Summary
在这里，我们提出了一个协议使用原子力显微镜（AFM）测量由单分子力光谱测量相互作用的定义明确的无机表面和任一的肽或氨基酸之间的力。从测量中获得的信息是重要的，以便更好地了解肽 - 无机材料相间。
Abstract
蛋白质或肽和无机材料之间的相互作用导致了一些有趣的流程。例如，含矿物质结合蛋白导致具有独特性能的复合材料的形成。此外，生物结垢的不希望的过程是由生物分子，主要是蛋白质，表面上的吸附开始。该有机层是细菌的粘合层，并允许他们与表面相互作用。理解支配在有机 - 无机界面的相互作用的基本力因此对于研究许多领域重要，并可能导致新的材料设计用于光学，机械和生物医学应用。本文展示了单分子力光谱技术，其利用原子力显微镜测量或肽或氨基酸和良好定义的无机表面之间的粘附力。该技术包括一个协议，用于生物分子附着到AFM小费通过原子力显微镜的共价柔性接头和单分子力谱的测量。此外，这些测量值的分析是包括在内。
Introduction
蛋白质和无机矿物质之间的相互作用导致具有独特性能的复合材料结构。这包括与高的机械强度或独特的光学性质的材料。 1，2例如，与矿物羟磷灰石的胶原蛋白的结合产生任一软或硬的骨骼为不同的功能。 3短肽还可以结合具有高度特异性无机材料。 4，5，6，这些肽的特异性已用于设计新的磁性和电子材料，7，8，9的制造纳米结构材料，生长晶体， 10纳米粒子合成。 11了解底层肽或蛋白质和无机材料之间的相互作用，因此使我们能够具有改进的吸附性能设计新型复合材料的机制。另外，由于植入物具有免疫应答相间是由蛋白质介导，更好地理解与无机材料的蛋白质的相互作用会提高我们的设计的植入物的能力。涉及蛋白质与无机表面相互作用的另一个重要领域是防污材料的制造。 12，13，14，15生物污染是不希望的过程，其中生物附着到表面。这对我们的生活的许多不利影响。例如，在医疗设备的细菌生物污损导致医院获得性感染。海洋生物对船和大型船舶生物污染增加燃料的消耗。 12，16，17，18
单分子力谱（SMFS），使用AFM，可以直接测量的氨基酸或与基板的肽之间的相互作用。 19，20，21，22，23，24，25，26其他方法，如噬菌体展示，27，28 石英晶体微天平（QCM）29或表面等离子体共振（SPR）29，30，31，32，裁判“> 33衡量肽和蛋白质来无机表面的散装的相互作用。34，35，36 这意味着，通过这些方法获得的结果涉及分子或聚集体的合奏。在SMFS，一个或非常少的分子被固定在针尖和它们与所需底物相互作用进行测量。这种方法可以扩展通过从表面拉动蛋白质研究蛋白质折叠。此外，它可以被用来测量细胞和蛋白质与抗体与其配体的结合之间的相互作用。 37，38，39，40本文详细介绍了如何可以肽或氨基酸连接到使用硅醇化学针尖。此外，本文介绍如何执行力测量，以及如何分析结果。
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Protocol
1.修改提示
- 购买氮化硅（ 的 Si 3 N 4）的AFM悬臂用硅提示（〜2纳米的标称悬臂半径）。
- 通过在无水乙醇中浸泡20分钟，清洁每个AFM悬臂。干燥在常温下。然后通过暴露于O 2等离子体5分钟治疗悬臂。
- 暂停清洁提示上述（3厘米）的含甲基三乙氧基硅烷溶液和3-（氨丙基）三乙氧基硅烷中的15：1的比例（V / V）在惰性气氛（氮气或氩气）下一个干燥器和干燥器连接到真空泵。真空2小时，以形成这两种类型的混合硅烷化合物的的单层。
- 使用金属刀片保持器（用于此工艺制造）放置的尖端的热板上。然后在70℃干燥的大气条件下进行10分钟的提示。在使用前，用乙醇清洗热板，金属支架和镊子。
- 很酷房T提示emperature，然后浸入尖端到在含有0.5％（体积/体积）三乙胺的氯仿5毫浓度芴-PEG-N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中（将Fmoc-PEG-NHS，MW 5000道尔顿）1小时室内温度。
- 浸在氯仿中提示5分钟，然后将它浸入二甲基甲酰胺（DMF）额外的5分钟。为了脱保护Fmoc基团所连接的PEG分子，浸在DMF中的20％哌啶（V / V）的尖端30分钟。浸在DMF尖端4分钟，然后在N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）为额外的4分钟。重复顺序浸渍三次。
- 对的氨基酸耦合，浸入尖端到含有N-末端保护的氨基酸（AA）/二异丙基乙胺（DIPEA）/ 2-（1H-苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲hexafluophosphate溶液（HBTU），以1:1的摩尔比为1：1，在30毫米的5ml NMP中1.5小时的总浓度。
- 对于肽偶联，浸提示到5 mL溶液续癌宁40毫克被保护的肽的（N末端和侧链，例如将Fmoc-谷氨酰胺（TRT）-Pro - 丙氨酸 - 丝氨酸（TBU）-Ser（TBU）-Arg（PBF）-Tyr（TBU）-COOH）。 ，15毫克2-（1H苯并三唑-1-基）-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU），和5ml DIPEA的在NMP 2小时。
- 沾NMP提示4分钟。然后，以由乙酰基保护扩孔空闲/未反应NH 2，以摩尔比4浸在乙酸酐/ DIPEA的混合物30分钟的提示：1和0.65 M在NMP中的总浓度。
- 用于肽偶联，执行两个额外的步骤。
- 为了脱保护的肽的侧链，沉浸尖端到含有95％TFA，2.5％三异丙基硅烷和2.5％水1小时的溶液中，然后用氯仿和DMF洗涤。
- 为了除去Fmoc基团的肽的，沉浸尖端到在DMF中的20％哌啶（V / V）30分钟。
- 依次蘸肽/氨基酸官能化ð提示各4分钟的DMF（为肽）或NMP（氨基酸），氯仿，50％的乙醇和水。最后干燥在空气中的小费。
2.表面处理
- 准备云母。用透明胶带切割每次使用前基板（直径9.9毫米）。然后，用三重蒸馏水（TDW）洗涤的表面上。
- 准备二氧化钛涂覆的硅。
- 切断硅晶片（100）转换成使用金刚石笔2 5cm的正方形。
- 放置在一个15毫升的试管填充有丙酮衬底和超声处理它用于在超声浴五分钟。然后，将这个表面在15毫升的试管填充有异丙醇和超声处理它5分钟。用氮气干燥该衬底。
- 溶解表面活性剂（ 例如 ，BYK-348）的乙醇以制备5％（重量/体积）的溶液中。然后，加入0.02毫升的表面活性剂溶液，以2 30毫升％的TiO 2分散体。
- 从所得到的溶液，滴投0。2毫升干净的Si衬底上。
- 退火在250℃以下滴浇铸表面，在空气中2小时。 41
3.单分子力谱测量
- 用市售的双组分胶附着所需的表面到AFM的金属支架。放置金属支架中的原子力显微镜，其形状为一个小的培养皿的玻璃保持器。填用Tris缓冲液（50mM pH值= 7.4）或任何所希望的培养基此支架。然后，将保持器上的刀片保持器下方的原子力显微镜的阶段。
- 校准用弹簧常数使用具有约10％的绝对不确定度的热波动方法26（包含在AFM软件）从10至30 PN /纳米AFM悬臂。
- 由氨基酸或肽官能尖接近到基片测量的相互作用的力，直到其处于与一压缩基板接触〜200 PN的力，然后立即以各种速度缩回的尖端，从0.1至0.8微米/秒，对于〜200nm的距离。
4.数据分析
- 乘以光电二极管灵敏度（伏/米），并用实验测定的弹簧常数转换偏转值（V）来强制。 42这是通过AFM软件自动完成。
- 与一个单分子事件，记录几百曲线（800-1500）获得FD曲线。获得在单分子曲线有两个峰：第一峰值表示尖端与表面和第二个峰对应于与表面分子的特异性相互作用之间的非特异性相互作用。时，将FD曲线含有除这两个峰多，从最可能的力的计算丢弃它们。
注意：仅单个粘附事件都考虑到一个帐户（从10到曲线的30％）。 43
- 与一个单分子事件，记录几百曲线（800-1500）获得FD曲线。获得在单分子曲线有两个峰：第一峰值表示尖端与表面和第二个峰对应于与表面分子的特异性相互作用之间的非特异性相互作用。时，将FD曲线含有除这两个峰多，从最可能的力的计算丢弃它们。
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Representative Results
图1展示尖端修改程序。在第一步骤中，等离子体处理改变氮化硅尖端的表面上。尖端呈现OH基团。然后这些基团将与硅烷反应。在此步骤结束时，尖端的表面将由自由-NH 2基团所覆盖。然后，这些游离胺将用Fmoc -PEG-NHS，共价连接物反应。 Fmoc基团的PEG连接的是由pipyridine，脱保护试剂除去。最后，该检查的氨基酸或肽分子通过使用偶联试剂HBTU PEG的游离胺基耦合。
与修改后的针尖能够检查氨基酸或肽与所述表面（ 图2）的相互作用。 PEG分子从尖端肽或氨基酸分开，并允许它们自由定向。一个典型的力measu在一个力-距离曲线rement结果（ 图3）。该曲线具有从表面的前端，和一个单一的分子粘附事件的分离的一个特征点。第一峰值表示尖端与表面和第二峰之间的非特异性相互作用是指特定粘附事件。从几百FD曲线可以通过绘制粘附事件与部队的数量来构造一个直方图。这些直方图应用高斯拟合将确定最有可能的力（MPF）。
图1：提示修改程序。针尖的化学修饰的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：SMF的实验装置。单分子力谱设置的示意图，用于测量氨基酸或肽和所需的表面之间的相互作用。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：力-距离曲线。典型的单分子的FD曲线（A）的肽谷氨酰胺-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-丝氨酸-精氨酸-酪氨酸从云母表面，和（B）的氨基酸苯丙氨酸从TiO 2的表面的破裂。 请cli来这里完蛋查看此图的放大版本。
图4：直方图绘制最可能部队（MPF）和图形绘制的力比。负荷率。 （A）中的肽谷氨酰胺-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-丝氨酸-精氨酸-酪氨酸的破裂力值的典型直方图从云母（以3.1±0.6 NN /秒（N = 7 8）的负载率），（B ）选自TiO 2的氨基酸苯丙氨酸（在4.2±0.7 NN /秒（装载率N = 79））。最可能的力（MPF）的值是基于高斯拟合（黑线）来计算。加载速率的依赖性的破裂力为（C）的肽谷氨酰胺-脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸-丝氨酸-精氨酸-酪氨酸和（D）的氨基酸苯丙氨酸。动力学参数是从力的相对于表观装载r的对数的线性图外推吃了。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
步骤1.3，1.4和1.7中的协议，应广泛护理和在一个非常温和的方式进行。在步骤1.3中，将尖端不应该在用硅烷混合物和硅烷化过程中应在惰性气氛（无水分）进行接触。 45这样做是为了防止多层形成和因硅烷分子容易进行水解在水分存在完成。 45
在步骤1.4中，温度和时间应妥善保管。开始步骤1.5之前，尖端应冷却到室温;否则会被损坏。在偶合步骤（1.7），所述HBTU和被检查的氨基酸或肽应完全溶解于混合物中。偶联后，洗涤用不同溶剂的尖端应该以非常温和的方式进行，以避免尖的任何损害。
所报告的技术可以申请组卷到任何肽或氨基酸。要修改的硅尖，我们使用硅烷。这是可以被改变的一般化学。例如，可以使用两个或一种类型的聚乙二醇化的硅烷的修改小费。 23，25，26如果尖端由金，然后硫醇基团可以用于尖端的修改。替代协议利用次氮（NTA）封端的接头，能够针对组氨酸，重组组氨酸标签蛋白在一起。近日，Lyubchenko 等。所述的合成和的新型聚合物接头的检查和在几个SMFS实验显示了其应用。接头的合成是基于发达磷酸酯（PA）的化学。该化学允许具有预定长度和PA组合物接头的常规合成。这些连接子的长度是均匀的，可与各种官能团来终止。此外，生物分子可以在黄金基板或提示通过天然或工程巯基与硫原子金形成共价键固定。
此方法允许在单分子水平到解除从表面的分子，而不是在本体所需要的力的定量和详细的测量。该技术的未来应用包括蛋白质与前端的附件和的新的混合材料的设计。新型复合材料和功能表面的设计和开发人员将可获得的蛋白质或肽与无机材料之间的相互作用的基本理解。这里提供了用于SMFS用原子力显微镜的协议可以作为用于研究蛋白质，肽和氨基酸的不同表面之间的相互作用的有力工具。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm | |
| Methyltriethoxysilane | Acros Organics (New Jersey, USA) | For Silaylation of the AFM tip | |
| 3-(Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | For Silaylation of the AFM tip | |
| Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for peptide deprotection | |
| N-Ethyldiisopropylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Triethylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Piperidine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip Fmoc deprotection | |
| Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS) | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) | Used as the covalent flexible linker (MW = 5,000 Da) | |
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, England) | Used as a coupling reagent. | |
| N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) | Acros Organics (New Jersey, USA) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| DMF (dimethylformamide) | Merck (Darmstadt, Germany) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Chloroform | Bio-Lab (Jerusalem, Israel) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Ethanol (Anhydrous) | Gadot (Netanya, Israel) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Trifluoro acetic acid (TFA) | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Acetic anhydride | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Peptides | GL Biochem (Shanghai, China). | ||
| Phenylalanine and Tyrosine | Biochem (Darmstadt, Germany) | ||
| 30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) | (30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO2 substrate preparation | |
| Mica substrates | TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) | 9.9 mm diameter |
References
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