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Chemistry

एमिनो एसिड और पेप्टाइड्स अकार्बनिक सामग्री के साथ बातचीत में इनसाइट्स एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग

doi: 10.3791/54975 Published: March 6, 2017

Summary

यहाँ हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत एक परमाणु बल सूक्ष्मदर्शी (AFM) का उपयोग करते हुए एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप से एक अच्छी तरह से परिभाषित अकार्बनिक सतह और या तो पेप्टाइड या अमीनो एसिड के बीच बातचीत के बल को मापने के लिए। जानकारी के माप से प्राप्त बेहतर पेप्टाइड अकार्बनिक पदार्थ अंतरावस्था समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

Abstract

प्रोटीन या पेप्टाइड्स और अकार्बनिक सामग्री के बीच बातचीत कई दिलचस्प प्रक्रियाओं के लिए सीसा। उदाहरण के लिए, खनिजों के साथ प्रोटीन के संयोजन अद्वितीय गुणों के साथ मिश्रित सामग्री के गठन की ओर जाता है। इसके अलावा, जैव अवरोध की अवांछनीय प्रक्रिया biomolecules, मुख्य रूप से प्रोटीन, सतहों पर सोखना द्वारा शुरू की है। यह कार्बनिक परत बैक्टीरिया के लिए एक आसंजन परत है और उन्हें सतह के साथ बातचीत करने की अनुमति देता है। मौलिक बलों है कि कार्बनिक अकार्बनिक इंटरफेस में बातचीत शासन को समझना इसलिए अनुसंधान के कई क्षेत्रों के लिए महत्वपूर्ण है और ऑप्टिकल, यांत्रिक और जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए नई सामग्री के डिजाइन करने के लिए ले जा सकता है। यह पत्र एक एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है कि एक AFM का इस्तेमाल या तो पेप्टाइड या अमीनो एसिड और अच्छी तरह से परिभाषित अकार्बनिक सतहों के बीच आसंजन बल को मापने के लिए यह दर्शाता है। इस तकनीक AFM को बायोमोलिक्यूल संलग्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिलएक सहसंयोजक लचीला लिंकर और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोप द्वारा एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के माध्यम से टिप। इसके अलावा, इन मापों के एक विश्लेषण शामिल है।

Introduction

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प्रोटीन और अकार्बनिक खनिज के बीच बातचीत के विशिष्ट गुणों के साथ मिश्रित सामग्री के निर्माण की ओर जाता है। इस उच्च यांत्रिक शक्ति या अद्वितीय ऑप्टिकल गुणों के साथ सामग्री भी शामिल है। 1, 2 उदाहरण के लिए, खनिज हाइड्रॉक्सियापटाइट के साथ प्रोटीन कोलेजन के संयोजन विभिन्न functionalities के लिए या तो मुलायम या हार्ड हड्डियों उत्पन्न करता है। 3 कम पेप्टाइड्स भी उच्च विशिष्टता के साथ अकार्बनिक सामग्री बाध्य कर सकते हैं। 4, 5, 6 इन पेप्टाइड्स की विशिष्टता नई चुंबकीय और इलेक्ट्रॉनिक सामग्री डिजाइनिंग, 7, 8, 9 सामग्री nanostructured fabricating बढ़ रही है, क्रिस्टल के लिए इस्तेमाल किया गया है, 10 और synthesizing नैनोकणों। 11 तंत्र पेप्टाइड या प्रोटीन और अकार्बनिक सामग्री के बीच बातचीत अंतर्निहित इसलिए हमें adsorptive गुणों में सुधार के साथ नए मिश्रित सामग्री डिजाइन करने के लिए अनुमति देगा समझना। इसके अलावा, क्योंकि एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ प्रत्यारोपण के अंतरावस्था प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता है, बेहतर अकार्बनिक पदार्थों के साथ प्रोटीन की बातचीत को समझने हमारे प्रत्यारोपण डिजाइन करने की क्षमता में सुधार होगा। एक अन्य महत्वपूर्ण क्षेत्र है कि अकार्बनिक सतहों के साथ बातचीत प्रोटीन शामिल antifouling सामग्री के निर्माण की है। 12, 13, 14, 15 biofouling एक अवांछनीय प्रक्रिया है जिसमें जीवों एक सतह को देते है। यह हमारे जीवन पर कई हानिकारक प्रभाव पड़ता है। उदाहरण के लिए, चिकित्सा उपकरणों पर बैक्टीरिया की जैव अवरोध अस्पताल का अधिग्रहण संक्रमण के लिए होता है। नावों और बड़े जहाजों पर समुद्री जीवों की जैव अवरोध बढ़ जाती है ईंधन की खपत। 12, 16, 17, 18

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (SMFS), एक AFM का उपयोग कर, सीधे एक एमिनो एसिड या एक सब्सट्रेट के साथ एक पेप्टाइड के बीच बातचीत उपाय कर सकते हैं। 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 में इस तरह के फेज प्रदर्शन, 27, 28 के रूप में अन्य तरीकों क्वार्ट्ज क्रिस्टल Microbalance (QCM) 29 या सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर), 29, 30, 31, 32,रेफरी "> 33 को मापने के लिए थोक में पेप्टाइड्स और अकार्बनिक सतहों के लिए प्रोटीन की बातचीत। 34, 35, 36 इसका मतलब यह है कि इन तरीकों से प्राप्त परिणामों के अणुओं या समुच्चय की टुकड़ियों से संबंधित हैं। SMFS में, एक या बहुत कुछ अणुओं AFM टिप करने के लिए तय कर रहे हैं और वांछित सब्सट्रेट के साथ उनकी बातचीत मापा जाता है। यह दृष्टिकोण सतह से प्रोटीन खींच कर प्रोटीन तह अध्ययन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। इसके अलावा, यह कोशिकाओं और प्रोटीन और उनके ligands के लिए एंटीबॉडी के बंधन के बीच बातचीत को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 37, 38, 39, 40 इस पत्र में विस्तार से वर्णन silanol रसायन विज्ञान का उपयोग AFM टिप करने के लिए या तो पेप्टाइड या अमीनो एसिड संलग्न करने के लिए कैसे। इसके अलावा, कागज बताते हैं कि कैसे बल माप प्रदर्शन करने के लिए और विश्लेषण करने के लिए कैसेपरिणाम है।

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Protocol

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1. टिप संशोधन

  1. क्रय सिलिकॉन नाइट्राइड (सी 3 N 4) सिलिकॉन सुझावों के साथ AFM cantilevers (~ 2 एनएम के नाममात्र ब्रैकट त्रिज्या)।
  2. 20 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल में सूई से प्रत्येक AFM ब्रैकट साफ करें। कमरे के तापमान पर सूखी। फिर 5 मिनट के लिए हे 2 प्लाज्मा करने के लिए उन्हें उजागर द्वारा cantilevers का इलाज।
  3. 15 के अनुपात में ऊपर (3 सेमी) एक समाधान युक्त methyltriethoxysilane और 3- (aminopropyl) triethoxysilane साफ सुझावों के निलंबित: 1 (वी / वी) माहौल निष्क्रिय (या तो नाइट्रोजन या आर्गन) के तहत Desiccator में और करने के लिए desiccator कनेक्ट एक वैक्यूम पंप। 2 घंटे के लिए वैक्यूम मिश्रित silane यौगिकों के इन दो प्रकार की एक monolayer के रूप में।
  4. एक गर्म थाली पर सुझाव के लिए जगह एक धातु टिप धारक (इस प्रक्रिया के लिए गढ़े) का प्रयोग करें। तब वायुमंडलीय परिस्थितियों में 70 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सुझाव दिए सूखी। उपयोग करने से पहले, इथेनॉल का उपयोग हॉट प्लेट, धातु धारक और चिमटी साफ।
  5. कमरे टी पर सुझाव कूलemperature, और फिर एक Fluorenylmethyloxycarbonyl खूंटी-एन hydroxysuccinimide के कम 1 घंटे के लिए 0.5% (वी / वी) triethylamine युक्त क्लोरोफॉर्म में 5 मिमी की एकाग्रता में (Fmoc खूंटी एनएचएस, मेगावाट 5000 दा) समाधान में सुझाव दिए विसर्जित कमरे का तापमान।
  6. 5 मिनट के लिए क्लोरोफॉर्म में सुझावों डुबकी और फिर अतिरिक्त 5 मिनट के लिए dimethylformamide (DMF) में डुबकी। आदेश में संलग्न खूंटी अणुओं के Fmoc समूह deprotect करने के लिए, 30 मिनट के लिए DMF में 20% piperidine (वी / वी) में सुझावों डुबकी। 4 मिनट के लिए और फिर अतिरिक्त 4 मिनट के लिए एन मिथाइल-2-pyrrolidone (एनएमपी) में DMF में सुझावों डुबकी। अनुक्रमिक तीन बार सूई दोहराएँ।
  7. एमिनो एसिड की युग्मन के लिए, एक समाधान एन टर्मिनल संरक्षित एमिनो एसिड (एए) / diisopropylethylamine (DIPEA) / 2- (1H-benzotriazol-1-YL) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluophosphate युक्त में सुझाव दिए विसर्जित कुल 1.5 घंटे के लिए 5 एमएल एन एम पी में 30 मिमी की एकाग्रता में 1: (HBTU), 1 की एक दाढ़ अनुपात में: 1।
  8. पेप्टाइड युग्मन के लिए, एक 5 एमएल समाधान शेष भाग में सुझाव दिए डुबकीसंरक्षित पेप्टाइड की 40 मिलीग्राम aining (एन टर्मिनल और पक्ष श्रृंखला, उदाहरण के Fmoc-Gln (ठ्ठ) समर्थक-आला-सर्विसेज (TBU) -Ser (TBU) -Arg के लिए (PBF) -Tyr (TBU) -COOH।) 15 मिलीग्राम 2- (1H-benzotriazol-1-YL) -1,1,3,3-tetramethyluronium Hexafluorophosphate (HBTU), और 2 घंटे के लिए एन एम पी में DIPEA के 5 एमएल।
  9. 4 मिनट के लिए एन एम पी में सुझावों डुबकी। फिर, एसिटाइल समूह द्वारा reaming मुफ्त / unreacted राष्ट्रीय राजमार्ग 2 की रक्षा के लिए एक दाढ़ अनुपात 4 में एसिटिक एनहाइड्राइड / DIPEA का एक मिश्रण में 30 मिनट के लिए सुझाव दिए गए डुबकी: 1 और एन एम पी में 0.65 मीटर की कुल एकाग्रता।
  10. पेप्टाइड युग्मन के लिए, दो अतिरिक्त कदम प्रदर्शन करते हैं।
    1. आदेश, पेप्टाइड के पक्ष श्रृंखला deprotect एक समाधान 95% TFA, 2.5% triisopropylsilane, और 2.5% पानी 1 घंटे के लिए युक्त में सुझाव दिए विसर्जित, और फिर क्लोरोफॉर्म और DMF के साथ धोने के लिए।
    2. पेप्टाइड की Fmoc समूह 30 मिनट के लिए DMF में 20% piperidine (वी / वी) में टिप्स, दूर करने के लिए विसर्जित आदेश में।
  11. क्रमिक रूप से पेप्टाइड / अमीनो एसिड functionalize डुबकी, क्लोरोफॉर्म, 50% इथेनॉल और पानी (अमीनो एसिड के लिए) DMF (पेप्टाइड्स के लिए) या एनएमपी में चार मिनट प्रत्येक के लिए डी टिप्स। अंत में हवा में टिप सूखी।

2. सतह तैयारी

  1. अभ्रक तैयार करें। स्कॉच टेप का उपयोग करके प्रत्येक उपयोग करने से पहले substrates (9.9 मिमी व्यास) फोड़ना। फिर, ट्रिपल आसुत जल (TDW) के साथ सतहों धो लें।
  2. 2 Tio लेपित सिलिकॉन तैयार करें।
    1. एक हीरे की कलम का उपयोग कर 2 सेमी वर्गों में सिलिकॉन वेफर (100) कट।
    2. एक 15 एमएल टेस्ट ट्यूब एसीटोन के साथ भर में सब्सट्रेट की जगह और एक अल्ट्रासोनिक स्नान में पांच मिनट के लिए यह sonicate। फिर, एक 15 एमएल टेस्ट ट्यूब isopropanol के साथ भर में इस सतह जगह है और 5 मिनट के लिए यह sonicate। नाइट्रोजन का उपयोग सब्सट्रेट सूखी।
    3. एक 5% (वजन / मात्रा) समाधान तैयार करने के लिए इथेनॉल में surfactant (जैसे, Byk-348) भंग। फिर, एक 2 30 एमएल% 2 Tio फैलाव को surfactant समाधान के 0.02 एमएल जोड़ने।
    4. परिणामस्वरूप समाधान से, ड्रॉप-डाली 0।एक साफ सी सब्सट्रेट पर 2 एमएल।
    5. हवा में 2 घंटे के लिए इन ड्रॉप-casted 250 डिग्री सेल्सियस पर सतहों पानी रखना। 41

3. एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप

  1. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध दो घटक गोंद के साथ AFM की एक धातु धारक के लिए वांछित सतह संलग्न। AFM, जो एक छोटे से पेट्री डिश के रूप में आकार का है की गिलास धारक में धातु धारक रखें। Tris बफर (50 मिमी पीएच = 7.4) या किसी भी वांछित माध्यम के साथ इस धारक भरें। फिर, टिप धारक नीचे AFM मंच पर धारक जगह है।
  2. वसंत के बारे में 10% की एक पूर्ण अनिश्चितता के साथ थर्मल अस्थिरता विधि 26 (AFM सॉफ्टवेयर में शामिल है) का उपयोग करते हुए 10 से 30 पी.एन. / एनएम को लेकर स्थिरांक के साथ AFM cantilevers जांचना।
  3. सब्सट्रेट करने के लिए अमीनो एसिड या पेप्टाइड क्रियाशील टिप के निकट से बातचीत के बल उपाय जब तक यह एक संपीड़न के साथ सब्सट्रेट के साथ संपर्क में है~ 200 पी.एन. के बल और फिर तुरंत टिप विभिन्न गति पर, ~ 200 एनएम की दूरी के लिए वापस लेना 0.1 0.8 माइक्रोन / s से।

4. डेटा विश्लेषण

  1. photodiode संवेदनशीलता (वी / मी) गुणा और प्रयोगात्मक निर्धारित लगातार वसंत का उपयोग करके विक्षेपन मूल्यों (वी) के लिए मजबूर करने के लिए परिवर्तित। 42 यह AFM सॉफ्टवेयर द्वारा स्वचालित रूप से किया जाता है।
    1. घटता की एक एक अणु की घटनाओं, रिकॉर्ड कई सैकड़ों (800-1,500) के साथ एफडी घटता प्राप्त करने के लिए। एक एकल अणु की अवस्था में दो चोटियों प्राप्त करें: पहली शिखर टिप और सतह और सतह के साथ अणु की विशेष बातचीत के बाद दूसरे शिखर मेल खाती बीच अविशिष्ट बातचीत इंगित करता है। जब, एफडी की अवस्था इन दो चोटियों की तुलना में अधिक होते हैं, उन्हें सबसे संभावित बल के हिसाब से त्यागें।
      नोट: केवल एकल आसंजन घटनाओं (10 से घटता के 30% करने के लिए) एक खाते में रखा जाता है। 43
  2. 44 के साथ दूरी घटता गणना करने के लिए लोडिंग दरों, जो तब के histograms की तैयारी के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं का एक सेट प्राप्त करने के लिए स्पष्ट लोडिंग दरों। सब्सट्रेट से अलग होने के बाद ब्रैकट पेप्टाइड्स / अमीनो एसिड और बल में कूदने से सतह के बीच unbinding बलों निकाले जाते हैं।

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Representative Results

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चित्रा 1 टिप संशोधन प्रक्रिया को दर्शाती है। पहले चरण में, एक प्लाज्मा उपचार सिलिकॉन नाइट्राइड टिप की सतह बदल जाता है। टिप ओह समूहों प्रस्तुत करता है। इन समूहों को तो silanes के साथ प्रतिक्रिया होगी। इस कदम के अंत में, टिप की सतह मुक्त राष्ट्रीय राजमार्ग 2 समूहों द्वारा कवर किया जाएगा। इन मुक्त amines तो Fmoc -PEG-एन एच एस, एक सहसंयोजक लिंकर के साथ प्रतिक्रिया होगी। खूंटी लिंकर की Fmoc समूह pipyridine, एक deprotecting अभिकर्मक से निकाल दिया जाता है। अंत में, जांच अमीनो एसिड या पेप्टाइड अणु युग्मन अभिकर्मक HBTU का उपयोग कर खूंटी से मुक्त एमाइन समूह के माध्यम से युग्मित है।

संशोधित AFM टिप के साथ यह अमीनो एसिड या सतह (चित्रा 2) के साथ पेप्टाइड की बातचीत की जांच करने के लिए संभव है। खूंटी अणु सिरे से पेप्टाइड या एमिनो एसिड अलग करती है और उन्हें स्वतंत्र रूप से उन्मुख करने के लिए अनुमति देता है। एक ठेठ बल measuएक बल दूरी की अवस्था में rement परिणाम (चित्रा 3)। यह वक्र सतह से टिप, और एक अणु आसंजन घटना की जुदाई की एक विशेषता बिंदु है। पहली शिखर टिप और सतह और दूसरी चोटी के बीच अविशिष्ट बातचीत इंगित करता विशिष्ट आसंजन घटना को दर्शाता है। कई सौ एफडी घटता से यह आसंजन घटनाओं बल बनाम की संख्या साजिश रचने के द्वारा एक हिस्टोग्राम के निर्माण के लिए संभव है। इन histograms पर एक गाऊसी फिट लागू करने से सबसे संभावित बल (एमपीएफ) का निर्धारण करेगा।

आकृति 1
चित्रा 1: टिप संशोधन प्रक्रिया। AFM टिप के रासायनिक संशोधन की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2: प्रयोगात्मक स्थापना SMFS। अमीनो एसिड या पेप्टाइड्स और एक वांछित सतह के बीच बातचीत को मापने के लिए एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी स्थापना के योजनाबद्ध चित्रण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: सेना-दूरी की अवस्था। एक अभ्रक सतह, और (बी) एमिनो एसिड फेनिलएलनिन से (ए) पेप्टाइड Gln-प्रो-अला-SER-SER-Arg-Tyr का टूटना एक 2 Tio सतह से ठेठ एकल अणु एफडी घटता। सीएलआई कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ सी.के.।

चित्रा 4
चित्रा 4: histograms सबसे संभावित बल (एमपीएफ) साजिश और रेखांकन बल बनाम साजिश लादने की दर। अभ्रक से, (बी (3.1 ± 0.6 एनएन / एस (एन = 7 8) एक लोडिंग दर पर) (ए) पेप्टाइड Gln-प्रो-अला-SER-SER-Arg-Tyr का टूटना बल मूल्यों की विशिष्ट histograms ) 2 Tio से अमीनो एसिड फेनिलएलनिन (4.2 ± 0.7 एनएन / s (दर लोड हो रहा है पर एन = 79))। सबसे संभावित बल (एमपीएफ) मूल्य गाऊसी फिट (काले लाइनों) के आधार पर गणना की गई। (सी) पेप्टाइड Gln-प्रो-अला-SER-SER-Arg-Tyr और (डी) एमिनो एसिड फेनिलएलनिन के लिए टूटना बलों के लिए लोड हो रहा है-दर निर्भरता। गतिज मानकों को स्पष्ट बनाम लोड हो रहा है आर के लघुगणक बल के रैखिक साजिश से extrapolated थेखाया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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कदम 1.3, 1.4 और 1.7 प्रोटोकॉल में व्यापक देखभाल के साथ और एक बहुत ही सौम्य तरीके से बाहर किया जाना चाहिए। 1.3 चरण में, टिप silane मिश्रण और silanization प्रक्रिया माहौल निष्क्रिय (नमी मुक्त) में बाहर किया जाना चाहिए साथ संपर्क में नहीं होना चाहिए। 45 यह आदेश बहुपरत गठन को रोकने के लिए और क्योंकि silane अणुओं आसानी से नमी की उपस्थिति में हाइड्रोलिसिस से गुजरना किया जाता है। 45

1.4 चरण में, तापमान और समय ठीक से रखा जाना चाहिए। 1.5 कदम शुरू करने से पहले, टिप कमरे के तापमान को ठंडा किया जाना चाहिए; अन्यथा यह क्षतिग्रस्त हो जाएगा। युग्मन कदम (1.7) में, HBTU और जांच अमीनो एसिड या पेप्टाइड पूरी तरह से मिश्रण में भंग कर दिया जाना चाहिए। युग्मन के बाद, विभिन्न सॉल्वैंट्स के साथ टिप धोने के एक बहुत ही सौम्य तरीके से किया जाना चाहिए टिप करने के लिए किसी भी नुकसान से बचने के लिए।

सूचना तकनीक Appl हो सकता हैकिसी भी पेप्टाइड या अमीनो एसिड को आइईडी। सिलिकॉन टिप को संशोधित करने के लिए, हम silanes का उपयोग करें। यह सामान्य रसायन शास्त्र जो बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, एक टिप को संशोधित करने PEGylated silane की या तो दो या एक प्रकार का उपयोग कर सकते हैं। 23, 25, 26 टिप सोने का बना होता है, तो thiol समूहों टिप के संशोधन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक प्रोटोकॉल का फायदा उठाने nitrilotriacetate (NTA) -terminated linkers, हिस्टिडीन को निशाना बनाने में सक्षम है, एक साथ पुनः संयोजक हिस्टिडीन टैग प्रोटीन के साथ। हाल ही में, Lyubchenko एट अल। संश्लेषण वर्णित है और एक उपन्यास बहुलक लिंकर की जांच और कई SMFS प्रयोगों में अपने आवेदन दिखाया। लिंकर के संश्लेषण अच्छी तरह से विकसित phosphoramidate (पीए) रसायन विज्ञान पर आधारित है। इस रसायन विज्ञान पूर्व निर्धारित लंबाई और पीए रचना के साथ linkers की दिनचर्या संश्लेषण की अनुमति देता है। ये linkers लंबाई में सजातीय कर रहे हैं और विभिन्न कार्य समूहों के साथ समाप्त किया जा सकता है।इसके अलावा, biomolecules सल्फर परमाणुओं के साथ सोने के रूप सहसंयोजक बांड के रूप में देशी या इंजीनियर thiol समूहों के माध्यम से सोने substrates या सुझाव पर लंगर डाले जा सकता है।

इस विधि बल थोक में एकल अणु के स्तर पर एक सतह से एक अणु छुड़ाना और नहीं की जरूरत की मात्रात्मक और विस्तृत माप की अनुमति देता है। तकनीक का भविष्य अनुप्रयोगों टिप करने के लिए प्रोटीन की कुर्की और नए संकर सामग्री के डिजाइन शामिल हैं। डिजाइन और नए मिश्रित सामग्री और कार्यात्मक सतहों के विकास के प्रोटीन या अकार्बनिक सामग्री के साथ पेप्टाइड्स के बीच बातचीत का एक बुनियादी समझ प्राप्त करने से लाभ होगा। AFM के साथ SMFS के लिए यहाँ प्रदान प्रोटोकॉल प्रोटीन, पेप्टाइड्स और विभिन्न सतहों के साथ अमीनो एसिड के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips Bruker (Camarilo, CA, USA) MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm 
Methyltriethoxysilane  Acros Organics (New Jersey, USA) For Silaylation of the AFM tip 
3-(Aminopropyl) triethoxysilane Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) For Silaylation of the AFM tip
Triisopropylsilane Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) Used for peptide deprotection
N-Ethyldiisopropylamine Alfa-Aesar (Lancashire, UK) Used for tip modification
Triethylamine Alfa-Aesar (Lancashire, UK) Used for tip modification
Piperidine Alfa-Aesar (Lancashire, UK) Used for tip Fmoc deprotection
Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide  (Fmoc-PEG-NHS) Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) Used as the covalent flexible linker  (MW = 5,000 Da)
2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) Alfa Aser (Heysham, England) Used as a coupling reagent. 
N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) Acros Organics (New Jersey, USA) Used as Solvent in Tip modification procedure
DMF (dimethylformamide) Merck (Darmstadt, Germany) Used as Solvent in Tip modification procedure
Chloroform Bio-Lab (Jerusalem, Israel) Used as Solvent in Tip modification procedure
Ethanol (Anhydrous) Gadot (Netanya, Israel) Used as Solvent in Tip modification procedure
Trifluoro acetic acid (TFA) Merck (Darmstadt, Germany)
Acetic anhydride Merck (Darmstadt, Germany)
Peptides GL Biochem (Shanghai, China).
Phenylalanine and Tyrosine  Biochem (Darmstadt, Germany) 
30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) (30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP). Used for TiO2 substrate preparation
Mica substrates TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) 9.9 mm diameter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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एमिनो एसिड और पेप्टाइड्स अकार्बनिक सामग्री के साथ बातचीत में इनसाइट्स एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग
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Das, P., Duanias-Assaf, T., Reches, M. Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (121), e54975, doi:10.3791/54975 (2017).More

Das, P., Duanias-Assaf, T., Reches, M. Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (121), e54975, doi:10.3791/54975 (2017).

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