Summary
우리는 치수의 상처 치유 및 생체 수복 상아질 형성 평가 마우스 치아에 직접 캐핑 펄프를 행하는 단계적인 방법을 설명한다.
Protocol
마우스는 잭슨 연구소에서 구입하여 실험 동물 의학의 UCLA과 (DLAM)에서 병원균이없는 동식물 사육장에 보관 하였다. 실험은 교육감의 동물 연구위원회 (ARC 번호 2016-037)에서 승인 된 기관의 지침에 따라 수행 하였다.
1. 마우스 마취
- 8 주 된 암컷 C57 / BL6 마우스를 사용하여 (n = 3)를 나타낸다.
- 케타민 (마우스 체중의 80 ~ 120 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 밀리그램 / 마우스 체중 kg) 솔루션을 사용하여 마우스를 마취 및 10 ㎖ / kg의 용량으로 복강 내 (IP) 투여.
- 케타민 준비 (80-120 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏) 용액 및 10 ㎖ / kg의 용량으로 복강 내 (IP)을 투여.
- 쥐가 완전히 발가락 핀치를 수행하여 마취되어 있는지 확인합니다.
2. 펄프 캐핑 절차
- 마우스의 입에서 입 홀더를 배치합니다.
- 그는 그 같은 테이블에 입 홀더를 고정광고가 위쪽으로 직면하고있다.
- 첫 번째 상악 대구치가 완전히 볼 수 있도록 입의 상단에있는 현미경 (10X)를 놓습니다.
- 펄프 투명 상아질 통해 보일 때까지 20 rpm으로 고속 핸드 피스의 ¼ 라운드 버를 사용하여, 중간 치아의 에나멜 부분을 제거한다. 버와 펄프를 노출시키지 마십시오.
- A # 15 근관 K-파일 (150 μm의 직경)를 사용하여 상아질을 통해 천공 및 펄프를 노출합니다.
참고 : 상아질 파편이 펄프로 밀어되지 않도록 특별한주의가 요구됩니다. 이 분기마다 K 파일을 회전하고 출력이 K-파일 당겨 회피 할 수있다. - 제조업체의 지침에 따라 멸균 H 2 O와 MTA를 섞는다. 제공 및 탐색기의 끝 노출 된 펄프에 MTA에 배치합니다. 부드러운 감청에 의해 노출 된 펄프로 MTA를 포장하는 종이 포인트 (미세)의 뒷면을 사용합니다. 용지 점의 두꺼운 측이 평평하기 때문에 허용노출 된 펄프에 MTA의 적절한 응축.
- 단지 치아를 커버하는 35 % 인산 에칭액을 배치하여 15 초 동안 에칭 치아. 이 잇몸 조직을 자극 할 수 있으므로, 에칭의 배치를 제한하기 위해 특별한주의하십시오.
주 : 에칭액 주사기오고 치과 접착제 치아에 마이크로 기계식 결합을 매개하는 데에 흐를 수 있도록 치아 표면을 거칠게하는 데 사용된다. 그들은 점성 때문에 독립적 치아에 직접 적은 양을 적용함으로써 할 수있다. - 에칭 제를 제거하는 음의 압력을 흡입을 사용합니다. 가볍게 에칭의 잔류 물을 제거하기 위해 H 2 O에 배어있는 면봉을 사용합니다. 에칭이 완전히 치아에서 제거 될 때까지이 단계를 반복합니다.
- 압축 공기 살포기를 사용하여 부드럽게 치아를 건조.
- 용지 포인트의 뒷면을 사용하여 치과 용 접착제를 적용한다.
- 3 초 동안 압축 공기를 이용하여 상기 접착제 층이 얇게.
- 기음URE 경화 백라이트 유닛을 사용하여 20 초 동안 치과 용 접착제.
- MTA와 모자를 씌웠다 치아에 소량의 유동성 복합 놓습니다. 치아 홈에 복합 흐름에 탐색기의 팁을 사용합니다.
- 이를 중합 광 경화 유닛을 이용하여 30 초 동안 복합 치료. 복합 완전히 경화 하드 탐색기를 사용하고 있는지 확인합니다.
3. 수술 후 케어
- 즉시 펄프 캐핑 시술 후 카프로 펜 (5 ㎎ / ㎏) 피하 (SC)를 관리 할 수 있습니다.
- 그들이 일어나 전에 따뜻한 동물을 유지하기 위해 낮은 전력으로 가열 패드에서 마우스를 놓습니다.
- 주택의 동식물 사육장에 마우스를 돌려줍니다.
4. 조직 조달
- 오 후 - 육주, 이소 플루 란과 완벽한 마취 상태에서 자궁 전위에 의해 쥐를 안락사.
- 조심스럽게 두개골의 바닥에서 상악를 제거하고 50 mL의 관에 넣어. entir 수정밤새 39 ° C에서 펄프 캡핑 치아와 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드, pH가 7.4 반대측 캡핑 치아를 모두 포함하고, 그 다음 70 % 에탄올 용액에 보관 전자 상악.
참고 : 파라 포름 알데히드는 독성 및 발암 성이다. 표준 운영 절차 (SOP)에 설명 된대로 적절한 사용 파라 포름 알데히드를 모니터링해야한다. - μCT 검사를 사용하여 마우스 상악를 스캔합니다. 70 % 에탄올에 적신 거즈로 샘플을 포장하고, 15 mL의 세포 배양 튜브에 배치, 스캔하는 동안 상악을 확보합니다.
5. μCT 검색
- μCT 검사를위한 샘플을 준비합니다. 간단히, 70 % 에탄올에 적신 거즈로 샘플을 포장 및 일반 15 mL의 세포 배양 원뿔 튜브를 고정합니다. 제조업체의 지침에 설명 된 바와 같이, μCT 스캔 무대에 튜브를 장착합니다.
- 145 μA의 전류 55 KVP의 전압, 및 (2)의 노광 시간으로 X 선 소스를 설정00 밀리.
- 20 μm의 해상도와 0.5 mm 알루미늄 필터로 μCT 스캐너로 이미지 수집을 수행합니다.
- 이미지를 재구성하고 (11)를 시각화.
- μCT 검사가 완료되면 2 주 동안 5 % EDTA와 PBS에서 4 %의 자당 (PH 7.4)와 탈회를 시작합니다.
6. 조직 가공 및 염색
- 파라핀의 탈회 조직을 포함. 삽입하기 전에, 바로 첫 번째 어금니에 전방 시상 절단하여 상악 트림. 매립하면서 제 몰의 종단면은 절단면이되도록 하향으로이 표면의 위치.
- 마이크로톰을 사용하여, 5 μm의 두께의 슬라이드를 준비합니다. 펄프 캐핑 영역은 일반적으로 표식으로서 사용될 수 distopalatal (DP) 루트와 일치한다. 광학 현미경 하에서 조직 학적 검사 및 μCT 이미지를 비교하여 관심의 정확한 영역을 결정합니다.
- H & E 염색, depara에 대한ffinize 자일 렌 (2 배)와 직렬로 희석 한 에탄올 (100 % EtOH로 배, 95 % EtOH로 배, 70 % EtOH로 1 배)로 슬라이드를 재수.
- 수돗물을 실행에 슬라이드를 씻어.
- 2.5 분 헤 마톡 실린 용액으로 얼룩 및 수돗물로 씻어냅니다.
- 1 분 동안 95 % 에탄올에서 슬라이드 딥.
- 1 분 에오신 용액으로 얼룩 및 수돗물로 씻어냅니다.
- 희석 한 에탄올 (70 % EtOH로 1 배, 95 % EtOH로 2 배, 및 100 % EtOH로 3X) 및 크실렌 (3x)로 탈수.
- 솔루션을 장착와 슬라이드를 탑재합니다.
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Representative Results
여기서는 마우스 치아 캐핑 펄프 수행 단계별 과정을 나타내었다. 마우스에서 캐핑 펄프의 중요한 측면 중 하나는 적절한 장치를 가지고있다. 이와 관련하여, 10 배의 전력 배율 현미경을 갖는 것이 필수적 (도 1a)이다. 치아의 클래스 I-같은 준비를 만들려면, 우리는 20 만 rpm으로 (그림 1B)에서 전기 고속 핸드 피스의 ¼ 라운드 버를 사용했다. 대안 적으로, 압축 공기를 사용하는 것을 포함하여 다른 엔진은, 치아를 제조 할 수있다.
그림 2A-2E에서, 펄프 캡을 수행하기위한 대표적인 단계가 표시됩니다. 클래스-I-같은 준비 (그림 2B)를 수행 하였다. 물 스프레이 절차를 수행하는 동안 쥐를 익사 수 있기 때문에, 그것의 사용은 권장되지 않습니다. 이 때문에, 부드러운 intermi으로 치아를 준비 필수ttent 과열을 방지하기 위해 스트로크. 압축 공기의 사용은 또한, 냉각 효과를 제공 할 것을 권장한다. 이 수복 상아질 형성 (그림 2C)의 데이터 해석을 방해 할 수와 같은 근관 파일로 펄프를 노출하는 동안, 펄프에 상아질 파편을 밀어 않도록주의를 취할. 이 압축 공기를 사용하여 회피 할 수있다. 마찬가지로, MTA는 펄프에 너무 누르지 않고 노출 된 펄프에 배치해야합니다. MTA 배치 부드러운 태핑 동작 (도 2d)과 용지 포인트의 뒷면을 사용하여 달성 될 수있다. MTA 위치에 따라, 치아는 치아에 복합의 결합을 방해 할 수 있습니다 홈에 남아있는 MTA를 제거하는 H 2 O-적신 코튼 펠렛을 사용하여 청소해야합니다. 합성 복원 통상적 인 방법은 (유동성 복합체, 치아 표면을 에칭 접착제 프라이밍 본딩 및 배치 및 경화제를 포함하여 사용그림 2E).
6 주 펄프 캡핑 후 마우스를 수확하고, 상위 뷰는 복합는 (그림 3A) 그대로임을 확인하기 위해 촬영했다. μCT 검사는 수복 상아질이 펄프에 형성된 것을 제안, 펄프 덮인 그룹 (그림 3B)에서 치수의 공간의 의미있는 경기 침체를 보였다. 탈회 조직 샘플은 상기 생체 조직 학적 수복 상아질의 형성을 조사 H & E 염색 하였다. 대조군, odontoblastic 층 (OB)는 상아질 (- 4C도 4a)의 가장자리 주위에 띄게 명백 하였다. 반면, 펄프 캐핑 그룹은 치수의 공간 (- 4F도 4d)에 형성된 수복 상아질 (RD)의 상당한 양이었다. 흥미롭게도, 자세히 검사가 수복 상아질 (RD)는 상아질의 전형적인 특성을 전시 것으로 나타났다 (예를 들면,이야 상아질 세관, 빨간색 화살표)를 나타내는 triated 줄뿐만 아니라, 그 뼈의 (예를 들면, 골 세포가 나타내는 갇힌 조골 세포, 블랙 화살촉). 우리는 상아질 매트릭스 단백질 1 (DMP1) 치성 분화 (12)에 대한 마커 염색시 (도 5a 및도 5b)을 캡핑 치아의 것과 비교하면, 우리는 펄프 덮인 치아의 펄프 DMP1 발현이 크게 증가하는 결과 , 수복 상아질이 펄프 내에 형성되었음을 나타낸다.
그림 1 : 펄프 캐핑 절차에 대한 장비 설치. (A) 마우스 치아를 가시화하는 현미경 (10X). (B) 고속 핸드 피스와 펄프를 노출시키는 클래스 I 제제를 제조하기위한 전기 모터 엔진.= "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 모자를 씌우는 과정에서 대표 단계. (A) 마우스에서 상악 첫 번째 어금니에 준비되지 않은 치아. (B) 분기 라운드 버를 사용하여 초기 에나멜 제거. 근관 파일을 사용하여 (C) 펄프 노출. 노출 된 펄프 (D) MTA 배치. (E) 치아에 복합 복원 위치. 바는 500 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 임상 프레 젠 테이션 및 μCT Scannin마우스의 펄프 출장 및 캡핑 치아의 g. (A) 펄프 덮인 치아 (왼쪽)와 캡핑 치아 (오른쪽)에 마우스 상악의 교합보기. (B) 상악의 단면 μCT 이미지. 바는 500 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 생체 내에서 수복 상아질 형성의 조직 학적 증거. 100X, 200X와 400X에서 마우스의 상한선 상악 대구치 (AC) H & E 염색. 100X, 200X와 400X에서 마우스의 펄프 덮인 상악 대구치 (DE) H & E 염색. RD = 수복 상아질; 바는 100 μm의 (OB = 상아질 모세포 층을 나타내는 검은 색 화살촉을 =골 세포; 빨간색 화살표 = 상아질 세관). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : DMP1의 면역 조직 화학 염색. 400X에서 마우스의 상한선 상악 대구치 (A) DMP1 염색. 400X에서 마우스의 펄프 덮인 상악 대구치 (B) DMP1 염색. 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재 치과 펄프 줄기 세포 (DPSCs) (13)의 치성 분화에 치과 재료, 비계, 또는 성장 인자의 생체 내 효과를 검증 할 수 여러 가지 실험 모델이있다. 이 모델은 신장 캡슐 기관에 DPSCs의 자궁외자가 이식, 또는 비계 14, 15와 면역 저하 마우스로 DPSCs의 피하 이식을 포함한다. 그러나, 이들 방법은 DPSCs 그들의 원성 효과는 동소 펄프 환경에서 수행되지 않도록 제한된다. 한편, 치아의 펄프 펄프 캡핑 절차에 동소 이식 큰 동물 (16, 17)에 사용된다. 이러한 모델은 동소 환경 원성 잠재력을 평가하는데 유용한 있지만, 이들 모델의 사용은 펄프 상처 치유 및 수복 상아질 형성 제한된 기계적 통찰력을 제공하는 자연에서 주로 관찰된다. 본 논문에서는 생쥐에서 펄프 - 캡핑을 수행 할 수있는 구체적인 방법을 제시한다. 이 단계별 절차는 스캔 μCT와 분석, 펄프 캐핑 물질을 배치 상악를 수확, 클래스-I와 같은 공동을 준비하고, 쥐를 마취하고, 수복 상아질 형성을 위해 조직 샘플에 대한 평가를 포함하고 있습니다. 우리의 펄프 캐핑 마우스 모델은 연구 커뮤니티에서 널리 사용할 수있는 유전자 변형 또는 녹아웃 마우스의 사용을 가능하게하여 수복 상아질의 맥락에서 생체 내에서 치수의 상처 치유의 기본 분자 메커니즘을 조사하는 수단이 될 것입니다.
최근의 연구는 상아질의 형성 (18, 19)을 관찰하는 몇 가지 마우스 모델을 선보였습니다. 사이토 등. 반동이 아니라 복기, 상아질의 형성을 자극 펄프 노출이없는 클래스 I-같은 준비를 만들었습니다. 반동 상아질과 수복 상아질 모두 차 상아질로 분류됩니다어느 치아에 외부 자극에 따라 형성한다. 그러나, 기존 아세포에 의해 형성되는 반동 상아질 달리 수복 상아질이 노출 펄프 해지고 odontoblastic 층 (20)을 벗어나 같은 DPSCs 같은 상아질 모세포와 같은 세포에 의해 형성된다. 따라서, 임상의 실제 펄프 캐핑 순서를 나타내지 않는다. 또 다른 연구에서, 유리 이오노머 펄프 노출 19 캡핑 하였다. 그러나, 임상 연구는 유리 이오노머 만성 염증을 유발하지만, 복기 (21) 상아질없는 것으로 나타났다. 이와 관련하여, 더 나은 펄프 캐핑 마우스 모델은 환자의 실제 펄프 캐핑 절차를 나타낸다.
우리가 6 개 이상의 주 후에 마우스를 수확 할 때, 수복 상아질 형성 펄프 챔버와 근관 (그림 4)에 걸쳐 발생했음을 주목할 만하다. 이러한 관찰은 우리가 6월에 수복 상아질 형성 예상대로가 아니라 예기치 않은펄프 캐핑 물질 펄프 사이 ction. 그러나, 펄프 강력한 광물은 특히 비교적 젊은 환자 (22)에, 임상 설정에서 관찰된다. 본 연구에서 사용 된 8 주령 생쥐 "청소년"23 인 것으로 간주되기 때문에 이러한 마우스는 여전히 상당한 원성 잠재력을 품고있다, 가능성이 존재한다. 따라서, 마우스 수복 상아질 형성의 노화 효과를 조사 할 가치가있을 것이다.
우리의 조직 학적 검사를 수복 상아질이 명확하게 펄프 덮인 치아에 형성되었다하더라도 복기에 상아질 세관의 존재 (빨간색 화살표) 및 골 세포 (블랙 화살촉)에 의해 입증, 모두 상아질과 뼈 형성의 특성이 있었다, 밝혀 상아질 (그림 5). 이러한 관찰은 수복 상아질 형성 로컬 상아질 모세포 형 치과 펄프 줄기 세포뿐만 아니라 infiltratin을 존재에 의해 유도 될 수 있음을 시사주변의 뼈에서 g 중간 엽 줄기 세포.
타르트 레이트 저항성 산성 포스파타제 (TRAP) 염색에 의해 측정 상아질 형성 세포에 비해, 우리는 펄프 내에 상아질 - 재 흡수 세포 발견 (데이터는 보이지 않음). 실제로, 치수의 염증 또는 치근단 치아 주위 뼈 표면에 파골 세포 형성을 유도하지만 인해로서 아직 알려지지 않은 메카니즘 (24) 상아질 표면. 참고로, 기존의 상아질과 새로 형성된 수복 상아질 (그림 4) 사이에 명확한 경계가 있었다. 이전의 연구는 유사한 현상을 보여 주었다; 치아가 비스포스포네이트 또는 파골 세포의 기능을 억제하는 둘 항 RANKL 항체의 존재 하에서 추출되는 경우, 기존의 층판 뼈 새로 형성된 뼈 직포 25 들간 무사 (武士)가 있었다. 이러한 개념은 상기 펄프 상아질 - 재 흡수 세포의 유무를 지원한다. 종합적으로, 우리의 설립 마우스 모델은 P 것펄프 상처 치유 및 생체 수복 상아질 형성의 메커니즘을 조사하는 독특한 기회를 rovide.
펄프 캐핑 마우스 모델에 한계가있다. 인간과 쥐 사이의 유전 메이크업은 분명히 다르다. 전체 게놈 인간 및 마우스에서 서열화되었으며, 마우스 및 인간 (26, 27)의 단백질 코딩 영역에서 약 85 %의 유사성이있다. 이 개념에 부합에서는 동물 캡 펄프에 관한 연구 결과는 반드시 인간 (28) 사람들을 반영하지 않는 것을 제안했다. 그럼에도 불구하고, 동물 모델은 광범위하게 류마티스 관절염 (29), 전신 쇼크 (31) 골다공증 (30), 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 관리를위한 ovariactomy 유발 뼈 손실 및 합자 콜라겐 유도 관절염과 같은 생체 내에서 인간의 질병을, 요점을 되풀이하는 연구 커뮤니티에서 사용되는 치주염 (32)에 대한 배치. 예컨대, 펄프 캐핑 각서로서SE 모델 펄프 상처 치유 및 생체 수복 상아질 형성의 분자 메커니즘을 조사하는 것이 필수적 일 것이다. 그럼에도 불구하고, 단지 다른 동물 모델, 해석 및 펄프 캐핑 마우스 모델에서 연구 결과의 검증과 같은주의 깊게 평가되어야한다.
요약하면, 본 연구는 쥐 캐핑 성공적인 펄프를 보여준다. 다른 알려진 모델과는 달리,이 펄프 캐핑 마우스 모델은 펄프 재생 및 수복 상아질 형성이 제공하기 때문에의 분야에서 매우 중요한 연구 도구를 제공합니다 : 상기 기본 메커니즘을 규명하기 위해 널리 사용되는 유전자 조작 마우스 균주를 이용하기 1) 기회 분자 수준 2) 경제적으로 효율적인 방법은 샘플의 크기를 증가시킴으로써 유의 한 결과를 얻었다. 또한 연구는 생체 내에서 수복 상아질 형성의 목적 정량, 수복 상아질 형성의 연령에 따라 효과, evalua을 포함 기다리고 있습니다임상 적으로 사용 가능한 펄프 캐핑 물질의 기, 적절한 치수의 상처 치유와 수복 상아질의 재생에 필요한 분자 결정의 유효성 검사.
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Acknowledgments
이 연구는 NIDCR / NIH에서 R01DE023348 (RHK)와 캘리포니아 대학 로스 앤젤레스 부문의 학술 상원의 연구에 이사회에서 학부 연구 그랜트 (RHK)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BM-LED stereo microscope | MEIJI Techno | Microscope | |
| Optima MCX-LED | Bien Air Dental | 1700588-001 | Electic motor engine |
| isoflurane | Henry schein animal health | NDC 11695-0500-2 | |
| 1/4 round bur | Brasseler | 001092T0 | |
| Endodontic K-file | Roydent | 98947 | |
| ProRoot MTA | Dentsply | PROROOT5W | MTA |
| Paper point | Henry schein | 100-3941 | |
| Ultra-Etch | Ultradent product Inc. | Phosphoric acid etchant | |
| OptiBond SoloPlus | Kerr | 29669 | Adhesives |
| Coltolux LED | Coltene/whaledent Inc. | C7970100115 | Curing light unit |
| Characterization tint | Bisco | T-14012 | Flowable composite |
| Skyscan | Breuker | 1275 | uCT scanner |
| Microm | Thermo | HM355S | Microtome |
| Hematoxyline-1 | Thermo Scientific | 7221 | |
| Eosin-Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-16 | Mounting solution |
References
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