Summary
Detta protokoll beskriver tekniker för kvantifiering och karakterisering av kromosomavvikelser in vitro i RAW264.7 mus makrofager efter behandling med omgivande luft partiklar.
Abstract
Exponering för partiklar (PM) är en av världens viktigaste hälsoproblem, som kan skada olika cellkomponenter, inklusive kärn genetiska materialet. För att bedöma effekterna av PM på kärn genetisk integritet, är strukturella kromosomavvikelser görs i metafas spreadarna mus RAW264.7 makrofagceller. PM samlas in från luften med hög volym totalt suspenderade partiklar sampler. Det insamlade materialet solubiliseras och filtreras för att kvarhålla den vattenlösliga, fina delen. Partiklarna kännetecknas för kemisk sammansättning med kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Olika koncentrationer av partikelsuspension tillsätts på en in vitro-kultur av RAW264.7 musmakrofager för en total exponeringstid av 72 h, tillsammans med obehandlade kontrollceller. I slutet av exponeringen är kulturen behandlas med kolcemid att stoppa celler i metafas. Cellerna skördas sedan, behandlades med hypoton lösning, fixerades i acetomethanol, dropped på objektglas och slutligen färgades med Giemsa-lösning. Diabilder undersöks för att bedöma de strukturella kromosomavvikelser (CAS) i metafas sprider på 1,000X förstoring med hjälp av en ljus-fält mikroskop. 50 till 100 metafas spridning poängsätts för varje behandlingsgrupp. Denna teknik är anpassad för att detektera strukturella kromosomavvikelser (CA), såsom kromatid-typ raster, kromatid-typ utbyten, acentrisk fragment, dicentric och ring kromosomer, dubbla minuter, endoreduplikation och Robertsonian translokationer in vitro efter exponering för PM. Det är en kraftfull metod för att associera en väletablerad cytogenetisk slutpunkt för epigenetiska förändringar.
Introduction
Det har uppskattats att exponering för partiklar (PM) orsakar över 3 miljoner överskott dödsfall årligen, främst från hjärt-kärlsjukdomar och lungcancer 1. I själva verket var PM erkänd som cancerframkallande för människor från International Agency for Research on Cancer (grupp 1), som en ökad risk för lungcancer med ökande nivåer av exponering för PM har visats två. Intressant, nästan alla cancerceller hamnen numeriska och / eller strukturella kromosomavvikelser. Partikulärt organiskt kol är en variant, komplex och heterogen blandning, vars sammansättning och storleksfördelning beror på utsläppen samt fysiska och kemiska omvandlingar. Det står 35-55% av stads PM 2,5 massa (PM 2,5 mikrometer i storlek och mindre) och mer än 60% av landsbygden och kontinental bakgrund PM 2,5 massa 3, 4. Den vattenlösliga fraktionen står för 30-90% av organisk aerosol. Ett stort antal organiska föreningarhar identifierats, inklusive alifatiska kolväten, polycykliska aromatiska kolväten och deras oxygene och nitroderivat, alifatiska aldehyder och alkoholer, fria fettsyror och deras salter, dikarboxylsyror, multifunktionella föreningar, proteiner och humusliknande makromolekyler (HULIS) med hjälp av kromatografiska metoder i kombination med masspektrometriska tekniker 5-8. Dessa föreningar utgör mindre än 10-20% av partikulärt organiskt kol, vilket de flesta av organiskt kol är okänt 9.
Experimentellt bevis antyder att cytotoxicitet, oxidativ stress, och inflammation är involverade i utvecklingen av PM-associerade patologiska tillstånd. Det har nyligen visats, dock att exponering för PM resulterar också i ett antal epigenetiska förändringar, bland annat förändringar i DNA-metylering av repetitiva element, både experimentella in vitro-system och hos människa 10-12. Av särskilt intresse är effekterna avPM på satellit DNA - stora och små satelliter - som finns i heterochromatic regionen runt centromeren av kromosomer. Det visade sig att dessa effekter kan vara långlivade av naturen, eftersom de kan detekteras under minst 72 timmar efter exponering 12. Förändringar i DNA-metylering, särskilt runt centromerer, kan leda till ansamling av satellit DNA mRNA-transkript, kompromiss kromosom integritet under celldelning och därefter leda till utvecklingen av en mängd olika patologiska tillstånd 13.
Anpassning av cytogenetisk tillvägagångssätt för analys av CA som en slutpunkt av epigenetiska förändringar orsakade av PM, vilket är av stor betydelse. Här rapporterar vi tillvägagångssättet för den omgivande PM insamling och förberedelse in vitro exponering och analys av CA med hjälp av mus makrofag RAW264.7 modellsystem. Makrofager omfattar första försvarslinjen mot de inhalerade främmande föremål och därmed thans cellinje fungerar som en etablerad och mest använda modellen i partikel toxikologi 11, 12, 14, 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Partikel Insamling och förberedelse
- Kalibrering av hög volym totalt suspenderade partiklar sampler
- Koppla provtagaren motorn från massflödesstyrenheten och ansluta motorn till en stabil växelströmskälla (Figur 1).
OBS: Ett filter används inte under denna procedur. - Montera kalibrator öppningen och toppmatad adapterplatta till provtagaren. Dra åt toppmatade adapter nedhållande muttrar säkert att säkerställa att inga luftläckage är närvarande. Låt sampler motorn värmas upp till sin normala driftstemperatur (ca 10-15 min).
- Utföra ett läckagetest genom att täcka hålen på toppen av öppningen och tryckuttaget på öppningen med händerna. Lyssna efter en högfrekvent skrikande ljudet från utströmmande luften. Om detta ljud hörs, dra åt toppmatade adapter nedhållande nötter som en läcka föreligger. Om ljudet är lägre läckan är nära en av de andra packningar i sysTEM.
- Ansluter en sida av ett vatten manometer till tryckuttaget på sidan av öppningen med en gummi vakuumrör. Lämnar den motsatta sidan av manometern öppen mot atmosfären. Håll en manometer vertikalt för att säkerställa korrekta avläsningar. Genom att peka på baksidan av det kontinuerliga flödet inspel hjälper till att centrera penna och ge korrekta avläsningar.
- Upprepa steg 1.1.2 med användning av fem flödeshastigheter motsvarande operativt flödeshastigheter från 30 till 60 fot / min (ungefär var 5-6 ft 3 / min). Justera ratten på den variabla öppningen till fem olika positioner och ta fem olika mätningar.
- Anteckna omgivningstemperatur, omgivande lufttryck, sampler serienummer, öppning serienummer, öppning lutning och skärningspunkt med datum förra certifierade, datum, plats plats och operatörens initialer på kalibreringsarket.
- Koppla provtagaren motorn från massflödesstyrenheten och ansluta motorn till en stabil växelströmskälla (Figur 1).
- Totalt inkasso och suspenderade partiklar prov gravimetrisk analys
- linda en8 "x 10" kvartsfiber filter i två skikt av aluminiumfolie. Placera det omslagna filter i ugnen och ställa in temperaturen vid 550 ° C. Baka filtret i minst 4 tim. Låt ugnen svalna och hämta filtret. Placera filtret i torkapparaten med CaCO 3.
- Väg filtret i en mikrovåg med en precision på 10 | j, g. Upprepa mätningen tre gånger under en dag. Individuella mätningar bör ligga inom 25 mikrogram. Om detta inte uppnås, tillbaka lindade filter till exsickatorn och upprepa processen följande dag.
- Öppna skydd locket (Figur 2). Ta bort filterhållaren ramen genom att lossa de fyra vingmuttrarna, så att mässings bultar och brickor för att svänga ner ur vägen. Fäll ut filtret från aluminiumfolie och använda rengjorda pincett att noga centrera den, grövre uppåt på stöd skärmen. Passa filtret på skärmen.
- Placera ramen på skärmen och fäst den medmässings bultar och brickor samtidigt som tillräckligt tryck för att undvika luftläckage vid kanterna. Torka damm ansamling från runt filterhållaren med en ren trasa. Nära skydd locket försiktigt och säkra den.
- Se till att alla sladdar är anslutna till sina respektive mottagnings uttag och slangen mellan tryckuttag fläktmotorn och kontinuerligt flöde inspelaren är ansluten.
- Förbereda flödet brännaren. Tryck penna arm lyftaren att höja penna punkt och infoga ett nytt diagram. Rikta in fliken i diagrammet till driv navet i brännaren och tryck med tummen för att sänka diagram centrum på navet. Ställa in tiden genom att vrida drivnavet medurs tills rätt tid på sjökortet är i linje med tidsindexpekaren.
- växla manuellt på provtagaren och starta insamlingen. Övervaka spelaren att vara säker på att det är infärgning korrekt och förfluten tid indikatorn vara säker på att det fungerar korrekt.
- Vid slutet av provtagningsperioden, stänga av provtagaren, rekordförfluten tid och hämta diagrammet. Ta bort ramen för att exponera filtret. Ta den exponerade filtret från stöd skärmen genom att hålla det försiktigt i ändarna med pincett. Vik filtret på längden så att provet berör provet två gånger och packa in den i den ursprungliga aluminiumfolie.
- Förvara filtret i en exsickator med CaCO 3 under åtminstone 24 timmar före vägning. Upprepa steg 1.2.2 till väga filtren efter provtagningen. Placera filtret i en zip plastpåse och lagra den i -80 ° C fram till analys.
- Analys av insamlat totalt suspenderat partiklar prov
- Hämta den lagrade filter, vik ut aluminiumfolie och överföra filtret på en ren Teflon yta. Använda pincett och skalpell, skär yttre (vit) delen av filtret och kassera.
- Därefter skär filtret i 0,5 "x 0,5" bitar och placera bitar i en 100 ml flaska. Tillsätt 50 ml ultrarent vatten. Placera kolven i ett ultraljudbad och sonikeras under 60 min vid 33 ± 3 kHz.
- Filter extraktet genom ett 0,45 | im av polypropylen sprutfilter till en 100 ml rundbottnad kolv. Avdunsta vattnet med användning av en roterindunstare instrument under tryck vid 50 ° C tills ca 5 ml extrakt förblir i kolven.
- Indunsta återstående vatten i en 15 ml päronformad kolv med känd vikt. Väg kolven med det torra extraktet och registrera massan av det torra extraktet.
- Lös upp det torra provet med 400 | il av D2O genom sonikering i 15 min och överför till ett 5 mm standard NMR-rör. Centrifugera i 5 minuter vid 12.000 xg vid rumstemperatur för avlägsnande av eventuellt oupplöst materia.
- Upprepa med 300 pl D 2 O. Tillsätt 10 pl NaN3 1,4% (slutlig konc .: 0,02% vikt / volym) i NMR-röret. Tillsätt 10 | il (32 | ig) av totalt suspenderat partiklar (TSP) -d4 (3,2 mg / ml) till D2O (slutlig koncentration 0,258 mM) i NMR-röret.
- Förvärva 1 H NMR-spektra med användning av en NMR-spektrometer som arbetar vid 600,17 MHz.
- Sätt NMR röret i trippelresonans Cryoprobe. Kalibrera instrumentet i följande ordning: lås, tune, shim, kalibrering 90 ° pulslängd och justering mottagarförstärkningen.
- Mät spektra vid 25 ° C med en 1 D excite skulptera sekvens med hjälp av 180 vatten selektiva pulser i digital Quad avkänningsläge, 8192 scanningar, 4 dummy skannar, svepbredd 8012,57 Hz, frekvensförskjutning för vatten signalundertryckning inställd på 4,70 ppm, 1,70 sek förvärv tid, 32,768 tidsdomändatapunkter (TD), en ms varaktighet gradient (P16), 100 ^ sek återhämtning fördröjning efter gradient (d16).
- Process 1 H-NMR-spektra genom att applicera en linjebreddning av 1 Hz och noll fyllning med en faktor av 2 (65,536 datapunkter). Korrigera fas och baslinjen manuellt och integrera. Ställa TSP-d4 topp vid 0,0 ppm.
- Hämta den lagrade filter, vik ut aluminiumfolie och överföra filtret på en ren Teflon yta. Använda pincett och skalpell, skär yttre (vit) delen av filtret och kassera.
2. Partikel Exponering
- Kultur inrätta
- Varma komplett tillväxtmedium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) och penicillin-streptomycin-lösning (100 U / ml), 0,25% trypsinlösning och kalcium magnesiumfri fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) i ett vattenbad (vid 37 ° C) under åtminstone 30 minuter innan kultur initiering.
- Ta ut en T75 kolv från 5% CO2 inkubator innehållande odlade RAW264.7 celler och tvätta cellerna med 2 ml förvärmda PBS två gånger.
- Lösgöra vidhäftande RAW264.7-celler från botten av vävnadsodlingskärl med användning av 1 ml av förvärmd trypsinlösning följt av skrapning.
- Samla upp cellerna från vävnadskulturkärl och göra en enda cellsuspension genom upprepad pipettering. Räkna antalet celler med trypanblått och platta vid en densitet av 8000 / cm 2 (500.000 celler totalt) i en 100 mm vävnadsodlingsskål med förvärmda komplett medium. Justera medievolymen till 10 ml för en slutlig koncentration av 50.000 cellerper ml.
OBS: Fördubbla antalet plattor om DNA-metylering analys utförs också. - Placera de nyligen pläterade RAW264.7-celler igen 5% CO2 inkubator vid 37 ° C och låt fästa under 24 timmar.
- Även i en biosäkerhet skåp, resuspendera filtrerade partiklar. Exempelvis kan utspädda partiklarna vid en koncentration av 0,5 mg / ml i steril PBS för en 5 | j, g / ml behandlingsdos och vid 5 mg / ml för en 50 | j, g / ml behandlingsdos. Spädningar kan framställas upp till månad i förväg och lagrades vid -80 ° C.
- Behandling med partiklar
- Ta ut celler från 5% CO2 inkubator och kontrollera under 10x förstoring med användning av ett inverterat mikroskop för celltillväxt, cellmorfologi, odlingsbetingelser, och kontaminering. Man bör räkna med att ha åtminstone 30% sammanflytande celler i detta skede.
- Aseptiskt aspirera media med steriliserad pipett och tvätta odlingskärlet med 2 ml 37 ° C PBStvå gånger för att helt ta bort media och flytande eller döda celler.
- Lägga förutbestämd dos av partiklar med färskt media i odlingskärlen och inkubera under önskad tid vid 37 ° C i 5% CO2 inkubator. I denna studie, behandla RAW264.7-celler med PM för 72 h till parallell exponeringen för samtidig genotoxiska och epigenotoxic analys.
OBS: Cytotoxicitet kan negativt påverka kvaliteten på den cytogenetisk analys. Därför krävs ytterligare analyser såsom cytotoxicitet, DNA-metylering, Western blotting, eller genuttrycksanalys vanligen utförs på behandlade celler. Exponera celler såsom beskrivits och gå vidare med den specifika analysen önskas. Oerfarna användare kanske också vill inkludera en positiv kontroll, såsom metyl metansulfonat för att testa deras förmåga att upptäcka certifikatutfärdare.
3. Cytogenetisk analys
- Behandling för att stoppa celler i metafas
- Värm kolcemid sålution (10 | j, g / ml) i en 37 ° C vattenbad i 30 min. Torka locket med 70% alkohol under ett biosäkerhet skåp för att minimera risken för kontaminering
- Helt ta bort media aseptiskt och tvätta odlingskärl med 2 ml förvärmd PBS två gånger.
- Lägga förvärmda färskt medium (2 ml medium / 10 6 celler) innehållande kolcemid-lösning (5 | il / ml) i odlingskärlet och inkubera i 2 h.
- cellskörden
- Varm trypsinlösning och PBS i ett vattenbad som hölls vid 37 ° C under 30 minuter. Från detta steg och framåt, finns det inget behov av att upprätthålla aseptiska tillstånd.
- Helt ta bort media, tvätta odlingskärl med 2 ml 37 ° C PBS två gånger, lägga till erforderlig volym förvärmda trypsin lösning (vanligtvis 2 ml för 60 mm odlingsskål eller T25 kolv och 4 ml för 100 mm skål eller T75 kolv ), och placera odlingskärlet tillbaka i 5% CO2-inkubator vid 37 ° C under 1 min.
- Take ut odlingskärlet, lossa cellerna med hjälp av en skrapa, och tillsätt 10 ml PBS för att stoppa trypsin åtgärder.
- Pipettera upp och ner åtminstone tio gånger så att enkelcellsuspension och överföra celler i en 15 ml konisk botten centrifugrör.
- Centrifugera cellsuspensionen vid 400 xg under 5 min i en swing out centrifug vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten, bryta cellpelleten genom att försiktigt knacka, tillsätt 10 ml PBS, och centrifugera igen under fem minuter.
- Hypoton behandling och fixering
- Pre-warm 0,075 M kaliumkloridlösning i en 37 ° C vattenbad i minst 30 min.
- Avlägsna supernatanten utan att störa cellpelleten och lämna ca 0,5 ml PBS.
- bryta försiktigt cellpelleten och göra enda cell suspensionen med P200 pipett.
- Tillsätt 4 ml av förvärmd kaliumkloridlösning droppe för droppe med försiktig skakning.
- Inkubera cellerna i hypoton potassium kloridlösning i en 37 ° C vattenbad i 20 min.
- Göra färsk acetomethanol lösning genom tillsats av 3-delar metanol med 1-del isättika. Hålla detta nygjord fixativ vid rumstemperatur.
- Efter hypoton behandling, tillsätt en lika stor volym (4 ml) av fixativ i röret och försiktigt blanda lösningen genom att vända röret.
- Centrifugera vid 400 xg under 5 minuter vid rumstemperatur, och avlägsna supernatanten. I detta skede cellpelleten storlek ökar, blir vitaktiga och mer synliga.
- Avlägsna supernatanten, tillsätt 4 ml färskt fixativ och hålla vid rumstemperatur under 30 minuter.
- Centrifugera vid 400 xg under 5 min, avlägsna supernatanten, och ge ytterligare två tvättningar med 4 ml fixativ.
- Skjut rengöring och metafas sprida förberedelse
- Doppa objektglas helt och hållet i 10% flytande detergent under 30 minuter.
- Skölj objektglasen noggrant i kallt rinnande kranvatten under 30 min.
- rinSE glider tre gånger med destillerat vatten för att helt ta bort tvättmedel, fördjupa sig i destillerat vatten och förvara i kylskåp för framtida bruk.
OBS: Rengöring diabilder före användning underlättar jämnhet vid spridningen och ökar metafas kvalitet. - Drop 10 pl cellsuspension på kyld våt bild och låt den lufttorka över natten vid rumstemperatur.
- Färgning och monterings
- Förbered 50 ml Giemsa-färgningslösning genom att blanda en del av Giemsa färglösning med en del av PBS och häll i ett Coplin-kärl.
- Sänk ned objektglasen i färgningslösning under 20 min.
- Skölj objektglasen i destillerat vatten för att avlägsna överflödig färg och omedelbart Torka glasen med användning av en hårtork.
- Lämnar objektglasen vid rumstemperatur över natten.
- Tillämpa en enda droppe av monteringsmedium på objektglaset, försiktigt placera ett täckglas på monteringsmedium, låt substratet spridas över sliden långsamt och ta bortöverskottet medium med en pappershandduk. Låt den monterade bilden för att torka i minst en timme innan du flyttar eller tittar i mikroskop för att undvika förflyttning av täck.
Varning: Det är viktigt att placera täck försiktigt utan att bilda några bubblor under detta steg. rekommenderas inte användning av överdriven värme för att avlägsna bubblor.
- Mikroskopisk observation och aberration typer
- Undersök de strukturella CA i metafas sprider vid 100 gångers förstoring med hjälp av en god kvalitet ljus-fält mikroskop.
- Betyg åtminstone 50 till 100 metafas sprider för varje behandlingsgrupp för behandlingar som inducerar ett stort antal CA. För mindre effektstorlekar, är analysen av upp till 300 metafas sprider rekommenderas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stor försiktighet bör iakttas vid valet av placeringen av TSP provtagaren, såväl som den tid på året då insamlingen utförs. Den kemiska sammansättningen såväl som storleken på partiklarna kan väsentligen påverka resultaten. Det insamlade materialet ska vara synlig mot den vita filter. En vanlig mus metafas spridning kommer att ha 40 acentrisk kromosomer. Målet med tekniken är att visa en förändring (eller frånvaro därav) av andelen onormala kromosomer i behandlade celler jämfört med kontroller. Denna förändring kan sedan kvantifieras (antal onormala kromosomer) och kvalificerad (typ av avvikelser).
Vanlig mus metafas spridning kommer att ha 40 acentrisk kromosomer (figur 3a). Behandling med partikelämnen inducerar olika CA såsom visas i fig 3, såsom kromatid paus (3b), acentrisk fragmentet (
Figur 1. hög volym total mängd svävande partiklar (TSP) sampler. Bilden visar TSP provtagaren installeras i ett tak i en tätort att samla omgivande partiklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Loaded kvartsfiber filter efter samlingen med hjälp av den höga volymen TSP sampler. Närbild på filtret installeras på TSP sampler, efter användning. Notera att färgen på filtret ändras från vitt till grått. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Mikrofotografi som visar representativa exempel på olika typer av strukturella avvikelser inducerade i RAW264.7-celler efter behandling med olika koncentrationer av partiklar. Aberrationerna anges med pilar. (A) normal meta sprids med 40 acrocentric kromosomer, (B) kromatid-typ paus (CTB), (C) acentrisk fragment (acentrics), (D) ring kromosom, (E) dicentric kromosom (DIC), (F) dubbel min (Dimn), (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cytogenetisk studie eller mikroskopisk analys av siffrorna eller strukturer av kromosomer, främst i metafas sprider sig, innehåller information av avgörande betydelse för prognos, riskbedömning och behandling av olika sjukdomar. Det är nu väl etablerat att cytogenetiska abnormiteter är kopplade till utvecklingen och utvecklingen av flera sjukdomar, bland annat cancer. Hittills har CAs hittats i alla större tumörtyper. CA kan uppstå spontant eller av antingen externa eller interna stimuli, såsom joniserande strålning (IR) - en av de viktigaste yttre riskfaktorer som kan framkalla olika typer av cytogenetisk förändringar 16. Analys av Cas stöd i bedömningen av den absorberade strålningsdosen (kallas cytogenetisk strålning biodosimetry). Dessutom ger en analys av frekvensen och typen av specifik avvikelse även information som är viktig för att bestämma kvaliteten på strålningen absorberas 17, 18. Cytogenetisk studie ger en direkt bild av iÖLJDER av skadliga agenter på DNA. Detta är i motsats till indirekta tekniker för såsom kometanalysen. Emellertid har cytogenetisk studie varit underutnyttjad på områden utanför strålning, delvis på grund av de många praktiska stegen.
Även exponering för organiskt kol som finns i PM är känt för att påverka vår hälsa, få studier rapporterar biologiska effekter inkluderar deras sammansättning 9. Detta beror på att de kostsamma och besvärliga kromatografiska metoder som kräver arbetsintensiv utvinning, bearbetning, koncentrationer och derivatisering protokoll, medan de bara ge insikter för en liten del av en mycket specifik typ av föreningar varje gång. Dessutom protokollen resultera i väsentlig modifiering eller förstörelse av det ursprungliga provet, sålunda, kan inte utföras ytterligare testning. Fördelar med kärnmagnetisk resonans (NMR) analys innefattar att NMR är en icke-destruktiv metod; det kräver ett mycket begränsat antal steps (utvinning, koncentrering) före analys, och högfrekventa NMR instrument (från 400 MHz till 900 MHz) finns i många, om inte alla, universitet inom kärnanläggningen. En omfattande genomgång av atmosfärisk aerosol NMR-studier har nyligen publicerats 19. Slutligen, på grund av dess förmåga att ge strukturell information och bindningar mellan grupper är NMR överlägsen andra spektrometriska metoder såsom FT-IR, UV-Vis, och Raman-spektrometri som bara tillhandahåller data om den typ av funktionella grupper. Om så behövs, kan utföras morfologisk karakterisering av PM i tillägg till NMR-spektrometri med användning av svepelektronmikroskopi.
Även från en enda plats, sammansättningen av PM uppsamlas kan variera beroende på vilken tid på året. En tillräckligt stor mängd av material skall bearbetas och hölls vid -80 ° C för upprepade experiment eller kompletterande analyser. Steg 2.1.1 till 3.1.3 ska utföras aseptiskt i en biosäkerhets skåp. Om kontaminering eller nedsatt cellulär morfologi observeras, inte gå vidare med resten av protokollet. Trypsin behandlingstiden måste justeras baserat på celltyp. Här, makrofager är mycket vidhäftande och vi har funnit att en kombination av 1 min trypsin och skrapning fungerar bäst, men trypsin ensamt under 5 min gäller i de flesta celltyper. Hypoton behandling varierar också beroende på celltyp och måste standardiseras. Dosen och behandlingstiden av kolcemid är de viktigaste parametrarna för kromosom preparat; en över-dos kan döda cellerna eller stall i cellcykeln. Vi beskriver här villkor för RAW264.7-celler, och optimering krävs för andra celltyper. Underlåtenhet att hitta idealiska förhållanden i det här steget kan påverka mitotiska indexet samt kromosom morfologi, som påverkar resultatet. Det rekommenderas också att bedöma cytotoxicitet av PM före cytogenetisk analys och välj doserna därefter.
in vitro toxikologiska bedömningar begränsas av den typ av använda celler, exponering storlek och partikelkoncentrationer. Vidare i denna studie, utnyttjade vi den vattenlösliga extrakt av PM och kan därför potential vattenolösliga arter orsaka cytogenetiska avvikelser inte redovisas. Andra begränsningar är förknippade med förekomsten av "polymorfa varianter" - variationer i centro regioner och korta armar kromosom; några submikroskopiska eller kryptiska omlagringar som kan misstolkas och närvaron av komplexa karyotyper.
Här visar vi att införandet av cytogenetisk analys kan hjälpa till vid identifieringen av PM-inducerad skada på DNA och kan potentiellt fungera som en prediktiv slutpunkt i bedömningen av hälsoeffekter orsakade av exponering för omgivnings PM. Vår studie är, så vitt vi vet, den första för att ange CA som svar på PM. Replikation av dessa resultat ärönskvärt att bekräfta våra resultat. Detta protokoll kan också anpassas för att bedöma nästan alla typer av misstänkt DNA-skadande medel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Arbetet stöddes delvis av National Institute of Health Center of Biological Research Excellence [licensnummer 1P20GM109005], Arkansas Space Grant Consortium genom National Aeronautics and Space Administration [licensnummer NNX15AK32A], och det nationella institutet för arbetarskydd och hälsa (NIOSH) [licensnummer 2T420H008436]. Författarna vill tacka Christopher Fettes för korrekturläsning och redigera detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , Springer. 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
