Summary
Bu protokol ortam havası partiküler madde ile tedaviden sonra RAW264.7 fare makrofajlar in vitro ölçümü ve kromozomal anomaliler karakterizasyonu için teknikleri açıklar.
Abstract
partiküler madde (PM) maruz kalma nükleer genetik materyalin dahil olmak üzere çeşitli hücresel bileşenleri, zarar verebilir önemli bir dünya sağlık sorunu vardır. Nükleer genetik bütünlüğü üzerindeki PM etkisini değerlendirmek için, yapısal kromozom bozuklukları fare RAW264.7 makrofaj hücrelerinin metafaz mamulünün puanlanır. PM yüksek hacimli toplam askıda partiküller örnekleyici ile ortam havasından toplanır. Toplanan malzeme çözünebilir ve suda çözünür ince kısmı tutmak için filtre edilir. partiküller, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ile kimyasal bileşim açısından karakterize edilir. Parçacık süspansiyonu farklı konsantrasyonları muamele edilmemiş kontrol hücreleri ile birlikte, 72 saatlik bir toplam maruz kalma süresi için RAW264.7 fare makrofaj bir in vitro kültürü üzerine ilave edilir. Temas süresi sonunda, kültür metafaz hücreleri yakalama colcemid ile işlenir. Daha sonra hücreler toplandı, acetomethanol sabit hipotonik çözelti, D ile muamele edilirCam slaytlar üzerine ropped ve son olarak Giemsa çözeltisi ile boyandı. Slaytlar parlak alan mikroskobu kullanılarak 1,000X büyütmede metafaz yayılır yapısal kromozom sapmaları (CA) değerlendirmek için incelenir. 50 ila 100 metafaz yayılımı, her tedavi grubu için puan verilir. Bu teknik kromatid tipi tatili, chromatid tipi alışverişi, acentric parçaları, disentrik ve halka kromozomlar, çift dakika endoreduplication ve PM maruz kaldıktan sonra in vitro Robertsonian translokasyonları gibi yapısal kromozomal anomaliler (CA), tespiti için uyarlanmıştır. Epigenetik değişikliklere köklü bir sitogenetik uç noktasını ilişkilendirmek için güçlü bir yöntemdir.
Introduction
Partikül madde (PM) maruz kalma öncelikle kardiyopulmoner hastalığı ve akciğer kanseri 1 yılda 3 milyondan fazla aşırı ölümlere neden olması tahmin edilmektedir. PM maruz kalma seviyeleri arttıkça akciğer kanseri riski 2 gösterilmiştir Nitekim, PM, Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (Grup 1) ile insanlarda kansere olarak tanındı. İlginç bir şekilde, hemen hemen tüm kanser hücrelerinin sayısal ve / veya yapısal kromozom anomalileri liman. Partikül organik karbon, terkibi ve boyut dağılımı emisyonları ve fiziksel ve kimyasal dönüşümler bağlı olan bir varyantı, karmaşık ve heterojen karışım vardır. Bu 35-55 (boyutunda PM 2.5 mikron ve daha küçük) kentsel PM 2.5 kütlesinin% kırsal ve kıta arka plan PM 2.5 kütle 3, 4 den fazla% 60 oluşturmaktadır. suda çözünen fraksiyon organik aerosol 30-90% oluşturmaktadır. Organik bileşiklerin büyük bir kısmıalifatik hidrokarbonlar, poliaromatik hidrokarbonlar ve bunların oksijenli nitratlı türevlerini, alifatik aldehitler ve alkoller, serbest yağ asitleri ve bunların tuzları, di-karboksilik asitler, çok fonksiyonlu bileşikler, proteinler, ve hümik benzeri makromoleküller (HULIS) kullanılması dahil olmak üzere tespit edilmiştir kütle spektrometrik teknikleri 5-8 ile birleştiğinde kromatografik yöntemler. Bu nedenle bu bileşikler, organik karbonun çoğu 9 bilinmemektedir, parçacık halinde organik karbon az% 10-20 temsil etmektedir.
Deneysel kanıtlar, sitotoksisite, oksidatif stres ve enflamasyon PM ile ilişkili patolojik durumların gelişiminde rol oynadığını düşündürmektedir. Yakın zamanda, bununla birlikte, PM bu maruz kalma da in vitro sistemlerinde, insan konularında 10-12 hem de deneysel olarak, tekrar eden elemanların, DNA metilasyon değişiklikler de dahil olmak üzere epigenetik değişiklikler, bir dizi ile sonuçlanır gösterilmiştir. Özel ilgi konusu olan etkileri vardırMajör ve minör uydular - - kromozomların sentromer etrafında heterokromatik bölgesinde bulunan uydu DNA PM. Onlar maruz 12. sonra en az 72 saat süreyle tespit edilebilir olarak bu etkiler, doğası gereği kalıcı olabileceğini gösterilmiştir. Özellikle sentromer yaklaşık DNA metilasyonu değişiklikler, hücre bölünmesi esnasında, uydu, DNA mRNA transkript, bir uzlaşma kromozom bütünlük birikimine yol açabilir ve daha sonra, patolojik durumların 13 çeşitli oluşmasına da neden olabilir.
PM bağlı epigenetik değişiklikler bir son nokta olarak bir CA analizi için sitogenetik yaklaşım adaptasyonu, bu şekilde, yüksek bir öneme sahiptir. Burada, fare makrofaj RAW264.7 modeli sistemini kullanarak CA'ların in vitro maruziyet ve analiz ortam PM toplama ve hazırlama yaklaşımı, rapor. Makrofajlar t nedenle, inhale yabancı nesnelere karşı ilk savunma hattını oluşturan veCep hattı kurulmuş ve partikül toksikoloji 11, 12, 14, 15, en sık kullanılan bir model olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Parçacık Toplama ve Hazırlama
- Yüksek hacimli toplam asılı parçacıklar örnekleyici kalibrasyonu
- Kütle akış kontrol cihazından örnekleyici motoru kesin ve kararlı bir AC güç kaynağına (Şekil 1) motoru bağlayın.
NOT: Bir filtre, bu işlem sırasında kullanılmaz. - örnekleyici kalibratör deliğini ve üstten yüklemeli adaptör plakasını monte edin. Hiçbir hava kaçağı mevcut olduğundan emin olmak için güvenli üstten yüklemeli adaptörü tutma somunlarını sıkın. örnekleyici motoru normal çalışma sıcaklığına (yaklaşık 10-15 dakika) kadar ısınmasını bekleyin.
- elleriyle ağzına ağız ve basınç musluğu üstündeki delikleri kapatarak bir sızıntı testi yapıyoruz. havayı kaçan tarafından yapılan bir tiz squealing sesi dinleyin. Bu ses duyulur bir kaçak söz konusu olduğu gibi, üstten yüklemeli adaptör tutma somunları yeniden sıkın. Ses düşükse, kaçak sys diğer contalar birine yakın olduğutem.
- Bir lastik vakum tüpü ile deliğin tarafındaki basınç musluğa su manometre bir tarafını bağlayın. atmosfere açık manometre karşı tarafını bırakın. doğru okuma sağlamak için dikey bir manometre tutun. sürekli akış kaydedici ters dokunulduğunda kalem ortalamak ve doğru okumalarını sağlamak için yardımcı olacaktır.
- Adımı tekrarlayın / dk (yaklaşık olarak her 5-6 ft 3 / dak) 30 ila 60 ft faaliyet akış hızlarının temsil eden beş akış oranları kullanılarak 1.1.2. Beş farklı pozisyonlarda değişken ağzına düğmeyi ayarlayın ve beş farklı okumalara alır.
- sertifikalı son tarih, tarih, site konumu ve kalibrasyon kağıda operatör baş harfleri ile ortam hava sıcaklığı, ortam barometrik basınç, örnekleyici seri numarası, delik seri numarası, delik eğimi ve kesişme kaydedin.
- Kütle akış kontrol cihazından örnekleyici motoru kesin ve kararlı bir AC güç kaynağına (Şekil 1) motoru bağlayın.
- Toplam askıda partiküller numune toplama ve gravimetrik analiz
- Wrap birAlüminyum folyo iki kat 8 "x 10" kuvars elyaf filtre. fırında sarılmış filtreyi yerleştirin ve 550 ° C'de sıcaklığını ayarlamak. en az 4 saat süreyle filtreyi pişirin. fırın soğuması ve filtreyi almak. CaCO 3 desikatörde filtre yerleştirin.
- 10 ug hassasiyetle bir mikro filtreyi tartılır. Bir gün boyunca ölçüm üç kez tekrarlayın. Bireysel ölçümler 25 mikrogram içinde olmalıdır. Bu elde değilse, desikatöre sarılmış filtreyi dönmek ve işlemini ertesi gün tekrarlayın.
- Barınak kapağı (Şekil 2) açın. Dört kanat fındık gevşeterek pirinç civatalar ve contalar dışına aşağı salıncak izin vererek filtre tutucu çerçeveyi çıkarın. destekleyen ekranda, kaba yüzü yukarı, alüminyum folyo filtreyi açılmak ve dikkatle ortalamak için temizlenmiş forseps kullanabilir. Düzgün ekranda filtreyi hizalayın.
- Ekranda çerçevesini yerleştirin ve sabitleyinyeterli basınç uygularken pirinç civatalar ve contalar kenarlarında hava sızıntısını önlemek için. temiz bir bezle filtre tutucu etrafında herhangi bir toz birikmesini silin. Yakın barınak kapağı dikkatli ve emniyete alın.
- emin olun tüm kabloları bunların uygun priz yuvalarına takılı ve fan motoru basınç musluğu ve sürekli akış kaydedici arasında boru bağlanır.
- Akış kaydedici hazırlayın. kalem noktasını yükseltmek ve yeni bir grafik eklemek için kalem kol kaldırıcı basınız. kaydedici sürücü göbeğine grafiğin sekmeyi hizalayın ve göbek üzerine grafik merkezini düşürmek için başparmak ile bastırın. grafikte doğru zaman zaman indeksi işaretçisi ile aynı hizaya gelene kadar sürücü hub saat yönünde çevirerek saati ayarlayın.
- El ile örnekleyici açmak ve toplama başlar. doğru mürekkep ve geçen süre göstergesi düzgün çalıştığından emin olmak için emin olmak için kaydedici izleyin.
- Örnekleme döneminin sonunda, örnekleyici, kayıt kapatmakgeçen süre ve grafik almak. Filtreyi ortaya çıkarmak için çerçeveyi çıkarın. forseps ile uçlarında hafifçe tutarak destek ekrandan maruz filtreyi kaldırmak. Bu örnek iki örnek dokunur, böylece uzunlamasına filtreyi katlayın ve orijinal alüminyum folyoya sarın.
- Tartılmadan önce en az 24 saat boyunca CaCO 3 bir kurutucuda filtre saklayın. Adımı tekrarlayın 1.2.2 örnekleme sonra filtrelerin ağırlığını ölçmek için. zip plastik bir torba içinde filtreyi yerleştirin ve analize kadar -80 ° C saklayın.
- Toplanan toplam askıda partiküller numunenin analizi
- Saklanan filtre Al alüminyum folyo açılmak ve temiz bir teflon yüzeyi üzerinde filtre aktarın. forseps ve neşter kullanılarak, filtrenin dış (beyaz) bir bölümünü kesmek ve atınız.
- Daha sonra, 100 ml'lik bir şişe içinde 0.5 "x 0.5" parçaları ve yeri parçaları filtre kesin. ultra saf su 50 ml ekleyin. Bir ultrason şişeyi koyunbanyo ve 33 ± 3 kHz 60 dakika sonikasyon.
- 100 ml'lik bir yuvarlak tabanlı şişe için 0.45 um polipropilen şırınga filtre ile filtre özü. ekstresi, yaklaşık 5 ml kadar 50 ° C'de basınç altında rotavap aleti kullanarak suyu buharlaştırmak şişede kalmaktadır.
- ağırlığı bilinen bir 15 ml armut şekilli bir şişeyi, kalan su buharlaşır. Kuru ekstre ile balon tartılır ve kuru özüt kütlesini kaydedin.
- 15 dakika boyunca sonike ile D 2 O 400 ul kuru örnek çözülür ve 5 mm standart NMR tüpü içine aktarın. çözünmemiş maddeleri uzaklaştırmak üzere oda sıcaklığında 12.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj.
- O. NaN 3% 1.4 10 ul (son kons .:% 0.02 w / v) NMR tüpü içinde ekleme D2 300 ul ile tekrarlayın. NMR tüpü içinde D 2 O (nihai konsantrasyon 0.258 mM) toplam asılı parçacıklar (TSP)-d4 (3.2 mg / ml) 10 ul (32 ug) ekleyin.
- 600,17 MHz'de çalışan bir NMR spektrometresi kullanılarak 1H NMR spektrumları elde edin.
- üçlü rezonans kriyoprob içine NMR tüpü yerleştirin. aşağıdaki sırayla enstrüman kalibre: kilidi, melodi, dolgu, 90 ° darbe uzunluğu kalibrasyon ve alıcı kazanç ayarı.
- Dijital Dört algılama modunda 180 suda seçici pulsları, 8.192 taramaları 4 yapay taramaları, 8012,57 Hz tarama genişliği ile bir 1 D uyarım şekillendirici sekansı ile 25 ° C 'de spektrumunu ölçmek, frekans 4.70 ppm'de ayarlanmıştır su sinyal bastırılması, 1.70 için ofset sn kazanım süresi, 32.768 time domain veri noktaları (TD), 1 msn süre gradyan (p16), gradyan (D16) sonra 100 mikro-sn kurtarma gecikme.
- Proses 1 2 (65,536 veri noktaları) içindeki bir faktör ile, 1 Hz ve sıfır dolgulu bir hat genişletmesi uygulanarak NMR spektrumları. elle faz ve taban çizgisini düzeltin ve entegre. 0.0 ppm TSP-d4 zirve ayarlayın.
- Saklanan filtre Al alüminyum folyo açılmak ve temiz bir teflon yüzeyi üzerinde filtre aktarın. forseps ve neşter kullanılarak, filtrenin dış (beyaz) bir bölümünü kesmek ve atınız.
2. Parçacık Pozlama
- Kültür kurmak
- (37 ° C'de),% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin-streptomisin çözeltisi (100 U / ml),% 0.25 tripsin solüsyonu ve kalsiyum, magnezyum içermeyen fosfat tamponu tuz, bir su banyosu içinde (PBS) ihtiva eden sıcak bir tam büyüme ortamı için kültür başlamadan önce en az 30 dakika.
- Kültürlenmiş RAW264.7 hücreleri ihtiva eden bir% 5 CO2 inkübatör T75 şişesi çıkarın ve önceden ısıtılmış PBS ile iki kez 2 ml hücreleri yıkayın.
- kazınarak ardından önceden ısıtılmış tripsin çözeltisi 1 ml kullanılarak doku kültürü kabının altından yapışkan RAW264.7 hücreleri çıkarmak.
- Doku kültürü kabı hücreleri toplamak ve tekrar pipetleme ile tek bir hücre süspansiyonu yapmak. Önceden ısıtılmış tam ortam maddesi ile 100 mm doku kültürü çanağı içinde 8.000 N / cm2 (toplam 500.000 hücre) bir yoğunlukta tripan mavi ve plaka hücre sayısı. 50,000 hücrelik nihai konsantrasyonda 10 ml'lik Ortam ses seviyesini ayarlamaml başına.
NOT: DNA metilasyonu analizi de yapılır eğer plakaların sayısını ikiye katlayın. - 37 ° C de geri CO2 inkübatör% 5 yeni kaplama RAW264.7 hücreleri yerleştirin ve 24 saat boyunca eklemesini sağlar.
- Ayrıca biyogüvenlik kabini, süzülmüş parçacıkların tekrar süspansiyon. Örneğin, bir 5 ug / ml bir tedavi dozu için steril PBS içinde 0.5 mg / ml'lik bir konsantrasyonda parçacıkları seyreltilmesi ve 5 mg / 50 ug / ml bir tedavi dozu için ml'de. Dilüsyonlar önceden aya kadar hazırlanır ve -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Parçacık madde ile muamele
- % 5 CO 2 inkübatör hücreleri almak ve hücre büyümesi, hücre morfolojisi, kültür durumuna ve kirlenme ters bir mikroskop kullanılarak 10x büyütme altında kontrol edin. Bir bu aşamada en az% 30 konfluent hücrelere sahip beklemesin.
- Aseptik, sterilize pipet kullanarak medya aspire ve 2 ml 37 ° C PBS ile kültür damarı yıkayınİki kez tamamen medya ve yüzen veya ölü hücreleri çıkarmak için.
- Kültür damarlarda taze ortam parçacıklı maddenin önceden belirlenmiş doz ekleyin ve CO2 inkübatör% 5 37 ° C'de, istenen bir süre için inkübe edilir. Bu çalışmada, eş zamanlı genotoksik ve epigenotoxic analiz için kullanılan pozlama paralel 72 saat PM ile RAW264.7 hücreleri tedavi.
NOT: Sitotoksisite olumsuz sitogenetik analiz kalitesini etkileyebilir. Bu nedenle, sitotoksisite, DNA metilasyonu, Western blotting ya da gen ekspresyon analizi gibi ek deneyler tipik haliyle muamele edilmiş hücreler üzerinde gerçekleştirilmiştir. tarif edildiği gibi hücreler ortaya çıkarmak ve istenen spesifik deney devam edin. Deneyimsiz kullanıcılar, aynı zamanda CA'larını tespit yeteneklerini test etmek için metil metansülfonat gibi bir pozitif kontrol eklemek isteyebilirsiniz.
3. Sitogenetik Testi
- Tedavi metafaz hücrelerin tutuklamak için
- böylece colcemid ısıtındökülmesinden 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde (10 ug / ml). kontaminasyon riskini en aza indirmek için bir biyogüvenlik kabini altında% 70 alkol ile silin kapağı
- Tamamen aseptik ortamı çıkarın ve 2 ml önceden ısıtılmış PBS ile iki kez kültür damarları yıkayın.
- Önceden ısıtılmış taze ortam (2 mi ortam / 10 6 hücre), kültür kabı içinde colcemid çözeltisi (5 ul / ml) ihtiva eden ve 2 saat süreyle inkübe edin.
- hücre hasat
- bir su banyosunda ılık bir tripsin çözeltisi ve PBS, 30 dakika boyunca 37 ° C'de tutuldu. Bundan böyle aşağıda aşama aseptik durumunu korumak için herhangi bir gerek yoktur.
- Tamamen iki kez 2 ml 37 ° C PBS ile kültür damarları, yıkama ortamı çıkarın önceden ısıtılmış tripsin çözeltisinin gerekli hacim eklemek (genellikle 60 mm kültür çanağı veya T25 şişesi 2 ml ve 100 mm tabak veya T75 şişesinin 4 mi ) ve 1 dakika için 37 ° C 'de geri CO2 inkübatör% 5 kültür kabını yerleştirin.
- Take dışarı kültür damarı, bir kazıyıcı kullanarak hücreleri ayırmak ve tripsin eylemi durdurmak için PBS 10 ml ekleyin.
- Pipet yukarı ve aşağı, en az on kez 15 ml konik alt santrifüj tüpü içinde tek bir hücre süspansiyonu ve transfer hücreleri yapmak.
- Oda sıcaklığında katlanırlar santrifüj içinde 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje hücre süspansiyonu.
- Süpernatantı nazik dokunarak hücre pelet kırmak, PBS 10 ml ekleyin ve tekrar beş dakika süreyle santrifüj.
- Hipotonik tedavi ve sabitleme
- en az 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak 0.075 M potasyum klorür çözeltisi.
- Hücre pelet bozmadan Süpernatantı ve PBS yaklaşık 0,5 ml bırakın.
- Yavaşça hücre pelet kırmak ve bir P200 pipet kullanarak tek bir hücre süspansiyonu yapmak.
- hafifçe çalkalanarak damla önceden ısıtılmış potasyum klorür solüsyonu damla 4 ml.
- hipotonik p hücreleri inkübe20 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde otassium klorür çözeltisi.
- 1-kısım buzlu asetik asit ile 3 parça metanol ilave taze acetomethanol çözeltisi olun. Oda sıcaklığında, bu yeni hazırlanmış fiksatif tutun.
- hipotonik tedaviden sonra, tüp içinde sabitleyici eşit hacimde (4 mi) ekleme ve tüp hafifçe ters çevirerek çözelti karıştırılır.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj ve supernatant çıkarın. Bu aşamada hücre pelet boyutu artar, beyazımsı ve daha görünür hale gelir.
- Süpernatantı, 4 ml taze fiksatif ilave edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında tutulması.
- 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj, süpernatant kaldırmak ve 4 ml fiksatif ile iki yıkar verir.
- Slayt temizleme ve metafaz yayılması hazırlığı
- 30 dakika boyunca tamamen% 10 sıvı deterjan, cam slaytlar daldırın.
- 30 dakika süre ile akan soğuk musluk suyunda iyice slaytlar durulayın.
- rinSE tamamen deterjanı çıkarmak damıtılmış suya batırın ve ileride kullanılmak üzere buzdolabında depolamak için damıtılmış su ile üç kez kaymaktadır.
NOT: kullanım yayılma tekdüzelik kolaylaştırır ve metafaz kalitesini artırır önce slaytlar temizlenmesi. - soğutulmuş, ıslak slayt üzerinde 10 ul hücre süspansiyonu damla ve oda sıcaklığında gece boyunca kurumaya hava sağlar.
- Boyama montaj
- PBS bir kısım Giemsa boyası çözeltisinin bir bölümü karıştırılarak 50 mi Giemsa boyama çözeltisi hazırlayın ve Coplin kavanoza ilave edin.
- 20 dakika boyunca boyama çözeltisi slaytlar daldırın.
- Bir saç kurutma makinesi kullanarak slaytları fazla leke çıkarmak ve hemen kurumaya distile su slaytlar durulayın.
- gece boyunca, oda sıcaklığında slaytlar bırakın.
- slaytta montaj orta tek bir damla uygulayın, nazikçe, montaj ortamında bir lamel yerleştirin orta yavaş yavaş slayt yayılmış izin ve kaldırmakBir kağıt havlu ile fazla orta. monte slayt önce hareketli veya lamel hareketini önlemek için bir mikroskop altında inceleyen en az 1 saat kurumasını bekleyin.
Dikkat: Bu adımda sırasında herhangi bir baloncukları oluşturmadan dikkatle lamel yerleştirilmesi önemlidir. kabarcıklarını çıkarmak için aşırı ısı kullanımı tavsiye edilmez.
- Mikroskobik gözlem ve sapmaları türleri
- metafaz iyi kalitede parlak alan mikroskobu kullanarak 100X büyütmede yayılır yapısal CA'larını inceleyin.
- 100 metafaz CA'larının sayıda neden tedaviler için, her tedavi grubu için yayılır en az 50 puan. Daha küçük etki boyutları için, 300 metafaz yayılır analizi tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Büyük bakım TSP numune yerini yanı sıra koleksiyon yapılır yılın zaman seçiminde dikkatli olunmalıdır. Kimyasal bileşim, aynı zamanda parçacıkların boyutu esas olarak sonuçlarını etkileyebilir. Toplanan malzeme beyaz filtre karşı görünür olmalıdır. Normal bir fare metafaz yayılması 40 acentric kromozom vardır. tekniğin amacı kontrol grubuna göre muamele edilen hücrelerde anormal kromozom oranında bir değişim (ya da bunun olmayan) göstermektir. Bu değişiklik daha sonra (anormal kromozomların sayısı) ve nitelikli (anormalliklerin tipi) belirlenebilir.
Normal fare metafaz yayılması 40 acentric kromozom (Şekil 3A) sahip olacaktır. Partikül madde ile tedavi gibi kromatid sonu olarak, Şekil 3'te gösterildiği gibi, gibi CAS, (3B), asentrik fragmanını (indükler
Şekil 1. yüksek hacimli toplam askıda partiküller (TSP) örnekleyici. resim ortam parçacıkları toplamak için bir kentsel alanda bir çatı yüklü TSP Örnekleyiciye gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yüksek hacimli TSP s kullanarak Şekil 2. Loaded kuvars elyaf filtre aşağıdaki koleksiyonampler. Kullandıktan sonra TSP örnekleyici yüklü filtre üzerinde Close-up. Filtreleri rengi beyazdan griye doğru değiştirilir unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Parçacık halinde maddenin farklı konsantrasyonları ile muamele sonrasında RAW264.7 hücrelerinin oluşturduğu yapısal anormalliklerin farklı türde temsili örnekleri Şekil 3. Photomicrograph. anormallikler oklar ile belirtilmiştir. (A) 40 akrosentrik kromozomlar normal metafaz yayılması, (B) chromatid-tipi sonu (CTB), (C) acentric fragmanı (acentrics), (D) halka kromozom, (E) disentrik kromozom (Dic), (F) çift dak (Dimn), (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sitogenetik çalışma veya numaraları veya öncelikle metafaz yayılır kromozom, yapılarının mikroskobik analizi, çeşitli hastalıklar için prognoz, risk değerlendirmesi ve tedavisi için önemli bilgiler sağlar. Şimdi sitogenetik anormallikler kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların ilerlemesi ve gelişimi ile bağlantılı olduğu iyi bilinmektedir. Bugüne kadar, CA tüm ana tümör tiplerinde olduğu bulunmuştur. Sitogenetik değişikler 16 çeşitli uyarabilir önemli dış risk faktörlerinden biri - CA kendiliğinden ya da radyasyon (IR) iyonize olarak ya içsel veya dışsal uyaranlara ile ortaya çıkabilir. absorbe radyasyon dozunun değerlendirilmesinde CA yardımların Analizi (sitogenetik radyasyon biodosimetry denir). Ayrıca, frekans ve belirli bir sapma türü analizi radyasyon kalitesinin saptanması için önemli bilgileri 17, 18 emilmek içerir. Sitogenetik çalışma i doğrudan görüntü sağlarDNA hasar verici maddelerinin MPACT. Bu, kuyruklu deneyi gibi dolaylı teknikleri tersidir. radyasyon dışındaki alanlarda kullanılan altında Ancak sitogenetik çalışma kısmen pek çok eller alan adımları olmuştur.
PM organik karbon günümüze kadar maruz sağlığımızı olumsuz etkilediği bilinmesine rağmen, biyolojik etkilere bildiren az sayıda çalışma kendi kompozisyon 9 içerir. onlar sadece bileşiklerin çok özel bir tip her zaman küçük bir alt kümesi için anlayış sağlamak ise bu, emek-yoğun çıkarma, işleme, konsantrasyonlarını ve türetme protokolleri gerektiren masraflı ve külfetli kromatografik yöntemlerle kaynaklanmaktadır. Ayrıca, protokoller önemli manipülasyon veya orijinal numune imha, böylece ek testler yapılamaz sonuçlanır. nükleer manyetik rezonans (NMR) analizi avantajları NMR tahribatsız bir yöntem olduğunu içerir; bu ste çok sınırlı sayıda gerektirirps (ekstraksiyon, konsantrasyon) analizden önce, ve yüksek frekanslı NMR aletleri (900 MHz, 400 MHz), çekirdek tesis içinde üniversiteler hepsi değilse de, birçok mevcuttur. Atmosferik aerosol NMR çalışmaları kapsamlı bir inceleme geçtiğimiz günlerde 19 yayımlanmıştır. Son olarak, yapısal bilgi ve gruplar arasındaki bağlar sağlayacak kabiliyeti nedeniyle, NMR yalnızca işlevsel grupların türü hakkında veri sağlar, FT-IR, UV-Vis ve Raman spektrometresi gibi spektrometrik yöntemlere göre daha üstündür. Gerekirse, PM morfolojik karakterizasyonu taramalı elektron mikroskobu kullanılarak NMR spektrometresi ilave olarak gerçekleştirilebilir.
Hatta tek bir yerden, PM bileşimi yılın zamanına bağlı olarak değişebilir topladı. bir malzeme, yeterince büyük miktarda işlenerek tekrar deneyinin ya da tamamlayıcı deneyler için -80 ° C'de saklanmalıdır. 3.1.3 ile 2.1.1 bios aseptik yapılmalıdır adımlarEC Güvenlik kabine. kirlenme veya tehlikeye hücresel morfoloji görülürse, protokolün geri kalanı ile devam etmeyin. Tripsin tedavi süresi hücre türüne göre ayarlanması gerekiyor. Burada, makrofajlar çok yapışık ve biz 1 dakika tripsin ve kazıma bir arada en iyi şekilde çalışır bulundu, ancak çoğu hücre tipleri için 5 dakika işler için yalnız tripsin var. Hipotonik tedavi süresi de hücre tipine bağlı olarak değişir ve standardize edilmesi gerekmektedir. colcemid dozu ve tedavi süresi kromozom hazırlanması için en önemli parametreler; aşırı doz hücrelerini öldürmek veya hücre döngüsünü durak olabilir. Bu RAW264.7 hücreleri burada koşullarını tarif ve optimizasyonu, diğer hücre tipleri için gereklidir. Başarısızlık sonuçlarını etkileyen ideal bir olumsuz mitotik indeksi etkileyebilir Bu adımda koşullarının yanı sıra kromozom morfolojisi, bulmak için. Aynı zamanda öncesinde sitogenetik analiz PM sitotoksisite düzeylerini değerlendirmek ve buna göre doz seçilmesi tavsiye edilir.
in vitro olarak toksikolojik değerlendirmeler kullanılan hücrelerin, pozlama büyüklüğü ve partikül konsantrasyonlarının tipi ile sınırlıdır. Bundan başka, bu çalışmada, bu nedenle, sitogenetik anormallikleri neden suda çözünür olmayan türleri, potansiyel hesaba olabilir, PM suda çözünür özü kullanılabilir ve. Diğer sınırlamalar "polimorfik varyantları" varlığı ile ilişkilidir - sentromerik bölge ve kromozomun kısa kol varyasyonlar; Bazı mikroskopik veya yanlış olabilir şifreli düzenlenmeler ve karmaşık karyotiplerin varlığı.
Burada, sitogenetik analiz tanıtımı DNA PM kaynaklı hasar belirlenmesinde yardımcı olabilir ve potansiyel çevre PM maruz kalmanın yol açtığı sağlık etkilerinin değerlendirilmesi bir öngörü son nokta olarak hizmet edebilir göstermektedir. Çalışmamız Bildiğimiz kadarıyla, PM cevaben CA'ları göstermek için ilk biri vardır. Bu sonuçların çoğaltma olduğunuBizim bulguları doğrulamak için arzu. Bu protokol, aynı zamanda şüpheli, DNA hasar verici maddenin hemen hemen her tür değerlendirmek için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
iş Biyolojik Araştırma Mükemmellik [hibe sayısı 1P20GM109005], Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi [hibe sayısı NNX15AK32A] aracılığıyla Arkansas Uzay Grant Konsorsiyumu Sağlığı Merkezi Ulusal Enstitüsü ve İş Güvenliği Ulusal Enstitüsü tarafından, kısmen, desteklenen Sağlık (NIOSH) [hibe sayısı 2T420H008436]. Yazarlar redaksiyon ve bu taslağın düzenlenmesi için Christopher Fettes teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Total suspended particulate sampler | Tisch Environmental | TE-5170 | |
| Bruker Avance III NMR spectrometer | Bruker | NA | |
| TopSpin 3.5/pl2 software | Bruker | NA | |
| ACD/NMR Processor Academic Edition | ACD/Labs | NA | |
| RAW264.7 murine macrophages | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| High glucose DMEM GlutaMAX media | ThermoFisher | 10569010 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 16000044 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | ThermoFisher | 15140163 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010049 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Colcemid Solution in PBS | ThermoFisher | 15212012 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| KaryoMAX Potassium Chloride Solution | ThermoFisher | 10575090 | Warm in a 37 °C waterbath before use |
| Methanol (HPLC) | Fisher Scientific | A452N1-19 | |
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Scientific | BP1185-500 | |
| Decon Contrad 70 Liquid Detergent | Fisher Scientific | 04-355-1 | |
| Wright and Wright-Giemsa Stain Solutions | Fisher Scientific | 23-200733 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | NA |
References
- Lim, S. S., et al. A comparative risk assessment of burden of disease and injury attributable to 67 risk factors and risk factor clusters in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380, 2224-2260 (2012).
- IARC: Outdoor air pollution a leading environmental cause of cancer deaths. , IARC. Press Release 10-17-2013 (2013).
- Putaud, J., et al. A European aerosol phenomenology-2: chemical characteristics of particulate matter at kerbside, urban, rural and background sites in Europe. Atmos. Environ. 38 (16), 2579-2595 (2004).
- Hand, J., Schichtel, B., Pitchford, M., Malm, W., Frank, N. Seasonal composition of remote and urban fine particulate matter in the United States. J Geophys Res-Atmos. 117 (5), (2012).
- Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos. Environ. 30 (22), 3837-3855 (1996).
- Simoneit, B. R. A review of biomarker compounds as source indicators and tracers for air pollution. Environ. Sci. Pollut. Res. 6 (3), 159-169 (1999).
- Kavouras, I. G., Stephanou, E. G. Particle size distribution of organic primary and secondary aerosol constituents in urban, background marine, and forest atmosphere. J Geophys Res-Atmos. 107 (8), (2002).
- Graber, E., Rudich, Y. Atmospheric HULIS: How humic-like are they? A comprehensive and critical review. Atmos. Chem. Phys. 6 (3), 729-753 (2006).
- Pöschl, U., et al. Atmospheric aerosols: composition, transformation, climate and health effects. Angew. Chem. Int. 44 (46), 7520-7540 (2005).
- Hou, L., et al. Altered methylation in tandem repeat element and elemental component levels in inhalable air particles. Environ. Mol. Mutagen. 55 (3), 256-265 (2014).
- Miousse, I. R., et al. Epigenetic alterations induced by ambient particulate matter in mouse macrophages. Environ. Mol. Mutagen. 55 (5), 428-435 (2014).
- Miousse, I. R., et al. In Vitro Toxicity and Epigenotoxicity of Different Types of Ambient Particulate Matter. Toxicol. Sci. 148 (2), 473-487 (2015).
- Ehrlich, M. Genomic instability in cancer development. Genome Instability in Cancer Development. , Springer. 363-392 (2005).
- Michael, S., Montag, M., Dott, W. Pro-inflammatory effects and oxidative stress in lung macrophages and epithelial cells induced by ambient particulate matter. Environ Pollut. 183, 19-29 (2013).
- Li, N., et al. Induction of heme oxygenase-1 expression in macrophages by diesel exhaust particle chemicals and quinones via the antioxidant-responsive element. J Immunol. 165 (6), 3393-3401 (2000).
- Pathak, R., Ramakumar, A., Subramanian, U., Prasanna, P. G. Differential radio-sensitivities of human chromosomes 1 and 2 in one donor in interphase- and metaphase-spreads after 60Co gamma-irradiation. BMC Med. Phys. 9, 6649 (2009).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Genotoxic effects in M5 cells and Chinese hamster V79 cells after exposure to 7 Li-beam (LET= 60keV/µm) and correlation of their survival dynamics to nuclear damages and cell death. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 628 (1), 56-66 (2007).
- Pathak, R., Dey, S. K., Sarma, A., Khuda-Bukhsh, A. R. Cell killing, nuclear damage and apoptosis in Chinese hamster V79 cells after irradiation with heavy-ion beams of 16 O, 12 C and 7 Li. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 632 (1), 58-68 (2007).
- Chalbot, M. C., Kavouras, I. G. Nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the functional content of organic aerosols: a review. Environ. Pollut. 191, 232-249 (2014).
