Summary
Dieses Protokoll beschreibt Techniken für die Quantifizierung und Charakterisierung von Chromosomenaberrationen in vitro in RAW264.7 Makrophagen der Maus nach der Behandlung mit der Umgebungsluft Feinstaub.
Abstract
Die Exposition gegenüber Feinstaub (PM) ist eine der weltweit wichtigsten gesundheitlichen Bedenken, die verschiedene zelluläre Komponenten beschädigen können, einschließlich der nuklearen genetischen Materials. Um die Auswirkungen der PM auf nukleare genetische Integrität, strukturelle Chromosomenaberrationen erzielte in den Metaphasespreitungen der Maus RAW264.7-Makrophagenzellen zu bewerten. PM wird aus der Umgebungsluft mit einem hohen Volumen Schwebstoffe insgesamt Sampler gesammelt. Das gesammelte Material wird solubilisiert und filtriert, um das wasserlösliche, Feinanteil beibehalten. Die Teilchen werden für die chemische Zusammensetzung, die durch Kernspinresonanz (NMR) -Spektroskopie charakterisiert. Verschiedene Konzentrationen von Partikelsuspension werden auf eine in - vitro - Kultur von RAW264.7 Makrophagen der Maus für eine Gesamtbelichtungszeit von 72 Stunden zugegeben, zusammen mit unbehandelten Kontrollzellen. Am Ende der Belichtung wird die Kultur mit Colcemid behandelten Zellen in der Metaphase zu verhaften. Die Zellen werden dann geerntet, mit hypotonischer Lösung behandelt, in acetomethanol fixiert, dropped auf Glasobjektträger und schließlich mit Giemsa-Lösung gefärbt. Die Objektträger werden untersucht die strukturellen Chromosomenaberrationen zu bewerten (CAs) in Metaphase bei 1,000x Vergrößerung breitet sich ein Hellfeld-Mikroskop. 50 bis 100 Metaphasespreitung sind für jede Behandlungsgruppe erzielt. Diese Technik ist für den Nachweis von strukturellen Chromosomenaberrationen (CAs) wie Chromatidentyp Art bricht, Chromatidentyp Art Austausch, acentric Fragmente angepasst, dizentrischen und Ringchromosomen, Doppel Minuten, Endoreduplikation und Robertson'sche Translokation in vitro nach der Exposition gegen Uhr. Es ist eine leistungsfähige Methode, um eine gut etablierte zytogenetische Endpunkt zu epigenetischen Veränderungen zu verknüpfen.
Introduction
Es wurde geschätzt , dass die Exposition gegenüber Partikeln (PM) verursacht mehr als 3 Millionen zusätzliche Todesfälle jährlich, in erster Linie von Herz - Lungen - Erkrankungen und Lungenkrebs 1. Tatsächlich PM wurde als krebserzeugend für den Menschen von der Internationalen Agentur für Krebsforschung (Gruppe 1), ein erhöhtes Risiko für Lungenkrebs erkannt mit Exposition gegenüber PM zugenommen hat 2 gezeigt. Interessanterweise fast alle Krebszellen beherbergen numerische und / oder strukturelle Chromosomenanomalien. Partikulärer organischer Kohlenstoff ist eine Variante, komplexe und heterogene Mischung, deren Zusammensetzung und Größenverteilung auf die Emissionen abhängig sowie physikalischen und chemischen Umwandlungen. Auf sie entfallen 35 bis 55% der städtischen PM 2.5 Masse (PM 2,5 um Größe und kleiner) und mehr als 60% der ländlichen und kontinentalen Hintergrund PM 2.5 Masse 3, 4. Die wasserlösliche Fraktion einen Anteil von 30-90% der organischen Aerosol. Eine große Anzahl von organischen Verbindungen,identifiziert wurden, einschließlich aliphatischer Kohlenwasserstoffe, polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe und deren oxygenierte und nitrierte Derivate, aliphatische Aldehyde und Alkohole, freie Fettsäuren und deren Salze, Di-Carbonsäuren, multifunktionelle Verbindungen, Proteine und Huminsäure artigen Makromoleküle (HULIS) unter Verwendung von chromatographische Methoden gekoppelt mit massenspektrometrischen Techniken 5-8. Diese Verbindungen weisen weniger als 10-20% der partikulären organischen Kohlenstoff, wodurch die meisten organischen Kohlenstoff ist unbekannt 9.
Experimentelle Beweise legen nahe, dass die Zytotoxizität, oxidativer Stress, Entzündung und bei der Entwicklung von PM-assoziierten Krankheitszuständen beteiligt sind. Es wurde kürzlich gezeigt, jedoch, dass Exposition gegenüber PM resultiert auch in einer Reihe von epigenetischen Veränderungen, einschließlich Änderungen in der DNA - Methylierung von repetitiven Elementen in beiden experimentellen in vitro - Systemen und in menschlichen Subjekten 10-12. Von besonderem Interesse sind die Auswirkungen derPM auf Satelliten-DNA - größere und kleinere Satelliten -, die in der heterochromatischen Region um die Zentromer der Chromosomen zu finden sind. Es wurde gezeigt , daß diese Wirkungen von der Natur persistent sein kann, wie sie für mindestens 72 Stunden nach der Exposition 12 detektiert werden. Veränderungen in der DNA - Methylierung, besonders um Zentromeren kann zur Ansammlung von Satelliten - DNA - mRNA - Transkripte, Kompromisses chromosomale Integrität während der Zellteilung führen und in der Folge in der Entwicklung einer Vielzahl von pathologischen Zuständen 13 führen.
Die Anpassung der zytogenetischen Ansatz für die Analyse von CAs als Endpunkt epigenetischen Veränderungen von PM verursacht, so ist von großer Bedeutung. Hier berichten wir den Ansatz für die Umgebungs PM Sammlung und Vorbereitung, in vitro - Exposition und Analyse von CAs die murine Makrophagen RAW264.7 Modellsystem. Makrophagen umfassen die erste Verteidigungslinie gegen die inhalierte Fremdkörper und damit tseine Zelllinie dient als etablierter und der am häufigsten verwendete Modell in der Partikel Toxikologie 11, 12, 14, 15.
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Protocol
1. Partikelgewinnung und Vorbereitung
- Die Kalibrierung des hohen Volumens Schwebstoffe insgesamt Sampler
- Ziehen Sie den Sampler Motor von der Massendurchflussregler und der Motor zu einem stabilen Wechselstromquelle (Abbildung 1).
HINWEIS: Ein Filter wird bei diesem Vorgang nicht verwendet. - Montieren Sie den Kalibrator Öffnung und Toplader-Adapterplatte an den Sampler. Ziehen Sie die Top-Loading-Adapter Niederhalte Muttern fest, um sicherzustellen, dass keine Luftlecks vorhanden sind. Lassen Sie den Sampler Motor seine normale Betriebstemperatur zu erwärmen (ca. 10-15 min).
- Führen Sie eine Dichtigkeitsprüfung durch die Löcher abdecken oben auf der Öffnung und Druckhahn an der Öffnung mit den Händen. Hören Sie ein schrilles Quietschen Klang durch Luft entweicht. Wenn dieser Ton zu hören ist, nachziehen Toplader-Adapter Niederhaltemuttern als ein Leck vorhanden ist. Wenn der Ton niedriger ist, ist das Leck in der Nähe von einem der anderen Dichtungen in den system.
- Schließen Sie eine Seite eines Wasser Manometer an den Druckanschluss auf der Seite der Öffnung mit einem Gummi-Vakuumröhre. Verlassen die gegenüberliegende Seite des Manometers zur Atmosphäre hin offen. Halten Sie ein Manometer vertikal, um genaue Messwerte zu gewährleisten. Durch Tippen auf die Rückseite des kontinuierlichen Fluss Recorder wird dazu beitragen, den Stift zu zentrieren und genaue Messwerte liefern.
- Wiederholen Sie Schritt 1.1.2 unter Verwendung von fünf Flussraten darstellen Betriebsflussraten von 30 bis 60 ft / min (etwa alle 5-6 ft 3 / min). Stellen Sie den Regler auf der variablen Öffnung an fünf verschiedenen Positionen und fünf verschiedene Messungen vornehmen.
- Notieren Sie sich die Umgebungslufttemperatur, Umgebungsluftdruck, Sampler Seriennummer, Seriennummer Öffnung, Öffnung Steigung und mit Datum der letzten zertifiziert, das Datum, die Standortwahl und Betreiber Initialen auf dem Kalibrierungsblatt.
- Ziehen Sie den Sampler Motor von der Massendurchflussregler und der Motor zu einem stabilen Wechselstromquelle (Abbildung 1).
- Schwebstoffe insgesamt Probensammlung und gravimetrische Analyse
- Wickeln Sie ein8 "x 10" Quarzfaserfilter in zwei Schichten von Aluminiumfolie. Setzen Sie den Filter eingewickelt in den Ofen und stellen Sie die Temperatur auf 550 ° C. Backen Sie den Filter für mindestens 4 Stunden. Lassen Sie den Ofen abkühlen und rufen Sie den Filter. Setzen Sie den Filter im Exsikkator mit CaCO3.
- Wiegen des Filters in einer Mikrowaage mit einer Genauigkeit von 10 & mgr; g. Wiederholen Sie die Messung dreimal während eines Tages. Einzelne Messungen sollten innerhalb von 25 ug sein. Wird dies nicht erreicht wird, kehrt die verpackte Filter in den Exsikkator und wiederholen Sie den nächsten Tag den Prozess.
- Öffnen Sie den Schutz Deckel (Abbildung 2). Filter entfernen Halterrahmen durch die vier Flügelmuttern lockern, so dass die Messingschrauben und Unterlegscheiben aus dem Weg zu schwingen hinunter. Klappen Sie den Filter aus der Aluminiumfolie und gereinigt Pinzette vorsichtig zu zentrieren, rauere Seite nach oben, auf dem Trag Bildschirm. richten Sie richtig den Filter auf dem Bildschirm.
- Platzieren Sie den Rahmen auf dem Bildschirm, und befestigen Sie es mitDie Messingschrauben und Unterlegscheiben, während eine ausreichende Druckaufbringungsluftverlust an den Kanten zu vermeiden. Wischen Sie Staubansammlung aus der ganzen Filterhalter mit einem sauberen Tuch. Schließen Obdach Deckel vorsichtig und sichern.
- Achten Sie darauf, alle Kabel sind in die entsprechenden Aufnahmebuchsen eingesteckt und der Schlauch zwischen dem Gebläsemotor Druckanschluss und den kontinuierlichen Fluss-Recorder angeschlossen ist.
- Bereiten Sie den Fluss-Recorder. Drücken Sie Stift Arm Heber Stiftspitze zu heben, und legen Sie ein neues Diagramm. Richten Sie die Lasche des Diagramms auf der Antriebsnabe des Recorders und drücken Sie mit dem Daumen-Chart Zentrum auf die Nabe zu senken. Stellen Sie die Zeit von der Antriebsnabe Dreh im Uhrzeigersinn, bis die korrekte Zeit auf Diagramm mit Zeitindex Zeiger ausgerichtet ist.
- Wechseln Sie manuell auf dem Sampler und die Sammlung beginnen. Überwachen Sie den Recorder sicher sein, es ist richtig Einfärben und die verstrichene Zeit Anzeige um sicherzustellen, dass es richtig funktioniert.
- Am Ende der Abtastperiode, schalten Sie den Sampler, Rekord ausdie verstrichene Zeit und das Diagramm abgerufen werden. Entfernen Sie den Rahmen um den Filter zu belichten. Entfernen Sie den freigelegten Filter aus dem Stützsieb indem sie sie sanft an den Enden mit der Zange zu halten. Falten Sie den Filter der Länge nach, so dass Probe berührt Probe zweimal und wickeln Sie es in der ursprünglichen Aluminiumfolie.
- Lagern Sie den Filter in einem Exsikkator mit CaCO3 für mindestens 24 Stunden vor dem Wiegen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2 das Gewicht der Filter nach der Probenahme zu messen. Setzen Sie den Filter in einer Zip-Plastikbeutel und lagern Sie es in -80 ° C bis zur Analyse.
- Die Analyse der gesammelten Schwebstoffe insgesamt Probe
- Abrufen der gespeicherten Filter, entfalten die Aluminiumfolie und übertragen Sie den Filter auf eine saubere Teflonoberfläche. Mit einer Pinzette und Skalpell, schneiden Außen (weiß) Teil des Filters und entsorgen.
- Als nächstes schneiden Sie den Filter in 0,5 "x 0,5" Stücke schneiden und Stücke in einem 100 ml Kolben. 50 ml Reinstwasser. Der Kolben wird in einem UltraschallBad und beschallen bei 33 ± 3 kHz für 60 min.
- Filter Extrakt durch ein 0,45 um Polypropylen-Spritzenfilter in einen 100 ml Rundkolben. das Wasser verdampfen, um einen Rotationsverdampfer Instrument unter Druck bei 50 ° C bis ca. 5 ml Extrakt unter Verwendung bleibt in der Flasche.
- Dampfe das restliche Wasser in einem 15 ml-Birnenkolben mit bekanntem Gewicht. Wiegen Sie die Flasche mit dem Trockenextrakt und die Masse des Trockenextrakt aufzuzeichnen.
- Man löst das trockene Probe mit 400 ul D 2 O durch Beschallen für 15 Minuten und Transfer in einem 5 - mm - Standard - NMR - Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 12.000 xg bei Raumtemperatur um irgendwelche ungelösten Stoffe zu entfernen.
- Wiederholen mit 300 & mgr; l D 2 O. Zugabe von 10 & mgr; l NaN 3 1.4% (Endkonz .: 0,02% w / v) in dem NMR - Röhrchen. Werden 10 ul (32 ug) der Gesamtmenge an suspendierten Teilchen (TSP) -D4 (3,2 mg / ml) an D 2 O (Endkonzentration 0,258 mM) in dem NMR - Röhrchen.
- Erwerben 1 H - NMR - Spektren eines NMR - Spektrometers bei 600,17 MHz betrieben wird .
- Legen NMR-Röhrchen in die Tripelresonanz Kryosonde. Kalibrieren Sie das Gerät in der folgenden Reihenfolge: lock, tune, Shim, 90 ° Pulslängenkalibrierung und Empfängerverstärkungseinstellung.
- Messen Sie Spektren bei 25 ° C mit einem 1 D Anregung Sculpting-Sequenz mit 180 Wasser-selektive Pulse in Digital-Quad-Erfassungsmodus, 8.192 Scans, 4 Dummy-Scans, Wobbelbreite von 8012,57 Hz, die Frequenz für die Wassersignalunterdrückung bei 4,70 ppm, eingestellt Offset 1,70 sec Erfassungszeit, 32.768 Zeitbereich Datenpunkte (TD), 1 ms Dauer Gradienten (p16), 100 & mgr; s Erholung Verzögerung nach dem Gradienten (d16).
- Verfahren 1 H - NMR - Spektren , die durch eine Linienverbreiterung von 1 Hz und Nullfüllung um einen Faktor von 2 (65.536 Datenpunkte) anwenden. Korrigieren Sie die Phase und Baseline manuell und zu integrieren. Set TSP-d4-Peak bei 0,0 ppm.
- Abrufen der gespeicherten Filter, entfalten die Aluminiumfolie und übertragen Sie den Filter auf eine saubere Teflonoberfläche. Mit einer Pinzette und Skalpell, schneiden Außen (weiß) Teil des Filters und entsorgen.
2. Partikelbelastung
- Kultur einrichten
- Warm vollständige Wachstumsmedium enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS) und Penicillin-Streptomycin-Lösung (100 U / ml), 0,25% Trypsin-Lösung und Calcium-Magnesium-freien Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) in einem Wasserbad (bei 37 ° C) für mindestens 30 min vor Kulturbeginn.
- Nehmen Sie einen T75 - Kolben von 5% CO 2 Inkubator kultiviert RAW264.7 Zellen und die Zellen werden mit 2 ml vorgewärmtes PBS zweimal.
- Abzulösen anhaftenden RAW264.7-Zellen vom Boden der Gewebekulturgefäß unter Verwendung von 1 ml vorgewärmtes Trypsin-Lösung, gefolgt von Abkratzen.
- Sammle die Zellen aus Gewebekulturgefäß und stellen durch wiederholtes Pipettieren eine Einzelzellsuspension. Zähle die Anzahl der Zellen mit Trypan - Blau und der Platte bei einer Dichte von 8000 / cm 2 (500.000 Zellen insgesamt) in einer 100 mm - Gewebekulturschale mit vorgewärmtem kompletten Medien. Einstellen Medienvolumen auf 10 ml für eine Endkonzentration von 50.000 Zellenpro ml.
HINWEIS: Verdoppelung der Anzahl der Platten, wenn DNA-Methylierungsanalyse wird ebenfalls durchgeführt. - Platzieren Sie die neu ausplattiert RAW264.7 - Zellen zurück in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C und lassen für 24 h zu befestigen.
- Auch in einem Biosicherheitsschrank resuspendieren gefilterten Partikel. Beispielsweise verdünnte Teilchen in einer Konzentration von 0,5 mg / ml in sterilem PBS für eine 5 & mgr; g / ml Behandlung Dosis und bei 5 mg / ml für eine 50 & mgr; g / ml Behandlungsdosis. Verdünnungen bis zu Monat im Voraus gespeichert und bei -80 ° C hergestellt werden.
- Die Behandlung mit Feinstaub
- Nehmen Sie die Zellen , die aus 5% CO 2 Inkubator und überprüfen unter 10 - facher Vergrößerung ein inverses Mikroskop für das Zellwachstum unter Verwendung der Zellmorphologie, Kulturbedingungen und Kontamination. Man sollte erwarten, dass mindestens 30% konfluenten Zellen in diesem Stadium zu haben.
- Aseptisch absaugen Medien sterilisierten Pipette und waschen Sie das Kulturgefäß mit 2 ml 37 ° C PBSzwei Mal vollständig die Medien entfernen und schwebenden oder toten Zellen.
- Hinzufügen vorbestimmte Dosis von Partikeln mit frischem Medium in den Kulturgefäßen und inkubieren gewünschte Zeit bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. In dieser Studie wurden 72 h RAW264.7-Zellen mit PM behandeln, um die Belichtung für gleichzeitige genotoxischen und epigenotoxic Analyse parallel.
HINWEIS: Die Zytotoxizität negativ auf die Qualität der zytogenetische Analyse beeinflussen können. Daher zusätzliche Assays wie Cytotoxizität, DNA-Methylierung, Western-Blotting oder Genexpressionsanalyse werden typischerweise auf behandelten Zellen durchgeführt. Expose Zellen mit dem spezifischen Assay gewünscht beschrieben und gehen. Unerfahrene Anwender können auch eine positive Kontrolle, wie Methyl Methansulfonat einschließen möchten ihre Fähigkeit zu testen CAs zu erkennen.
3. zytogenetischen Assay
- Die Behandlung Zellen in der Metaphase zu verhaften
- Wärmen Sie die Colcemid sosung (10 & mgr; g / ml) in einem Wasserbad 37 ° C für 30 min. Wischen Sie den Deckel mit 70% Alkohol unter einem biologischen Sicherheit Kabinett das Risiko einer Kontamination zu minimieren
- Entfernen Sie vollständig die Medien aseptisch und waschen Sie die Kulturgefäße mit 2 ml vorgewärmt PBS zweimal.
- Fügen vorgewärmtes frisches Medium (2 ml Medium / 10 6 Zellen) enthält , Colcemid - Lösung (5 ul / ml) in dem Kulturgefäß und Inkubieren für 2 Std.
- Zellernte
- Warm Trypsinlösung und PBS in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 min gehalten. Von diesem Schritt an ist es nicht erforderlich, aseptischen Zustand zu halten.
- Komplett-Medium zu entfernen, waschen Sie die Kulturgefäße mit 2 ml 37 ° C PBS für zwei Mal, fügen Kolben erforderliche Volumen der vorgewärmten Trypsin-Lösung (in der Regel 2 ml für 60 mm Kulturschale oder T25-Flasche und 4 ml für 100-mm-Schale oder T75 ), und setzen CO & sub2 ; -Inkubator das Kulturgefäß bei 37 ° C für 1 min in 5% zurück.
- Take das Kulturgefäß aus, nehmen die Zellen mit einem Schaber, und 10 ml PBS hinzufügen Trypsin Aktion zu stoppen.
- Pipette nach oben und unten mindestens zehnmal Einzelzellsuspension und Transfer-Zellen in einem 15 ml konischen Boden Zentrifugenröhrchen zu machen.
- Zentrifuge Zellsuspension bei 400 xg für 5 min in einer Ausschwingzeit Zentrifuge bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand, brechen die Zellpellet durch leichtes Klopfen, mit 10 ml PBS, und wieder für fünf Minuten zentrifugiert werden.
- Hypotone Behandlung und Fixierung
- Vorwärmen 0,075 M Kaliumchloridlösung in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 30 min.
- Überstand entfernen, ohne das Zellpellet zu stören und etwa 0,5 ml PBS verlassen.
- brechen Sie vorsichtig das Zellpellet und Einzelzellsuspension machen eine P200 Pipette.
- 4 ml vorgewärmten Kaliumchloridlösung tropfen unter leichtem Schütteln.
- Inkubieren Sie die Zellen in hypotonischen potassium Chloridlösung in einem 37 ° C Wasserbad für 20 min.
- Machen Sie frische acetomethanol Lösung durch Zugabe von 3-Teile Methanol mit 1-K-Eisessig. Halten Sie diese frisch zubereitet Fixiermittel bei Raumtemperatur.
- Nach hypotonischer Behandlung, ein gleiches Volumen (4 ml) von Fixiermittel in dem Rohr hinzuzufügen und die Lösung vorsichtig durch Umdrehen des Röhrchens gemischt.
- Zentrifuge bei 400 xg für 5 min bei Raumtemperatur, und entfernen Sie den Überstand. In diesem Stadium Zellpelletgröße zunimmt, werden weißlich und mehr sichtbar.
- Überstand entfernen, 4 ml frisches Fixiermittel und halten bei Raumtemperatur für 30 min.
- Zentrifuge bei 400 xg für 5 min, entfernen Überstand und geben zwei weitere Waschungen mit 4 ml Fixiermittel.
- Slide Reinigung und Metaphasespreitung Vorbereitung
- Tauchen Glasplättchen vollständig in 10% flüssiges Detergens für 30 min.
- Spülen Sie die Folien gründlich in kaltem Leitungswasser für 30 min.
- Rinse gleitet dreimal mit destilliertem Wasser vollständig Reinigungsmittel zu entfernen, in destilliertem Wasser tauchen, und für eine spätere Verwendung im Kühlschrank lagern.
HINWEIS: Reinigungs Dias vor dem Gebrauch Gleichmäßigkeit des Ausbringens erleichtert und Metaphase Qualität erhöht. - Drop-10 & mgr; l Zellsuspension auf gekühlten nassen Rutsche und lassen Sie es über Nacht trocknen bei Raumtemperatur an der Luft.
- Die Färbung und Montage
- Bereiten Sie 50 ml Giemsa-Lösung durch einen Teil der Giemsa-Lösung mit einem Teil PBS mischen und gießen Sie eine Glasküvette in.
- Tauchen Sie die Folien in Färbelösung für 20 min.
- Spülen Sie die Folien in destilliertem Wasser, um überschüssige Fleck entfernen und sofort trocknen die Folien einen Fön verwenden.
- Lassen Sie die Objektträger bei Raumtemperatur über Nacht.
- Tragen Sie einen einzigen Tropfen Eindeckmedium auf der Folie, legen Sie vorsichtig mit einem Deckglas auf dem Montagemedium, lassen Sie das Medium über den Objektträger zu verbreiten langsam und entfernendas überschüssige Medium mit einem Papiertuch. Erlauben die montierte Rutsche für mindestens 1 Stunde vor dem Bewegen oder Betrachten unter einem Mikroskop zu trocknen Bewegung des Deckglases zu vermeiden.
Achtung: Es ist wichtig, das Deckglas sorgfältig zu platzieren, ohne dass Blasen in diesem Schritt zu bilden. Die Verwendung von übermäßiger Hitze Blasen zu entfernen, ist nicht zu empfehlen.
- Die mikroskopische Beobachtung und Aberrationstypen
- Untersuchen Sie die Struktur CAs in Metaphase bei 100-facher Vergrößerung verbreitet eine gute Qualität Hellfeld-Mikroskop.
- Ergebnis mindestens 50 bis 100 Metaphase-Spreads für jede Behandlungsgruppe für Behandlungen, die eine große Anzahl von CAs induzieren. Für kleinere Effektgrößen wird die Analyse von bis zu 300 Metaphasespreitungen beraten.
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Representative Results
Große Sorgfalt sollte, sowie die Zeit des Jahres, in der Wahl der Position des TSP-Sampler genommen werden, wenn Sammlung durchgeführt wird. Die chemische Zusammensetzung sowie die Größe der Teilchen im wesentlichen die Ergebnisse beeinflussen können. Das Material gesammelt haben, sollten vor dem weißen Filter sichtbar sein. Eine normale Maus Metaphasespreitung wird 40 acentric Chromosomen haben. Das Ziel dieser Technik ist es, eine Änderung (oder das Fehlen davon) in dem Anteil der abnormalen Chromosomen in behandelten Zellen im Vergleich zu Kontrollen zeigen. Diese Änderung kann dann quantifiziert werden (Anzahl der abnormen Chromosomen) und qualifizierte (Typ von Anomalien).
Normale Maus Metaphasespreitung haben 40 acentric Chromosomen (3A). Die Behandlung mit Partikelstoffe induziert verschiedene CAs wie in Abbildung 3, wie chromatid Pause (3B), acentric Fragment gezeigt (
Abbildung 1. Das hohe Volumen Schwebstoffe insgesamt (TSP) Sampler. Das Bild zeigt die TSP-Sampler in einem Dach in einem städtischen Gebiet installiert Umgebungspartikel sammeln. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Geladen Quarzfaserfilter nach der Entnahme für die hochvolumigen TSP s mitreichlicher. Close-up auf dem Filter auf dem TSP-Sampler installiert ist, nach dem Gebrauch. Beachten Sie, dass die Farbe des Filters von weiß geändert bis grau. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 : Mikroskopische Aufnahme zeigt repräsentative Beispiele für verschiedene Arten von strukturellen Aberrationen in RAW264.7 - Zellen induziert , nachdem sie mit verschiedenen Konzentrationen von teilchenförmigem Material behandelt wird . Die Aberrationen sind durch Pfeile angezeigt. (A) normalen Metaphasespreitung mit 40 akrozentrischer Chromosomen, (B) Chromatidentyp Typ Pause (CTB), (C) acentric Fragment (acentrics), (D) Ringchromosom, (E) dizentrischen Chromosom (Dic), (F) double min (Dimn.-), (
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Discussion
Die zytogenetische Untersuchung oder mikroskopische Analyse der Zahlen oder Strukturen der Chromosomen, in erster Linie in der Metaphase-Spreads, liefert Informationen von entscheidender Bedeutung für die Prognose, die Risikobewertung und die Behandlung für verschiedene Krankheiten. Es ist nun gut etabliert, dass zytogenetische Anomalien, die mit dem Fortschreiten und die Entwicklung von verschiedenen Krankheiten verbunden sind, einschließlich Krebs. Bisher CAs wurden in allen wichtigen Tumorarten gefunden. CAs können spontan oder entweder durch äußere oder innere Reize, wie ionisierende Strahlung (IR) entstehen - eine der wichtigsten externen Risikofaktoren, die 16 verschiedene Arten von zytogenetischen Veränderungen hervorrufen kann. Analyse von CAs hilft bei der Beurteilung der absorbierten Strahlendosis (zytogenetische Strahlung Biodosimetrie genannt). Darüber hinaus stellt die Analyse der Häufigkeit und Art der spezifischen Aberration auch wichtige Informationen für die Bestimmung der Qualität der Strahlung 17, 18 absorbiert wird. Zytogenetischen Studie liefert ein direktes Abbild der impact von schädigenden Mitteln auf DNA. Dies steht im Gegensatz zu einer indirekten Techniken wie der Comet-Assay. Allerdings hat zytogenetischen Studie war in Bereichen außerhalb der Strahlung in Anspruch genommenen, zum Teil wegen der zahlreichen Hands-on Schritte.
Obwohl Exposition gegenüber organischen Kohlenstoff in der PM - negativ bekannt ist für unsere Gesundheit beeinflussen, nur wenige Studien biologische Wirkungen Berichterstattung umfassen ihre Zusammensetzung 9. Dies ist wegen der kostspieligen und umständlichen chromatographische Methoden, die arbeitsintensive Extraktion erfordern, die Verarbeitung, Konzentrationen und Derivatisierung Protokolle, während sie nur Einblicke für eine kleine Teilmenge von einer ganz bestimmten Art von Verbindungen stellen jedes Mal. Darüber hinaus führen die Protokolle in der wesentlichen Manipulation oder Zerstörung der ursprünglichen Probe, so können zusätzliche Tests nicht durchgeführt werden. Vorteile der Kernspinresonanz (NMR) -Analyse beinhalten, dass NMR eine zerstörungsfreie Methode ist; es erfordert eine sehr begrenzte Anzahl von steps (Extraktion, Konzentration) vor der Analyse und Hochfrequenz-NMR-Geräte (von 400 MHz bis 900 MHz) sind in vielen, wenn nicht sogar alle Universitäten in der Core Facility. Eine umfassende Überprüfung des atmosphärischen Aerosols NMR - Untersuchungen wurde 19 vor kurzem veröffentlicht. Schließlich wegen seiner Fähigkeit, Strukturinformationen und Bindungen zwischen Gruppen bereitzustellen, ist NMR überlegen andere spektrometrische Verfahren, wie FT-IR, UV-Vis und Raman-Spektrometrie, die nur Daten von der Art der funktionellen Gruppen bereitzustellen. Bei Bedarf können morphologische Charakterisierung von PM neben NMR-Spektrometrie mit der Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie durchgeführt werden.
Auch von einer einzigen Stelle, die Zusammensetzung des PM gesammelt in Abhängigkeit von der Zeit des Jahres variieren. Eine ausreichend große Menge an Material verarbeitet werden soll und gehalten bei -80 ° C für Wiederholungsversuche oder komplementärer Assays. Die Schritte 2.1.1 bis 3.1.3 sollten aseptisch in einem BIOS durchgeführt werdenafety Schrank. Wenn eine Kontamination oder kompromittiert Zellmorphologie beobachtet wird, fahren Sie nicht mit dem Rest des Protokolls. Die Trypsinbehandlung Zeit braucht, um auf Basis von Zelltyp eingestellt werden. Hier sind Makrophagen haftete sehr gut und wir haben herausgefunden, dass eine Kombination von 1 min Trypsin und Kratzen am besten funktioniert, aber alleine für 5 min funktioniert bei den meisten Zelltypen Trypsin. Hypotone Behandlungszeit variiert auch vom Zelltyp abhängig und muss standardisiert werden. Die Dosis und die Behandlungszeit von Colcemid sind die wichtigsten Parameter für die Chromosomenpräparation; eine Überdosis können die Zellen zu töten oder den Zellzyklus blockieren. Wir beschreiben hier die Bedingungen für RAW264.7 Zellen und Optimierung für andere Zelltypen erforderlich. Failure idealen Bedingungen in diesem Schritt zu finden, kann sich negativ auf den mitotischen Index sowie Chromosomenmorphologie beeinflussen, um die Ergebnisse zu beeinflussen. Es ist auch das Niveau der Zytotoxizität des PM vor der zytogenetische Analyse zur Beurteilung empfohlen und die Dosen entsprechend wählen.
in vitro toxikologische Beurteilungen durch die Art der verwendeten Zellen begrenzt sind, Belichtungs Größe und Partikelkonzentrationen. Weiterhin wird in dieser Studie verwendeten wir das wasserlösliche Extrakt von PM, und daher das Potential des wasserunlöslichen Spezies zytogenetische Aberrationen zu verursachen können nicht berücksichtigt werden. Weitere Einschränkungen sind mit der Anwesenheit von "polymorphe Varianten" assoziiert - Variationen in den Zentromer-Regionen und kurze Arme von Chromosom; einige submikroskopischen oder kryptische Umlagerungen und das Vorhandensein von komplexen Karyotypen falsch interpretiert werden kann.
Hier zeigen wir, dass die Einführung von zytogenetische Analyse bei der Identifizierung von PM-induzierten Schäden an der DNA unterstützen kann und möglicherweise als prädiktiver Endpunkt in Bewertung der Auswirkungen auf die Gesundheit durch Exposition gegenüber Umgebungs PM verursacht dienen. Unsere Studie ist nach unserem Wissen, das erste CAs in Reaktion auf PM anzuzeigen. Replikation dieser Ergebnisse ist,wünschenswert, unsere Ergebnisse zu bestätigen. Dieses Protokoll kann auch fast jede Art von vermuteten DNA-schädigende Mittel zu beurteilen, angepasst werden.
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Acknowledgments
Die Arbeit wurde zum Teil durch das National Institute of Health Center of Biological Research Exzellenz [Grant-Nummer 1P20GM109005], der Arkansas Raum Grants Consortium durch National Aeronautics and Space Administration [Gewährungsnummer NNX15AK32A] und das Nationale Institut für Arbeitsschutz und Health (NIOSH) [Gewährungsnummer 2T420H008436]. Die Autoren möchten sich Christopher Fettes für das Korrekturlesen und Bearbeitung des Manuskripts danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
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