhoogt metafase kwaliteit. - Drop 10 pi celsuspensie op gekoelde natte glijbaan en laat ze drogen 's nachts bij kamertemperatuur lucht.
- Vlekken en montage
- Bereid 50 ml Giemsa kleuring oplossing door het mengen van een deel van Giemsa oplossing vlek met een deel van de PBS en giet in een Coplin pot.
- Dompel de objectglaasjes in kleuroplossing gedurende 20 min.
- Spoel de dia's in gedestilleerd water om het overtollige vlek te verwijderen en onmiddellijk droog de dia's met behulp van een föhn.
- Laat de dia's bij kamertemperatuur gedurende de nacht.
- Breng een druppel montage medium op de dia voorzichtig plaats een dekglaasje op de montage medium, laat het medium te verspreiden over de dia langzaam en verwijderhet overtollige medium met een papieren handdoek. Laat de gemonteerde slede drogen gedurende ten minste 1 uur vóór het verplaatsen of het bekijken onder een microscoop om beweging van het dekglaasje voorkomen.
Voorzichtig: Het is belangrijk om het dekglaasje voorzichtig plaatsen zonder vormende luchtbelletjes tijdens deze stap. Het gebruik van overmatige warmte om bellen te verwijderen wordt niet aanbevolen.
- Microscopische observatie en aberratie types
- Onderzoek de structurele CAs in metafase spreads bij 100X vergroting met behulp van een goede kwaliteit bright-field microscoop.
- Score ten minste 50 tot 100 metafase spreads elke behandelingsgroep voor behandelingen die een groot aantal CA's induceren. Voor kleinere effect maten, is de analyse van maximaal 300 metafase spreads geadviseerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Grote zorg moet worden genomen bij het kiezen van de plaats van de TSP sampler, en de tijd van het jaar waarin collectie wordt uitgevoerd. De chemische samenstelling en de grootte van de deeltjes kan in hoofdzaak de resultaten beïnvloeden. Het verzamelde materiaal moet zichtbaar tegen de witte filter. Een normale muis metafase spread zal moeten 40 acentrisch chromosomen. Het doel van deze techniek is om een verandering (of afwezigheid daarvan) in de verhouding van abnormale chromosomen in behandelde cellen versus controles aan te tonen. Die verandering kan dan worden gekwantificeerd (aantal abnormale chromosomen) en gekwalificeerde (type van afwijkingen).
Normale muis metafase spread zal moeten 40 acentrisch chromosomen (figuur 3A). Behandeling met vaste deeltjes induceert diverse CA zoals getoond in figuur 3, zoals chromatide rusten (3B), acentrisch fragment (
Figuur 1. De hoge volume totaal zwevende deeltjes (TSP) sampler. De afbeelding toont de TSP sampler in een dak geïnstalleerd in een stedelijk gebied aan het omgevingslicht deeltjes te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Geladen kwartsvezelfilter filter na de winning met behulp van de hoge volume TSP sampler. Close-up van het filter aan de TSP sampler geïnstalleerd na gebruik. Merk op dat de kleur van het filter veranderd van wit naar grijs. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Microfoto toont representatieve voorbeelden van verschillende soorten structurele afwijkingen geïnduceerd in RAW264.7 cellen na behandeling met verschillende concentraties van fijn stof. De aberraties zijn aangegeven met pijlen. (A) normale metafase spread met 40 acrocentric chromosomen, (B) chromatide-type break (CTB), (C) acentrisch fragment (acentrics), (D) ring chromosoom, (E) dicentrische chromosoom (DIC), (F) double min (Dimn), (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytogenetische studie of microscopische analyse van de nummers of structuren van chromosomen, vooral in metafase spreads, geeft informatie van cruciaal belang voor de prognose, risicobeoordeling, en de behandeling van diverse ziekten. Het is nu goed vastgesteld dat cytogenetische afwijkingen verbonden met de voortgang en ontwikkeling van verschillende ziekten, waaronder kanker. Tot op heden zijn CA gevonden in alle belangrijke tumortypen. Een van de belangrijkste externe risicofactoren die verschillende soorten cytogenetische veranderingen 16 kunnen induceren - CA kan spontaan of door een externe of interne stimuli, zoals ioniserende straling (IR) ontstaan. Analyse van de CA's helpt bij de beoordeling van de geabsorbeerde stralingsdosis (de zogenaamde cytogenetische straling biodosimetry). Bovendien was de analyse van de frequentie en soort specifieke aberratie ook informatie van belang voor het bepalen van de kwaliteit van de straling wordt geabsorbeerd 17, 18. Cytogenetische studie geeft een direct beeld van de impact van schadelijke stoffen op DNA. Dit in tegenstelling tot de indirecte technieken zoals komeettest. Echter, cytogenetische studie geweest onderbenut in gebieden buiten van de straling, mede door de vele hands-on betrokken stappen.
Hoewel blootstelling aan organische koolstof aanwezig in de PM is bekend dat negatieve invloed hebben op onze gezondheid, weinig studies rapportage biologische effecten zijn onder andere de samenstelling ervan 9. Dit komt door de dure en omslachtige chromatografische methoden die arbeidsintensieve winning, verwerking, concentraties en derivatisering protocollen vereisen, terwijl ze alleen inzicht voor een klein deel van een specifieke soort verbindingen telkens. Bovendien, de protocollen leiden tot aanzienlijke manipulatie of vernietiging van het oorspronkelijke monster, waardoor extra tests niet kan worden uitgevoerd. Voordelen van nucleaire magnetische resonantie analyse (NMR) bevatten die NMR is een niet-destructieve methode; het vereist een zeer beperkt aantal steps (extractie, concentratie) voorafgaand aan analyse, en hoogfrequente NMR instrumenten (van 400 MHz tot 900 MHz) zijn beschikbaar in vele, zo niet alle, universiteiten in de kernfaciliteit. Een uitgebreid overzicht van de atmosferische aerosol NMR studies is onlangs verschenen 19. Tenslotte vanwege zijn vermogen om structurele informatie en banden tussen groepen zijn, NMR is superieur aan andere spectrometrische methoden zoals FT-IR, UV-Vis en Raman spectrometrie die alleen gegevens van het soort functionele groepen. Indien nodig, kunnen morfologische karakterisering van PM worden uitgevoerd naast NMR spectrometrie met behulp van scanning elektronenmicroscopie.
Zelfs van een enkele locatie, de samenstelling van de verzamelde PM kan variëren afhankelijk van de tijd van het jaar. Een groot genoeg hoeveelheid materiaal moet worden verwerkt en bewaard bij -80 ° C gedurende herhaalde bepalingen of aanvullende tests. Stappen 2.1.1 tot 3.1.3 moet aseptisch worden uitgevoerd in een biosafety kast. Als verontreiniging of gecompromitteerd cellulaire morfologie wordt waargenomen, niet verder te gaan met de rest van het protocol. De trypsinebehandeling tijd moet worden aangepast op basis van het celtype. Hier, macrofagen zeer hechtend en we hebben gevonden dat een combinatie van 1 min trypsine en schrapen beste werkt, maar alleen trypsine gedurende 5 minuten werken voor de meeste celtypen. Hypotone behandeling varieert ook afhankelijk van celtype en moet worden gestandaardiseerd. De dosering en behandelingsduur van colcemide zijn de belangrijkste parameters voor chromosoom voorbereiding; een over-dosis kan cellen doden of kraam de celcyclus. We beschrijven hier voorwaarden RAW264.7 cellen en optimalisering nodig voor andere celtypen. Het niet ideale omstandigheden in deze stap kunnen een negatieve invloed hebben op de mitotische index evenals chromosoom morfologie, waardoor de resultaten te vinden. Ook wordt aanbevolen om de niveaus van cytotoxiciteit van de PM voorafgaand aan cytogenetische analyse beoordelen en selecteer de dosering aan.
in vitro toxicologische evaluaties zijn beperkt door het type gebruikte cellen blootstelling omvang en deeltjesconcentraties. Verder in deze studie gebruikt we de wateroplosbare extract van PM en dus kan het potentieel van in water oplosbare soorten cytogenetische afwijkingen veroorzaken niet meegeteld. Andere beperkingen zijn geassocieerd met de aanwezigheid van "polymorfe varianten" - variaties in het centromere regio en korte armen van chromosoom; sommige submicroscopische of cryptische herschikkingen die kunnen worden uitgelegd en de aanwezigheid van complexe karyotypes.
Hier laten we zien dat de invoering van cytogenetische analyse kan helpen bij de identificatie van de PM-geïnduceerde schade aan DNA en kan mogelijk dienen als een voorspellende eindpunt bij de beoordeling van de gevolgen voor de gezondheid veroorzaakt door blootstelling aan fijn stof. Onze studie is, voor zover wij weten, de eerste om CA te geven in reactie op PM. Replicatie van deze resultaten iswenselijk onze bevindingen te bevestigen. Dit protocol kan worden aangepast aan vrijwel elk type vermoedelijke DNA beschadigend middel te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund, gedeeltelijk, door de National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [subsidie nummer 1P20GM109005], de Arkansas Space Grant Consortium door de National Aeronautics and Space Administration [subsidie nummer NNX15AK32A], en het Nationaal Instituut voor Veiligheid en Health (NIOSH) [subsidie nummer 2T420H008436]. De auteurs willen graag Christopher Fettes bedanken voor het corrigeren en redigeren dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , Springer. 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
