Summary
ここでは、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、単一分子力分光測定によって明確に定義された無機表面のいずれかのペプチドまたはアミノ酸との間の相互作用の力を測定するためのプロトコルを提示します。測定から得られた情報は、より良好なペプチド無機材料相間を理解することが重要です。
Abstract
タンパク質またはペプチドと無機材料との間の相互作用は、いくつかの興味深いプロセスにつながります。例えば、無機物でタンパク質を結合する独特の特性を有する複合材料の形成をもたらします。また、生物付着の好ましくないプロセスが表面上の生体分子、主にタンパク質の吸着によって開始されます。この有機層は、細菌のための接着層であり、それらは表面と相互作用することを可能にします。有機 - 無機界面での相互作用を支配する基本的な力を理解することは、研究の多くの分野のためには重要であると、光学機械的および生物医学的用途のための新しい材料の設計につながる可能性があります。本稿では、ペプチドまたはアミノ酸と明確に定義された無機表面のいずれかとの間の接着力を測定するために、AFMを利用して単一分子力分光法の技法を示しています。この技術は、AFMに生体分子を付着するためのプロトコルを含みます原子間力顕微鏡による共有結合柔軟なリンカーおよび単一分子力分光測定を通じて先端。また、これらの測定値の分析が含まれます。
Introduction
タンパク質および無機鉱物との間の相互作用は、独特の特性を有する複合材料の構築につながります。これは、高い機械的強度、または独自の光学特性を有する材料を含みます。例えば、 図1、 図2は 、鉱物ヒドロキシアパタイトとタンパク質コラーゲンの組み合わせは、異なる機能のための軟質または硬質の骨のいずれかを生成します。 3短いペプチドはまた、特異性の高い無機材料をバインドすることができます。 4、5、これらのペプチドの6特異性は、結晶を成長させる、9ナノ構造材料を製造する、8、7、新たな磁気及び電子材料を設計するために使用されています、 10とナノ粒子を合成します。 図11は、ペプチドまたはタンパク質と無機材料との間の相互作用の根底にあるメカニズムを理解することは、したがって、私たちは改善された吸着特性を持つ新しい複合材料を設計することができるようになります。免疫応答とインプラントの間期は、タンパク質によって媒介されるので、また、より良い無機物質とタンパク質の相互作用を理解することは、インプラントを設計する当社の能力を向上させます。無機表面と相互作用するタンパク質が関与するもう一つの重要な領域は、防汚材料の製造です。 12、13、14、15生物付着生物が表面に付着する望ましくないプロセスです。それは私たちの生活に多くの有害な影響を与えます。例えば、医療機器上の細菌の生物付着は、院内感染につながります。ボートや大型船舶の海洋生物の生物付着が増加します燃料の消費量。 12、16、17、18
単一分子力分光法（SMFS）は、AFMを用いて、直接アミノ酸または基質とペプチドの間の相互作用を測定することができます。このようなファージディスプレイ、27、28と19、20、21、22、23、24、25、26他の方法 水晶微量天秤（QCM）29または表面プラズモン共鳴（SPR）29、30、31、32、REF "> 33小節バルク中の無機表面へのペプチドおよびタンパク質の相互作用。34、35、36 これは、これらの方法により得られた結果は、分子または凝集体の集合に関連することを意味します。 SMFSでは、1つまたは非常に少数の分子は、AFMチップに固定されており、所望の基材との相互作用が測定されます。このアプローチは、表面からのタンパク質を引っ張ることによって、タンパク質のフォールディングを研究するために拡張することができます。また、細胞タンパク質およびそれらのリガンドに対する抗体の結合との間の相互作用を測定することができます。 37、38、39、40本稿では、シラノール化学を用いてAFMチップにペプチドまたはアミノ酸のいずれかを接続する方法を詳細に説明しています。また、紙は力の測定を実行する方法および分析する方法について説明します結果。
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Protocol
1.ヒント修正
- 購入窒化シリコン（Si 3 N 4）、シリコンチップとAFMカンチレバー（〜2nmの公称カンチレバー半径）。
- 20分間無水エタノールに浸漬して、各AFMカンチレバーを清掃してください。室温で乾燥しました。その後、5分間O 2プラズマにそれらを暴露することによってカンチレバーを扱います。
- 15の割合で（3センチ）を含む溶液メチルトリエトキシシラン、3-（アミノプロピル）トリエトキシシラン上記のきれいなヒントをサスペンド：1（v / v）の不活性雰囲気（窒素やアルゴンのいずれか）の下でデシケーター中とにデシケーターを接続真空ポンプ。混合したシラン化合物のこれら2つのタイプの単層を形成するために2時間真空。
- ホットプレート上でのヒントを配置する（このプロセスのために作製）金属製のチップホルダーを使用します。その後、大気条件下で、70℃で10分間のヒントを乾燥させます。使用前に、エタノールを使用して、ホットプレート、金属製のホルダーとピンセットを清掃してください。
- 部屋tでのヒントをクールemperature、その後で1時間、0.5％（v / v）のトリエチルアミンを含有するクロロホルム中の5 mMの濃度で、フルオレ-PEG-N-ヒドロキシカルボニル（Fmoc-PEG-NHS、MW 5,000 Da）での溶液にチップを浸漬室温。
- 5分間クロロホルムでヒントを浸漬した後、さらに5分間、ジメチルホルムアミド（DMF）中に浸します。結合したPEG分子のFmoc基を脱保護するために、30分間DMF中の20％ピペリジン（v / v）の中にヒントを浸します。 4分間DMF中でチップを浸漬した後、N-メチル-2-ピロリドン（NMP）中でさらに4分間。 3回浸漬シーケンシャルを繰り返します。
- アミノ酸のカップリングのために、N末端保護アミノ酸（AA）/ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）/ 2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムhexafluophosphateを含む溶液にチップを浸漬1.5時間5mLのNMP中の30mMの総濃度で、1：1：1のモル比で（HBTU）。
- ペプチドカップリングのために、5 mL溶液の続きにヒントを浸し保護されたペプチド40mgのaining（N末端及び側鎖、例えばのFmoc-Glnを（Trtの）-Pro-ALA-のSer（tBuで）-Ser（tBuで）-Arg（PBF）-Tyr（tBuで）-COOHを。） 、15mgの2-（1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、および2時間NMP中DIPEA 5mLの。
- 4分間のNMP中のヒントを浸します。 1及びNMP中0.65 Mの合計濃度：次に、アセチル基によってリーマ無料/未反応NH 2を保護するために、モル比4で無水酢酸/ DIPEAの混合物中で30分間のヒントを浸します。
- ペプチドカップリングのために、二つの追加の手順を実行します。
- 、ペプチドの側鎖を脱保護し、1時間、95％TFA、2.5％のトリイソプロピルシラン、2.5％の水を含む溶液にチップを浸漬し、次いで、クロロホルムおよびDMFで洗浄するためです。
- 30分間DMF中の20％ピペリジン（v / v）の中にチップを、ペプチドのFmoc基を除去浸漬するためです。
- 順次ペプチド/アミノ酸 - 官能ディップDMF（ペプチド）またはNMP（アミノ酸など）、クロロホルム、50％のエタノールと水の4つの分間、Dヒント。最後に、空気中のチップを乾燥させます。
2.表面の準備
- マイカを準備します。スコッチテープを使用して、各使用前に基質（9.9ミリメートルの直径）を切断します。その後、三重蒸留水（TDW）で表面を洗います。
- TiO 2被覆シリコンを準備します。
- ダイヤモンドペンを用いて2cmの正方形にシリコンウェハ（100）を切断します。
- アセトンを充填した15mLの試験管内に基板を配置し、超音波浴中で5分間、それを超音波処理します。次いで、イソプロパノールを充填した15 mLの試験管にこの表面を置き、5分間、それを超音波処理。窒素を使用して基板を乾燥させます。
- 5％（重量/容量）溶液を調製し、エタノール中の界面活性剤（ 例えば 、BYK-348）を溶解します。その後、2 mLの30の％のTiO 2分散液に界面活性剤溶液の0.02 mLを加え。
- 得られた溶液から、ドロップキャスト0を。清浄なSi基板上に2 mLです。
- 空気中で2時間、250℃でこれらのドロップキャスト表面をアニール。 41
3.シングル分子力分光測定
- 市販の二成分接着剤でAFMの金属製のホルダーに所望の表面を取り付けます。小さなペトリ皿のように形作られているAFM、ガラスホルダーに金属製のホルダーを配置します。トリス緩衝液（50mMのpH = 7.4）、または任意の媒体と、このホルダーを記入してください。そして、チップホルダ以下AFMステージ上にホルダーを配置します。
- 約10％の絶対的な不確実性（AFMソフトウェアに含まれる）熱揺らぎ法26を使用して10から30 PN / nmの範囲のバネ定数とAFMカンチレバーのキャリブレーションを行います。
- それが圧縮された基板に接触するまで、基板にアミノ酸又はペプチド官能先端に近づくことにより、相互作用の力を測定〜200 pNでの力と直ちに〜200nmの距離のために、0.1〜0.8ミクロン/秒から、様々な速度で先端を撤回。
4.データ解析
- フォトダイオードの感度（V / m）を乗算し、実験的に決定されたばね定数を使用して強制的に偏向値（V）に変換します。 42これは、AFMソフトウェアによって自動的に行われます。
- 1単一分子イベントとFD曲線を得るためには、曲線の数百（800-1,500）を記録。単一分子曲線に2つのピークを取得します。最初のピークは、表面と分子の特異的な相互作用に先端部と表面と第2のピークに相当するとの間の非特異的な相互作用を示しています。 FD曲線は、これら2つのピークを超えて含有する場合、最も可能性の力の計算からそれらを捨てます。
注：つだけ接着イベントは（曲線の10〜30％の）考慮されます。 43
- 1単一分子イベントとFD曲線を得るためには、曲線の数百（800-1,500）を記録。単一分子曲線に2つのピークを取得します。最初のピークは、表面と分子の特異的な相互作用に先端部と表面と第2のピークに相当するとの間の非特異的な相互作用を示しています。 FD曲線は、これら2つのピークを超えて含有する場合、最も可能性の力の計算からそれらを捨てます。
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Representative Results
図1は、先端変更手順を示します。第1のステップでは、プラズマ処理は、窒化シリコンチップの表面を変化させます。先端はOH基を提示します。これらのグループはその後、シランと反応します。このステップの終了時に、チップの表面は、遊離-NH 2基により覆われます。これらの遊離アミンは、その後のFmoc -PEG-NHS、共有結合性リンカーと反応します。 PEGリンカーのFmoc基をpipyridine、脱保護試薬により除去されます。最後に、検査したアミノ酸又はペプチド分子がカップリング試薬HBTUを用いてPEGの遊離アミン基を介して結合されています。
修正されたAFMチップを、表面（ 図2）を有するアミノ酸又はペプチドの相互作用を調べることができます。 PEG分子は、先端から、ペプチドまたはアミノ酸を分離し、それらを自由に配向させることができます。典型的な力measuフォース-距離曲線でリーメント結果（ 図3）。この曲線は、表面からのチップの剥離、および単一分子接着事象の特徴点を有しています。最初のピークは、特定の接着イベントを指し先端と表面と第2のピークとの間の非特異的相互作用を示しています。数百FD曲線からその力に対する接着事象の数をプロットしたヒストグラムを構築することができます。これらのヒストグラムにガウスフィットを適用すると、最も可能性の高い力（MPF）を決定します。
図1：ヒント変更手順。 AFMチップの化学修飾の模式図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：SMFS実験。アミノ酸やペプチドと所望の表面間の相互作用を測定するための単一分子力分光法のセットアップの概略図。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：力-距離曲線。 TiO 2の表面からの雲母表面、及び（B）は、アミノ酸フェニルアラニンから（A）ペプチドのGln-PRO-ALA-SER-のSer-Argを-Tyrでの破裂のための典型的な単一分子FD曲線。 CLIくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらのCK。
図4：ヒストグラムは、最も可能性の高い部隊（MPF）をプロットし、グラフは、力対をプロット負荷速度。 （A）雲母から（3.1±0.6のNN / sの負荷速度で（N = 7~8））のペプチドのGln-PRO-ALA-SER-のSer-Argを-Tyrでの破断力の値の代表的なヒストグラム、（B （負荷4.2±0.7のNN / sのレート（N = 79で）のTiO 2から）のアミノ酸フェニルアラニン）。最も可能性の力（MPF）の値は、ガウスフィット（黒線）に基づいて計算しました。 （C）ペプチドのGln-PRO-ALA-SER-SER-Argで-Tyrおよび（D）は、アミノ酸フェニルアラニン破断力のためにローディング速度依存性。動力学的パラメーターは、見かけ上の負荷rの対数対力の線形プロットから外挿しました食べました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
1.3の手順、プロトコル1.4と1.7は、大規模な注意を払って、非常に穏やかな方法で行われるべきです。ステップ1.3において、チップは、シラン混合物と接触してはならず、シラン化処理は、不活性雰囲気（無水）で行われるべきです。 45これは、多層の形成を防止するために、シラン分子が容易に水分の存在下で加水分解を受けるために行われます。 45
ステップ1.4で、温度と時間が適切に保たれるべきです。ステップ1.5を開始する前に、チップを室温まで冷却されるべきです。それ以外の場合は破損します。カップリング工程（1.7）において、HBTU及び検査アミノ酸またはペプチドは、完全に混合物中に溶解されるべきです。カップリングの後、別の溶媒を用いてチップを洗浄する先端への損傷を避けるために、非常に穏やかな方法で行われるべきです。
報告された技術は、APPLことができます任意のペプチドまたはアミノ酸にIED。シリコンチップを変更するには、我々はシランを使用しています。これは変更することができ、一般的な化学反応です。例えば、1は先端を変更するには、PEG化されたシランの2つまたはいずれかのタイプを使用することができます。 23、25、26チップは金で作られている場合には、チオール基は、先端部の変形のために使用することができます。代替プロトコルは、ニトリロトリ（NTA）を悪用一緒に組換えヒスチジンタグ付きタンパク質と、ヒスチジンを標的とすることができるリンカーを、 - 末端。最近、Lyubchenko ら。合成を記載し、新規ポリマーリンカーの調べ、いくつかのSMFS実験でそのアプリケーションを示しました。リンカーの合成は、よく発達したホスホルアミデート（PA）化学に基づいています。この化学反応は、所定の長さとPA組成物とリンカーのルーチン合成を可能にします。これらのリンカーは、長さが均質であり、種々の官能基で終端することができます。また、生体分子は、硫黄原子と金型の共有結合などのネイティブもしくは操作チオール基を介して金基板や先端に固定することができます。
この方法は、単一分子レベルではなく、バルクで表面から分子をアンバインドするために必要な力の定量的かつ詳細な測定を可能にします。技術の将来のアプリケーションは、先端へのタンパク質の付着及び新しいハイブリッド材料の設計が含まれます。新しい複合材料および機能面の設計と開発は、無機物質とタンパク質またはペプチドとの間の相互作用の基本的な理解を得ることから利益を得るであろう。 AFMでSMFSのためにここに提供されるプロトコルは、異なる表面にタンパク質、ペプチド及びアミノ酸の間の相互作用を研究するための強力なツールとして役立つことができます。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm | |
| Methyltriethoxysilane | Acros Organics (New Jersey, USA) | For Silaylation of the AFM tip | |
| 3-(Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | For Silaylation of the AFM tip | |
| Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for peptide deprotection | |
| N-Ethyldiisopropylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Triethylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Piperidine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip Fmoc deprotection | |
| Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS) | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) | Used as the covalent flexible linker (MW = 5,000 Da) | |
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, England) | Used as a coupling reagent. | |
| N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) | Acros Organics (New Jersey, USA) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| DMF (dimethylformamide) | Merck (Darmstadt, Germany) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Chloroform | Bio-Lab (Jerusalem, Israel) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Ethanol (Anhydrous) | Gadot (Netanya, Israel) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Trifluoro acetic acid (TFA) | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Acetic anhydride | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Peptides | GL Biochem (Shanghai, China). | ||
| Phenylalanine and Tyrosine | Biochem (Darmstadt, Germany) | ||
| 30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) | (30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO2 substrate preparation | |
| Mica substrates | TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) | 9.9 mm diameter |
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