Summary
Hier presenteren we protocollen voor het kweken van een intermediair-kiem kever, Dermestes maculatus (D. maculatus) in het lab. We hebben ook protocollen voor de embryonale en ouderlijke RNAi en methodes te delen voor het analyseren van embryonale fenotypes voor bestudering van genfunctie in deze soort.
Introduction
In 1998, Fire en Mello meldde dat dubbelstrengs RNA (dsRNA) remming van genfunctie kan induceren in Caenorhabditis elegans 1. Deze reactie veroorzaakt door dsRNA werd genoemd RNA interferentie (RNAi) en dergelijke RNAi-gemedieerde silencing werd gerapporteerd als zijnde geconserveerd in dieren, planten en schimmels 2-7. In planten en sommige dieren, RNAi functies systemisch, wat betekent dat het effect kan zich verspreiden naar andere cellen / weefsels waarbij dsRNA niet rechtstreeks geïntroduceerd (beoordeeld in 8-10). Wetenschappers hebben gebruik gemaakt van deze endogene cellulaire RNAi respons door het ontwerpen van dsRNA's om genen van belang gericht zijn gemaakt, waardoor de functie van genen neerhalen zonder direct het manipuleren van het genoom (beoordeeld in 11-14).
RNAi is een krachtig hulpmiddel voor functionele studies vanwege de volgende voordelen. Eerst, zelfs met minimale informatie gensequentie, een gen kan worden gevist met RNAi. Dit is vooral belangrijk voor studies van niet-model organismen ontbreekt genomische of transcriptomics data. Ten tweede, in organismen waar RNAi respons robuust systemische RNAi-gemedieerde gen knockdown kan worden uitgevoerd op bijna elk ontwikkelingsstadium. Deze functie is zeer nuttig voor het bestuderen van de functie van pleiotrope genen. Ten derde, in sommige gevallen, RNAi effecten uitbreiden tot de gonaden en nageslacht, zodat fenotypes worden waargenomen bij nakomelingen 15,16. Dit fenomeen, bekend als ouderlijke RNAi (pRNAi), is bijzonder voordelig voor genen beïnvloeden embryonale ontwikkeling, talrijke nakomelingen van één ouder geïnjecteerd zonder directe manipulatie eieren kunnen worden onderzocht. Daarom pRNAi is de voorkeurswerkwijze. Indien pRNAi ineffectief, bijvoorbeeld voor genen die nodig zijn voor oogenesis, dan embryonale RNAi (eRNAi) worden gebruikt. Ten vierde kan RNAi worden gebruikt om het equivalent van een allelische reeks, dat de hoeveelheid dsRNA geleverd over een bereik kan worden gevarieerd wekken zwakke produceren sterke gebreken. Dergelijke gradatie van fenotypes kan nuttig zijn voor het begrijpen van genfunctie wanneer het gen is betrokken bij een complex proces en / of volledig verlies van functie dodelijk. Ten vijfde, de levering van dsRNA is over het algemeen gemakkelijk en haalbaar is, met name in dieren die robuuste systemische RNAi reacties. dsRNA kan worden ingevoerd door micro-injectie 1,5, het voeden / inname 17,18, weken, 19,20 en virus / bacteriën gemedieerde aflevering 21,22. Zesde, in tegenstelling tot sommige gentargeting / bewerken werkwijzen hoeft te screenen op organismen die de mutatie of genetische kruisingen aan homozygoten genereren bij gebruik RNAi uitvoeren. Daarom in vergelijking met vele andere technieken voor het bestuderen van genfunctie, RNAi is snel, goedkoop en kunnen worden toegepast voor grootschalige schermen 23-25.
De brede toepasbaarheid van RNAi verschaft middelen functionele studies uit te voeren in een breed scala van organismen, het uitbreiden van het bereik van de soorten beschikbaar voor studie beyond de traditionele modelsystemen waarvoor genetische instrumenten ontwikkeld. Bijvoorbeeld, studies met niet-modelsystemen vereist om inzicht in de evolutie van genen en gen netwerken geven door vergelijking van de functies van orthologen voor soorten van verschillende modes of ontwikkeling vertonen duidelijke morfologische kenmerken 26-29. Deze types van studies zullen een beter begrip van de biologische diversiteit te voorzien, met gevolgen voor zowel toegepast en fundamenteel onderzoek.
Omdat het grootste dier groep op de planeet, insecten zorgen voor een geweldige kans om de mechanismen te onderzoeken onderliggende diversiteit. Bovendien, insecten zijn over het algemeen klein, hebben korte levenscycli, hoge vruchtbaarheid, en zijn eenvoudig aan de achterzijde in het lab. In de afgelopen twee decennia, is RNAi is met succes toegepast bij insecten verspreid over orders, met inbegrip van Diptera (true vliegen) 5, Lepidoptera (vlinders en motten) 30, Coleoptera (kevers) 16,31, Hymenoptera (sawfleugens, wespen, mieren en bijen) 32, Hemiptera (wantsen), Isoptera (termieten) 34, Blattodea (kakkerlakken) 35, Orthoptera (krekels, sprinkhanen, sprinkhanen, en katydids) 36 en Phthiraptera (luizen) 37. Succesvolle toepassing van RNAi heeft verstrekt functionele gegevens voor onderzoek naar patronen in de vroege embryogenese (anterior-posterior as 32, dorsale-ventrale as 28, segmentatie 26,38), geslachtsbepaling 39,40, chitine / cuticula biosynthese 41, ecdyson signalering 42, sociaal gedrag 43, en nog veel meer. RNAi methoden ontwikkeld voor verschillende insectensoorten kunnen bijkomende voordeel dat zij mogelijk bruikbaar voor ongediertebestrijding (herzien 44-46) te zijn. RNAi effecten genspecifieke en soortspecifiek zijn, zolang als niet-geconserveerde gebieden worden gekozen voor targeting. Voor nuttige insecten zoals bijen en zijderupsen, gericht op genen die van vitaal belang voor het voortbestaan vanvirussen of parasieten om besmetting te bestrijden kan een nieuwe strategie om deze soorten te beschermen 47,48 bieden.
Dermestes Maculatus (D. maculatus), gangbare naam hide kever, wordt wereldwijd verspreid, met uitzondering van Antarctica. Als holometabolous insect, de D. maculatus levenscyclus omvat embryonale, larven, pupal en volwassen stadia (figuur 1). Omdat het voedt zich met vlees, wordt D. maculatus gebruikt in musea dode dieren schets maken en forensische entomologen kunt het gebruiken om het tijdstip van overlijden 49,50 te schatten. D. maculatus zich voedt met dierlijke producten zoals kadavers, gedroogd vlees, kaas, en de poppen / cocons van andere insecten en veroorzaakt daarmee schade aan huishoudens, opgeslagen voedsel, en de zijde, kaas en vlees-industrie 51,52. Het toepassen van RNAi in deze kever zou een efficiënte en milieuvriendelijke manier om de economische gevolgen te minimaliseren. Ons laboratorium heeft gebruikt D. maculatus als een nieuwe model insect segmentering 53 bestuderen. Naast het feit dat vatbaar lab fokken, D. maculatus van belang voor fundamenteel onderzoek omdat het een tussenproduct kiem ontwikkelaar, waardoor het een nuttige soorten naar de overgang tussen korte en lange kiem ontwikkeling bestuderen.
Figuur 1: Life Cycle van D. maculatus. Foto's van D. maculatus in verschillende levensfasen, zoals aangegeven. De levenscyclus van ei tot adult bedraagt drie weken bij 30 ° C, maar meer bij lagere temperaturen. (A, F) Vers gelegd embryo's zijn wit tot lichtgeel en ovaal, ongeveer 1,5 mm in lengte. Embryogenese draait ~ 55 uur bij 30 ° C. (B, C en G) Larven hebben donkere gepigmenteerde strepen en zijn bedekt met borstels. Larven gaan door verschillende stadia, afhankelijk van de omgeving en hun lengte kan zich uitstrekken tot meer dan 1 cm. (D, H) (E, I) Kort na eclosion, verschijnt donkere pigmentvlekken op de volwassen kever lichaam. Volwassenen kunnen leven tot enkele maanden en een vrouwtje kan honderden embryo's lag over haar leven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Eerder toonden we aan dat RNAi is effectief in het neerhalen gen-functie in D. maculatus 53. Hier onze ervaring fokken D. maculatus kolonies in het laboratorium wordt gedeeld met stap-voor-stap protocollen voor zowel embryonale en ouderlijke RNAi set-up, injectie, na de injectie zorg en fenotypische analyse. De dsRNA-gemedieerde gen knockdown en analysemethoden hier geïntroduceerd bieden niet alleen gedetailleerde informatie voor de aanpak van vraagstukken in D. maculatus, maar ook potentiële betekenis for toepassing van RNAi in andere niet-model kever / insectensoorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het grootbrengen van D. maculatus
LET OP: Een kolonie van D. maculatus werd opgericht in het lab van de auteurs met behulp van volwassenen en larven gekocht commercieel. De soort identiteit werd gecontroleerd met behulp van DNA-barcoding 53.
- Het opzetten van een nieuwe kooi in het lab, verspreid een dun laagje houtkrullen in een middelgrote insect kooi (30,5 x 19 x 20,3 cm 3). Plaats een ~ 10 x 6 x 3 cm 3 brok piepschuim in de kooi om larven verbergen voor de verpopping laten. Voeg 20-50 kevers (zowel volwassenen of late instar larven). Kevers zal verbergen in de houtkrullen.
- Voeg nat kattenvoer in een petrischaal of een gewicht van de boot. Bedek de kooi met mesh doek en plaats de kooi in een couveuse.
- Voor het behoud van een broedkolonie in het lab, de temperatuur tussen de 25 en 30 ° C. D. maculatus groeit sneller bij hogere temperaturen, maar bevordert ook de groei van schimmels en mijten. Het handhaven van een te genezenthy kolonie Gebruik 25-28 ° C voor regelmatig onderhoudscentra en 30 ° C voor snel groeiende kolonie. De levenscyclus duurt ongeveer drie weken tot vier maanden, afhankelijk van omgevingsfactoren 50 (figuur 2).
Figuur 2: D. maculatus Lab Colony. Foto van een typische D. maculatus insect kooi wordt getoond. Houtkrullen zijn verspreid te laten de kevers te verbergen. Kattenvoer wordt toegevoegd in een kleine petrischaal of een gewicht van de boot. Styrofoam is geplaatst in de kooi als een toevluchtsoord voor de uiteindelijke instar larven verpoppen. De hier getoonde kooi is 30,5 x 19 x 20,3 cm 3 en herbergt een paar honderd larven, poppen en volwassenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Leave eieren in de kooi te rijpen. Om de kolonie uit te breiden, nieuwe kooien vast met eieren (verzameld zoals beschreven in paragraaf 2), larven, of volwassenen, zoals hierboven. D. maculatus leggen eieren in de hele kooi, vooral in de buurt van de bron van voedsel.
- Vervang nat kattenvoer ongeveer twee keer per week.
LET OP: Als gevolg van de onaangename geur van nat kattenvoer, werden alternatieve voedselbronnen ook getest (zie Discussie).
2. Embryo Collection
- Voor het instellen van een verzameling, scheiden minstens 50 mannen en 50 vrouwen uit de kolonie. Jongvolwassenen zijn best. Plaats volwassenen in een mini-sized kooi (17,8 x 10,2 x 12,7 cm 3) zonder houtkrullen. Voeg kattenvoer in een gewicht van de boot.
- Voordat u begint collectie, controleer dan de kooi zorgvuldig voor eventuele aanwezige embryo's en verwijder ze. Zet een uitgerekte katoenen bal in de kooi, en laat de kooi in een 30 ° C incubator. Na het juiste tijdvenster, zal de katoenen bal klaar voor de embryo collectie.
- Vouweneen stuk zwarte bouw papier (A4-formaat) in de helft om een plooi te maken, en dan ontvouwen.
- Verwijder de uitgerekte katoenen bal uit de kooi. Verwijder volwassenen uit de katoenen bal en zet ze terug in de kooi.
- Terwijl knijpen de uitgerekte katoenen bal heel voorzichtig, scheur het uit elkaar langzaam in dunne katoenen draden te laten de eieren vallen op het zwarte papier.
OPMERKING: D. maculatus embryo's zijn kwetsbaar en moeilijk te zien in katoen. Ze kunnen gemakkelijk worden verpletterd als die de watten te hard.
3. dsRNA Voorbereiding
- DNA Template Voorbereiding voor dsRNA Synthesis
- Run 4-6 50 pi PCR-reacties met gebruik van primers die T7 promoter sequenties aan beide 5'-uiteinden te amplificeren DNA-matrijs volgens het protocol van de fabrikant.
- Zuiver PCR product op een commerciële PCR zuivering kit volgens de instructies van de fabrikant. De ideale eindconcentratie van DNA-matrijs is ≥100 ng / ul.
- Injectie Buffer Voorbereiding
- Bereid 100 ml injectie buffer (0,1 mM NaH 2PO 4, 5 mM KCl). Stel de pH tot 6,8 met 5 M NaOH.
- WINKEL aliquots bij -20 ° C.
- dsRNA Synthesis
- Opzetten van een reactie in een 0,2 ml PCR buis op ijs en voeren een in vitro transcriptiereactie met T7 polymerase, volgens de instructies van de fabrikant, met behulp ~ 500 ng sjabloon per reactie.
- Incubeer de buis bij 37 ° C overnacht.
- Digest het DNA sjabloon met DNase, volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwarm de buis tot 94 ° C en houden op 94 ° C gedurende 3 min.
- Het dsRNA annealen langzaam afkoelen van de buis 1 ° C / min totdat het 45 ° C na 1 uur bereikt.
OPMERKING: Stappen 3.3.2 tot 3.3.5 kan worden uitgevoerd in een thermocycler. - Om neerslag van dsRNA ethanol, voeg 280 ulRNase-vrij water tot 20 ul van de reactie aan te passen aan een eindvolume van 300 pl. Voeg 30 gl 3 M NaOAc (pH 5,2) en 650 ui ethanol. Plaats de buis in -20 ° C vriezer gedurende de nacht.
- Na centrifugeren bij 15.682 xg gedurende 30 min bij 4 ° C, was de dsRNA pellet met 70% ethanol. Droge pellet en lossen in 20 pi injectie buffer.
- Meet de concentratie van het dsRNA met behulp van een spectrofotometer bij A260. De ideale concentratie 3-5 ug / ul. De kwaliteit door het uitvoeren van 5 ui van een 1:25 verdunning van dsRNA op een 1% agarose gel bij 90 V gedurende 30 minuten. Een enkele band van de verwachte grootte zal goed zichtbaar zijn.
- Bewaar de dsRNA bij -20 ° C of kouder.
OPMERKING: Verzamel RNAi knockdown experiment een controleorgaan dsRNA, die niet kan worden verwacht dat de werkwijze bestudeerd beïnvloeden. GFP dsRNA is een uitstekende controle voor de meeste experimenten. Voorbereiden en injecteer de controle dsRNA side-by-side met de experimental dsRNA.
4. Montage van microinjector en micromanipulator
OPMERKING: Zie afbeelding 3.
- Sluit stikstof of andere luchttoevoer naar de drukingangswaarde van een pneumatische pomp instrument. Als een pneumatische pomp niet beschikbaar is, druk uitoefenen met behulp van een 50 ml spuit verbonden met fijne buizen.
- Sluit een voetschakelaar naar de externe connector van de pomp naar de uitwerpknop druk te regelen.
- Bevestig een glazen capillaire houder van de eject druk poort van de pomp met buis.
- Bevestig de capillaire houder op een micromanipulator in de buurt van een dissectie microscoop.
5. Embryonale RNAi
OPMERKING: Figuur 4 toont een stroomdiagram van D. maculatus embryonale RNAi.
- eRNAi Voorbereiding
- Bereid een embryo verzamelen petrischaal deksel (90 mm diameter). Leg een stuk zwarte filter papier cover de binnenkant van het deksel. Zet een standaard microscoopglaasje op het zwarte papier.
- Verdun dsRNA passende concentratie injectie buffer. Gebruik 2-3 gg / gl voor initiële experimenten. Altijd dsRNA op ijs voorafgaand aan de injectie.
- Voeg kleurstof bij 1:40 verdunning van de dsRNA en pipet voorzichtig in enkele keren goed te mengen.
- Het verzamelen van embryo's voor Injectie
OPMERKING: Bij 25 ° C, kernen in embryo 6-8 uur na eierleggende (AEL) migreren naar de periferie ei 53. Een cellulair blastoderm is gevestigd binnen 8 - 10 uur AEL 53. Ter controle embryo vóór cellulaire blastoderm fase worden gebruikt voor injectie, 0-3 uur AEL embryo worden aanbevolen voor gebruik 53. Embryo collectie, voorbereiding en de injectie meestal minder dan 2 uur als het glas haarvaten zijn in goede vorm. Daarom kan het hele proces binnen 5 uur AEL voltooid.- Verzamel embryo's zoals beschreven in de stappen 2.2-2,5.
- Tik op de zwarte bouw papier om embryo's te zetten in het verzamelen petrischaal deksel.
- Plak dubbelzijdig tape langs de rand van de dia.
- Met behulp van een kwast, breng de embryo's op de band loodrecht op de dia rand met de voorste of achterste einde aan de rand. Merk op dat de voorste en achterste einden van vroege embryo's niet gemakkelijk te onderscheiden, waardoor gemiddeld de helft wordt geïnjecteerd aan het achterste uiteinde ideale.
- Het laden van de dsRNA in de glazen capillaire
- Neem 2-4 ul van dsRNA in een 20 ul microloader pipet tip.
- Steek de punt in een vooraf getrokken glazen capillaire (hierna naald) en voorzichtig pipet het dsRNA oplossing in de capillair. Bereid naalden van commerciële glas haarvaten met behulp van een micropipet trekker. Een voorbeeld van een ideale getrokken naald is getoond in figuur 5. De lengte en tapsheid van naalden moet mogelijk af worden geoptimaliseerdter injectie trials.
- Bevestig de glazen capillair in het glas capillair houder.
- Monteer de capillaire houder in de micromanipulator.
- DsRNA injecteren in embryo
- Breng voorzichtig de dia met embryo's op het podium van het ontleden microscoop.
- Verplaats de schuif om één embryo naar het midden van het veld en de focus microscoop te brengen.
- Plaats de punt van het capillair met de micromanipulator, terwijl op zoek naar de microscoop ontleden. Breng het uiteinde dicht bij het einde van de eerste embryo in de rij.
- Schakel de stikstof of andere luchttoevoer.
- Stel de elektromagnetische ingang keuzeschakelaar op vacuüm.
- Stel de eject drukregelaar tot 10-15 psi. Stel de druk afhankelijk van de inrichting.
- Open de capillaire indien nodig. Zodra het uiteinde open is, zal de gekleurde dsRNA oplossing de punt te vullen.
- Beweeg de capillaire tip uit naar de e doorborenmbryo. Als de insteldruk ideaal worden geen embryonale fluïdum stroomt in de capillair.
- Stap op de voetschakelaar dsRNA oplossing werpen in het embryo tot een vereiste hoeveelheid oplossing wordt uitgeworpen. Figuur 5 toont voorbeelden van embryomorfologie na geschikte en ongeschikte hoeveelheden oplossing zijn ingespoten.
- Houd de capillaire tip binnen het embryo voor ~ 2 sec, en verwijder deze dan.
- Verplaats het capillair naar de volgende embryo en herhaal de stappen 5.4.8 - 5.4.10 tot alle embryo's worden geïnjecteerd. Verander glazen capillair wanneer het verstopt raakt of breekt.
- Post-injectie Recovery en Incubation
- Na injectie, plaats de dia in een petrischaal.
- Voeg een natte katoenen bal naar de petrischaal. Laat je niet door de katoenen bal raakt de dia.
- Dek de petrischaal en wikkel het met afdichtende film. Label de schotel met de naam van de dsRNA, concentratie, datum, tijd, en het aantal geïnjecteerdeembryo.
- Plaats de petrischaal in een 30 ° C incubator totdat de embryo's doorgeefluik.
6. Parental RNAi
- Isoleren Poppen voor pRNAi
- Verzamel poppen uit de kolonie.
- Sorteren mannelijke en vrouwelijke poppen onder de microscoop (zie figuur 6). Houd ze in twee afzonderlijke petrischalen in een 30 ° C incubator zodat geen paring plaatsvindt vóór injectie.
- Controleer elke dag voor Bijlage In volwassenen. Verpopping duurt meestal 5-7 dagen bij 30 ° C.
- Transfer Bijlage In mannen en vrouwen (zie figuur 6) twee afzonderlijke petrischaaltjes en hen voeden kattenvoer om de andere dag tot ze klaar zijn voor injectie.
- Ga verder met de injectie zodra er genoeg vrouwen en mannen op de juiste leeftijd. Vrouwtjes 4-8 dagen na verpopping zijn best. Voor een typische analyse, 8 - worden 12 vrouwen gebruikt. Een gelijk aantal mannen zijn nodig voor het koppelen 54.
- Bereid dsRNA op ijs (5.1.2 en 5.1.3).
- Bevestig een 32-gauge naald tot een 10 gl spuit.
- Verdoven vrouwtjes op CO 2 het podium.
- Laad dsRNA oplossing in de spuit, zonder toegang tot alle lucht.
- Houd een vrouwelijke ventrale zijde naar boven met de ene hand en houd de spuit met de andere.
- Zachtjes dringen de segmacoria (membraan) tussen sternites 2 en 3 met de punt van de naald. Figuur 7 toont een vrouwelijke tijdens de injectie. Als de naald het weefsel niet gemakkelijk penetreren, de hoek van de naald naar boven en drukt u langzaam. Plaats ongeveer 2 mm van de naald in het lichaam.
- Controleer de spuit schaal, terwijl de zuiger langzaam te duwen, het injecteren van ~ 2 pl per vrouw.
- Na het injecteren, houd de naald nog steeds minstens 5 seconden voordat u deze uit de buik van het vrouwtje.
- Breng de geïnjecteerde vrouwtjes naar een petrischaal (90 mm diameter) en te voeden met kattenvoer.
- Label de petrischaal met de dsRNA naam, hoeveelheid ingespoten, de datum en het aantal vrouwen.
- Post-injectie Recovery and Mating
- Incubeer de petrischaal in een 30 ° C incubator.
- Na 24 uur, de overdracht geïnjecteerd vrouwtjes om een mini kooi.
- Toe te voegen aan de kooi een gelijk aantal niet-geïnjecteerde jonge mannen, en het etiket van de kooi.
- Voeg een wegende boot met kattenvoer in de kooi.
- Laat de kooi in een 30 ° C incubator om paring toe te staan. Na 24 uur moet beginnen vrouwtjes eieren leggen en embryo kan worden verzameld dagelijks of op gewenste tijdstippen.
7. Fenotypische analyse na RNAi
OPMERKING: Bij 30 ° C duurt ongeveer 55 uur om te broeden eieren 50.
- eRNAi levensvatbaarheid Analyse
- Bereken uitkomstpercentage het aantal uitgekomen larven tegenover het volledig number van geïnjecteerde embryo. Zorg ervoor dat u een negatieve controle injectie te nemen als embryo's kunnen worden geschaad of gedood door de injectie procedure. Typische luik tarieven variëren van 30% - 60%. Pas uitgekomen larven eten unhatched eieren.
- pRNAi levensvatbaarheid Analyse
LET OP: Als vrouwelijke levensvatbaarheid wordt beïnvloed door het gen doelwit van RNAi, vrouwen ingespoten met specifieke dsRNA maar niet negatieve controle dsRNA zal beginnen te sterven. Als de productie van eieren of eieren leggen wordt beïnvloed, zal vrouwtjes gedeeltelijke of volledige steriliteit vertonen. Score vrouwelijke overleving in vergelijking met de negatieve controles en vergelijken het totale aantal gelegd door de experimentele en controle vrouwen (7.2.3) eieren.- Het opzetten van embryo volgende stap 2.2.
- Na 24 uur, het verzamelen van embryo's volgende stappen 2,4-2,5.
- Tel het totale aantal embryo's.
- Breng de embryo's een 90 mm petrischaal. Label de petrischaal met het gen gerichte, ophaaldag, en het aantal embryo's. Incubeer de embryo's in een 30 ° C incubator totdat ze uitkomen. Sinds uitgekomen larven voeden zich met unhatched embryo's, check de petrischaal vaak en apart uitgekomen larven van unhatched embryo behulp van een tang (zie Discussie).
- Tel het aantal uitgekomen embryo's en bereken het luik tarief.
- Het onderzoeken van de opperhuid Defecten in uitgekomen larven
- Verzamel uitgekomen larven in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
- In een zuurkast, voeg 1 ml Fixation Solution.
- Laat de microcentrifugebuis bij 4 ° C ten minste gedurende de nacht laten doordringen in de oplossing larvale weefsel.
- Visualiseren, verwijder zoveel fixatief van de buis mogelijk te maken.
- Spoel larven minstens drie maal met PBST.
- Transfer larven een multiwell-glasplaat met PBST met een P-1000 pipetpunt met het afgesneden einde te verbreden.
- Onder een microscoop ontleden, strek larven met behulp van een tang om gebreken te onderzoeken. ikt is van cruciaal belang uit te strekken larven gebreken als hun lichamen contract in fixatief te onderzoeken.
- Het onderzoeken van de opperhuid Defecten in Unhatched Larven
Opmerking: Deze procedure is bruikbaar voor de behandeling van vroege embryonale fenotypes, vooral voor embryo's die niet overleven tot uitkomen.- Voor pRNAi, voeg PBST in de petrischaal (7.2.4) en breng unhatched's naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met een P-1000 pipetpunt met het uiteinde afgesneden. Voor eRNAi, voeg PBST in de petrischaal (5.5.4), borstel unhatched embryo's van de microscoop glijbaan en overbrengen naar een microcentrifugebuis.
- Bevestig de embryo's met Fixation Solution en spoel ze met PBST voor visualisatie volgende stappen 7.3.2 - 7.3.6.
- Met behulp van een tang, ontleden embryo's uit de eierschaal onder een dissectie microscoop in PBST.
- Breng de embryo naar 1,5 ml microcentrifugebuis (~ 200 ul van embryo's in elke buis).
- Verwijder zoveel solution mogelijk.
- Voeg 1 ml 90% melkzuur / 10% EtOH. Laat de centrifugebuis in een 60 ° C incubator tenminste nacht.
OPMERKING: Embryo's kunnen worden gelaten bij 60 ° C gedurende enkele dagen. - De embryo mount, pipet ze op een microscoopglaasje met een P-1000 pipetpunt met het uiteinde afgesneden.
- Handmatig positioneren van de embryo's met een tang om een ideale oriëntatie.
- Bedek de embryo's met een cover-slip en te visualiseren onder de microscoop met behulp van DIC.
- Het onderzoeken van Cellulaire en Moleculaire defecten
OPMERKING: Deze procedure is handig voor het onderzoeken van de onderliggende oorzaken van de cuticula fenotypes of dodelijkheid dat niet gepaard gaat met cuticula gebreken.- Voor pRNAi, aparte embryo's uit katoenen ballen op de juiste ontwikkelingsfase en breng ze in een embryo verzamelen mand. De opvangbak kan hetzelfde of vergelijkbaar met die toegepast voor Drosophila embryo collections.
- Makende eimand uit een 25 ml plastic scintillatiebuisje met de bodem van het flesje verwijderd en een cirkel gesneden uit het deksel (ca. 1 cm diameter). Plaats een cirkel van super fijn gaas ongeveer 2,5 cm in diameter binnenkant van het deksel, en dan schroef de scintillatieflesje op en gebruik ondersteboven.
- Aangezien het gaas gemakkelijk kan worden verwijderd zodra de embryo gewassen, dompel de maas in een microcentrifugebuis met water om embryo vasthouden aan de maas terug.
- Voor eRNAi op passend stadium, voeg PBST aan de petrischaal. Borstel de embryo's van de microscoop glijbaan en overbrengen naar een embryo verzamelen mand.
OPMERKING: Fixatie, in situ hybridisatie, antilichaam kleuring en nucleaire kleuring protocollen is te vinden in Xiang et al. 2015 53.
- Voor pRNAi, aparte embryo's uit katoenen ballen op de juiste ontwikkelingsfase en breng ze in een embryo verzamelen mand. De opvangbak kan hetzelfde of vergelijkbaar met die toegepast voor Drosophila embryo collections.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lab van de auteurs heeft RNAi-technologie wordt gebruikt om de functionele evolutie van genen die segmentatie bij insecten 53,55 bestuderen. Terwijl alle insecten zijn gesegmenteerd, de genen die dit proces verschijnen tijdens insect stralingen 26,38,56-63 te zijn gedivergeerd. Genetische schermen in Drosophila identificeerde een reeks van negen pair-rule segmentatie genen die verantwoordelijk zijn voor het bevorderen van de vorming van het lichaam van de segmenten 64-70 zijn. Hier, de ortholoog van één van deze genen, gecombineerd (PRD), wordt gebruikt om de bruikbaarheid van RNAi document voor het bestuderen van genfunctie in D. maculatus.
eRNAi en pRNAi werden elk effectief in het aantonen van rollen voor Dmac - PRD in formatie segment in deze soort. 2-3 gg / gl dsRNA ontworpen targeten Dmac - PRD (Figuren 8B, 8D en 8F GFP dsRNA geïnjecteerd als negatieve controle (Figuur 8A, 8C en 8E).
Controle nakomelingen uitgekomen met een gepigmenteerde streep per segment. Naburige gepigmenteerde strepen gescheiden door een niet-gepigmenteerde spleet (figuur 8A). Na prd pRNAi, aangetaste nakomelingen uitgebroed met gesmolten naburige gepigmenteerde strepen, met vermelding van gesegmenteerde grenzen waren defect (figuur 8B). Afhankelijk van fenotypische strengheid, één of meerdere fusies werden gedetecteerd in aangetaste larven. Toch fusies consequent verscheen op de grens gebieden tussen T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, met vermelding van pair-rule-achtige defecten. Cuticula fenotypes na PRD knock-down toonde verlies van abdominale segmenten alsook verkorte lichaamslengte (Figuur 8D). Spikkelspanner (Nl) antilichaam kleuring werd uitgevoerd om de moleculaire defecten in het begin van onderzoekenembryo's na PRD knockdown. Terwijl de controle embryo's vertoonden gestreept En expressie met dezelfde intensiteit in elk segment (figuur 8e), werd gereduceerd En expressie gedetecteerd in afwisselende strepen bij nakomelingen van Dmac-PRD dsRNA geïnjecteerd vrouwen (sterretjes in figuur 8F). Het patroon van verminderde En expressie consistent is met de defecte cuticula patroon aanwezig in aangetast larven. Voor meer gedetailleerde resultaten van fenotypes na PRD knock-down in D. maculatus, zie Xiang et al. 2015 53.
Figuur 3: injectieapparaat. Foto van de dissectie microscoop en micromanipulator gebruikt om D. maculatus embryo's te injecteren wordt getoond. Stikstoftoevoer is verbonden met de druk ingangspoort van een pneumatische pomp. Glazen capillair houder is aangesloten op de eject druk van de pomp. Voetschakelaar is verbonden met de pomp. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: een stroomschema voor D. maculatus Embryonale RNAi. (AD) Het verzamelen van embryo's voor injectie. De wijfjes leggen embryo's (oranje) in katoenen ballen (grijze cirkel). Aparte embryo's uit katoenen ballen en laat ze vallen op een stuk zwarte bouw papier. Witte balken geven tranen in katoenen bal. Transfer embryo's tot een verzamelen petrischaal deksel, bekleed met zwart papier. (E, F) Het injecteren van dsRNA tot embryo's. Lijn embryo's op dia's op dubbele plakband en injecteer hen individueel onder een dissectie microscoop. Naald met groen voedsel kleurstof wordt getoond. (GJ) Post-injectie herstel en incubatie. Plaats een natte katoenen bal in de petrischaal om vocht te voorzien. Dek de petrischaal en wikkel het met afdichting film (lichtblauw). Plaats de petrischaal in een couveuse en verwijder uitgekomen larven voor fenotypische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Good vs Bad Embryonale Injection voorbeelden. (A) geïnjecteerde embryo. (B) Embryo geïnjecteerd met te weinig dsRNA. (C) Embryo geïnjecteerd met de juiste hoeveelheid dsRNA. (D) Broken embryo met overvolle dsRNA veroorzaakt door over-injectie. Kleurstof werd toegevoegd aan dsRNA voor visualisatie. (E) Voorbeelden van getrokken capillairen gebruikt als naalden voor injectie. Let op de taper en tip lengte fof twee voorbeelden van functionele naalden. Schaal bars voor AD vertegenwoordigen 200 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Mannelijke en Vrouwelijke volwassenen en poppen. (A) Ventraal aanzicht van een mannelijke pop. (A ') Vergroting van het achterste deel van A. (A ") Illustratie van de mannelijke pop genitaliën. (B) Ventraal aanzicht van een vrouwelijke pop. (B) Vergroting van het achterste deel van B. vrouwelijke poppen hebben twee genitale papillen (wit pijlen). (B ') Illustratie van de vrouwelijke pop genitaliën. (C) Ventraal aanzicht van een mannelijke volwassene. (C) Vergrote weergave van de achterste deel van C. Merk op dat de mannelijke volwassenen trident-achtige genitaliën en eencirkelvormige kwab-achtige structuur op de 4 e sternite (wit en zwarte pijlen, respectievelijk). (D) Ventraal aanzicht van een vrouwelijke volwassene. (D) vergroot beeld van achterste deel D. Voor alle panelen schaal balken geven 1 mm. Voor meer informatie, zie Xiang et al. 2015 53. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Een vrouwelijke tijdens de injectie. Vrouwtjes worden verdoofd en geplaatst ventrale kant naar boven. Een naald penetreren van de segmacoria tussen de 2e en 3e sternites om dsRNA injecteren wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Representatieve Phenotypes na Dmac-prd pRNAi. (A) Controle injectie. Zijaanzicht van een gearceerde wild-type-achtige GFP pRNAi nakomelingen met drie thoracale segmenten en tien abdominale segmenten. Elk segment heeft setae en gepigmenteerde strepen. (B) Zij mening van een gearceerde PRD pRNAi nakomelingen. De kloof tussen het label naburige gepigmenteerde strepen wordt vernauwd of volledig ontbreekt. (C) Cuticula fenotype van een unhatched controle wild-type-achtige embryo. (D) Cuticula fenotype van een unhatched PRD pRNAi nakomelingen met minder abdominale segmenten. (E, F) ontleed germband uit: (E) Control, GFP pRNAi heeft gelijkmatig En uitgedrukt in elk segment, is (F) PRD pRNAi, En expressie verlaagd in afwisselende segmenten (sterretjes). Voor alle ruitls, schaal balken geven 500 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl een klein aantal geavanceerde modelsystemen (muizen, vliegen, wormen) werden ontwikkeld tijdens de 20 e eeuw, heeft de 21e eeuw gezien een golf van nieuwe dierlijke systemen worden ontwikkeld in laboratoria over de hele wereld. Deze nieuwe systemen kunnen wetenschappers vergelijkende, evolutionaire vragen die niet kunnen worden gesondeerd met behulp van alleen de 'standaard' modelsystemen te pakken. Deze implementatie van nieuwe modellen vereist de snelle ontwikkeling van methoden voor het laboratorium kweken, gen identificatie en functionele benaderingen in nieuwe soorten. Hier, procedures voor het opfokken D. maculatus in het laboratorium en stap-voor-stap protocollen voor embryonale RNAi, ouderlijke RNAi en fenotypische analyse in dit kever gepresenteerd. Het doel is dat deze beschrijvingen anderen aanmoedigen D. maculatus in hun eigen experimenten en het gebruik van de hier gepresenteerde benaderingen bij aanvullend nieuw model soorten ontwikkelen.
Terwijl D. maculatus lab kolonies zijn ongelooflijk gemakkelijk te onderhouden, een beperking van het houden van deze soort is de onaangename geur van de natte kattenvoer gegeven aan de kevers als hun bron van voedsel. Om dit te voorkomen, alternatieve voedingsmiddelen, zoals wei / soja-eiwit poeder, kaas, gemalen hondenvoer, en melkpoeder, werden getest met of zonder natte katoen luchtvochtigheid veranderen. Grond hondenvoer was het meest effectief alternatief en kan worden gebruikt voor normale kolonie voeden. Survival was uitstekend (> 90%) van ei tot volwassen in kooien gehouden op net droog hondenvoer in 80% relatieve vochtigheid, met of zonder natte katoen toegevoegd. Echter, de aanvulling van dit dieet met natte kattenvoer bij het verzamelen van eieren om vruchtbaarheid te verhogen kan nodig zijn bij het verzamelen van grote aantallen eieren. Als hondenvoer wordt gebruikt, moet de oude voedsel regelmatig worden verwijderd, zoals airconditioning hondenvoer bleek te remmen ei leggen 54. Hondenvoer brokjes (KR, voorlopige resultaten), kurk, hout, papier en andere materialen kunnen ook worden gebruikt als toevluchtsoorden 71.Interessant is dat de biologische afbraak van piepschuim met behulp van meelworm keverlarven gemeld 72. Daarom werd deze getest D. maculatus larven. Jonge D. maculatus larven overleefde tot volwassenheid met slechts Styrofoam of asbesthoudende materialen en natte katoen (gegevens niet getoond), maar de vraag of ze eten en te verteren die materialen te bepalen blijft.
Dit rapport is het eerste gedetailleerde protocol voor het uitvoeren van functionele genetische studies in D. maculatus. Het gebruik van RNAi hier vormt een uitbreiding van deze techniek een nieuw modelsysteem. Verscheidene specifieke opmerkingen zijn opgemerkt met betrekking tot RNAi knockdown experimenten D. maculatus en andere niet-modelsoorten. Enerzijds moeten verzekeren dat RNAi effectief D. maculatus, van dezelfde stam van D. maculatus hier gebruikt moet worden toegepast wordt. Er zijn aanwijzingen uit Tribolium castaneum dat verschillende stammen blijkt variatie in RNAi phenotypes 24,73, en mutante fenotypes vertonen vaak afhankelijkheid van genetische achtergrond in modelsoorten 74-76. Er is anekdotisch bewijs voor stam-afhankelijkheid bij andere protocollen, zoals in situ hybridisatie. Ten tweede, de juiste timing van de injectie is van cruciaal belang voor een succesvolle RNAi in D. maculatus. Enigszins counterintuitively, is de meest segmacoria groot gemak na de cuticula volledig sclerotized ten minste twee dagen na Eclosion. Daarom maagdelijke vrouwtjes 4 - moet 8 dagen na Eclosion worden gebruikt. Oudere vrouwen ervaren lagere vruchtbaarheid dan pas Bijlage In vrouwtjes en zijn dus niet geschikt voor injectie. Ten derde, geïnjecteerde dsRNA kunnen krijgen geduwd door de inwendige druk van de vrouwelijke buik. Om de mogelijkheid van het verliezen van een grote hoeveelheid dsRNA na injectie een minimum te beperken, houdt u de naald in de buik voor ~ 5 sec na de injectie en verwijder deze dan langzaam (6.2.8). Ondertussen, vermijd het indrukken van de buik van het vrouwtje tijdens of kortna injectie. Tot vertekende resultaten veroorzaakt door dit probleem te omzeilen, injecteren minstens 8 vrouwen voor elke dsRNA voldoende nakomelingen (dagelijks ~ 200 embryo's) te krijgen voor fenotypische analyse. Ten vierde, ei hoge opbrengst belang om onpartijdige data voor fenotypische analyse na injectie. Gemiddeld elke D. maculatus vrouwelijke produceert ongeveer 35-55 embryo's per dag. Ei rendement is afhankelijk van de grootte van de bevolking, vrouwelijke leeftijd, vochtigheid, de beschikbaarheid van voedsel, de temperatuur (gegevens niet getoond), en andere omgevingsfactoren 54. Meestal, vrouwtjes leggen meer bij 30 ° C is dan 25 ° C. Ten vijfde, kan unhatched embryo's worden gekannibaliseerd door larven. Zoals uitgekomen larven zijn meestal wild-type-achtige of slechts licht aangetast, terwijl uitgekomen embryo's zijn meestal meer zwaar getroffen, kan deze gewoonte van D. maculatus larven vertekende resultaten in een kwantitatieve fenotypische analyse veroorzaken. Derhalve is verwijdering van larven zo vroeg mogelijk sterk aanbevolen.
Ons laboratorium heeft zich gericht op D. maculatus segmentatie, hoewel vele aspecten van deze soort, waaronder fysiologie, ecologie, en ongediertebestrijding-zijn van groot belang. Voor het bestuderen embryogenese en segmentatie kan een reeks donkergekleurde strepen aan de rugzijde van D. maculatus larven dienen als natuurlijke merker voor abnormale ontwikkeling. Ook kunnen kenmerkende setae verankerd op de gepigmenteerde strepen van larven worden gebruikt als een indicatie segmenten. Deze morfologische kenmerken, samen met de bevinding dat licht of matig risico embryo kan overleven uitkomen, zijn de voordelen van D. maculatus model om de mechanismen betrokken bij patroonvorming het basislichaam planstudie.
Tenslotte, het belang van het uitvoeren van een sterk gecontroleerde experimenten, waaronder een negatieve controle zoals GFP-dsRNA en testen van twee niet-overlappende doelgebieden voor elk gen-kritisch onjuiste interpretatie door effects van de injectie per se en off-target effecten. Voor D. maculatus, 4-6 ug (2 pl van 2 of 3 ug / ul) dsRNA waren geïnjecteerd in elk vrouwtje en dsRNA was 200-250 bp lang. Bedragen en andere details van het protocol moet mogelijk worden geoptimaliseerd als targeting genen later functioneren in ontwikkeling of in verschillende fysiologische / metabole processen. Eerdere ontdekkingen aangetoond dat RNAi effecten kunnen worden doorgegeven aan volgende generaties dan de F1 generatie in C. elegans 15. Een minderheid van de uitgekomen D. maculatus larven met segmentering beschadigingen als gevolg van RNAi kunnen overleven tot de volwassenheid en kan reproduceren. Voorlopige experimenten nagelaten duidelijke gebreken in de F2-generatie te onthullen. Toekomstige studies kunnen transgenerational effecten van RNAi in deze soort te onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dermestes maculatus live beetles | Our lab or Carolina Biological Supply | #144168 | Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out |
| Wet cat food | Fancy Feast | Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Dry dog food | Purina Puppy Chow | Can buy at most pet food and grocery stores | |
| Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) | Exo Terra | PT2260 | For colony maintenance. Can use larger cage if needed |
| Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) | Exo Terra | PT2250 | For embryo collection |
| Petri dish | VWR | 89038-968 | |
| Cotton ball | Fisher | 22-456-883 | |
| Megascript T7 transcription kit | Fisher | AM1334 | For 40 reactions |
| Pneumatic pump | WPI | PV830 | |
| Capillary holder | WPI | ||
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| Black filter paper (90 mm) | VWR | 28342-010 | |
| Food coloring (green) | McCormick | ||
| Borosilicate glass capillary | Hilgenberg | 1406119 | |
| Needle puller (micropipette puller) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope glass slide | WorldWide Life Sciences Division | 41351157 | |
| Sealing film (Parafilm M) | Fisher | 13-374-12 | |
| Model 801 Syringe (10 µl) | Hamilton | 7642-01 | |
| Needle (32-gauge) | Hamilton | 7762-05 | |
| Fixation Solution (Pampel's) | BioQuip Products, Inc. | 1184C | Toxic, needs to be handled in fume hood |
| Forcep (DUMONT #5) | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) | Globe Scientific | 1415-15 | |
| Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip | Fisher | E5242956003 | |
| Dissecting microscopy for embryo injection | Leica | M420 | |
| Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization | Zeiss | SteREO Discover. V12 | |
| DIC microscopy | Zeiss | AXIO Imager. M1 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
- Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
- Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
- Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
- Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
- Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
- van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208 (2004).
- Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
- Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
- Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
- Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
- Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
- Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
- Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
- Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
- Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
- Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
- Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
- Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
- Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
- Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822 (2015).
- Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
- Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674 (2015).
- Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
- Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
- Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
- Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
- Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
- Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
- Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
- Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
- Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
- Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
- Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
- Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
- Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440 (2014).
- Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
- Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602 (2012).
- Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
- Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
- Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
- Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
- Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
- Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
- Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
- Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
- Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
- Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
- Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
- Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
- Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32 (2015).
- Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
- Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
- Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
- Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490 (2012).
- Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
- Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
- Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
- Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
- Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
- Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
- Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
- Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
- Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
- Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
- Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
- Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
- Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
- Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
- Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
- Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5 (2013).
- Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
- Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
- Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).
