Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل، Published: December 28, 2016 doi: 10.3791/54976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Entomology Department, University of Maryland, 2Program in Molecular and Cell Biology, University of Maryland

Summary

هنا، نقدم بروتوكولات للتربية وخنفساء المتوسطة الجرثومية، Dermestes المبقعة (د المبقعة) في المختبر. نحن أيضا مشاركة بروتوكولات لرني الجنينية والوالدين وطرق تحليل الظواهر الجنينية لدراسة وظيفة الجينات في هذه الأنواع.

Introduction

في عام 1998، وذكرت النار وميلو أن RNA المزدوج تقطعت بهم السبل (الرنا المزدوج الجديلة) يمكن أن تحدث تثبيط وظيفة الجينات في انواع معينة ايليجانس 1. وقد سمي هذا الرد الناجمة عن الرنا المزدوج الجديلة تدخل الحمض النووي الريبي (رني)، وتقارير عن هذا إسكات الجينات بوساطة رني يجب الحفاظ على الحيوانات والنباتات والفطريات 2-7. في النباتات وبعض الحيوانات، وظائف رني للنظام، وهذا يعني أن التأثير يمكن أن تنتشر إلى خلايا أخرى / الأنسجة حيث لا يتم إدخال الرنا المزدوج الجديلة مباشرة (إعادة النظر في 10/8). وحقق العلماء استخدام هذا الرد رني الخلوية المحلية من خلال تصميم dsRNAs لاستهداف الجينات في المصالح، وبالتالي هدم وظيفة الجينات دون التلاعب مباشرة الجينوم (إعادة النظر في 11-14).

رني هو أداة قوية للدراسات وظيفية بسبب المزايا التالية. أولا، حتى مع الحد الأدنى من المعلومات تسلسل الجينات، والجين يمكن المستهدفة باستخدام رني. وهذا أمر مهم خاصة بالنسبة للشارعudies من الكائنات غير النموذجية تفتقر إلى بيانات الجينوم أو transcriptomic. ثانيا، في الكائنات الحية حيث الاستجابة رني هي المنهجية بقوة، ضربة قاضية الجينات بوساطة رني لا يمكن أن يؤديها في أي مرحلة تنموية تقريبا. هذه الميزة مفيدة جدا لدراسة وظيفة الجينات عديد المظاهر. ثالثا، في بعض الحالات، انتشرت آثار رني إلى الغدد التناسلية وذرية، مثل ذلك مع مراعاة الظواهر في ذرية 15،16. هذه الظاهرة، والمعروفة باسم الوالدين رني (pRNAi)، هو مفيد خاصة للجينات تؤثر على نمو الأجنة، والعديد من ذرية المنتجة من قبل أحد الوالدين حقن واحد يمكن فحص دون التلاعب المباشر من البيض. لهذه الأسباب، pRNAi هو الأسلوب المفضل. ومع ذلك، إذا pRNAi غير فعال، على سبيل المثال عن الجينات اللازمة لمراحل تكوين البويضات، ثم الجنينية رني (eRNAi) يجب أن تستخدم. رابعا، رني يمكن استخدامه لتوليد ما يعادل سلسلة أليلية في أن كمية الرنا المزدوج الجديلة تسليمها يمكن أن تختلف على نطاق ولإنتاج ضعيف إلى عيوب قوية. مثل هذا التدرج من الظواهر يمكن أن تكون مفيدة لفهم وظيفة الجينات عندما تشارك الجينات في عملية معقدة و / أو فقدان كامل للوظيفة غير قاتلة. خامسا، تسليم الرنا المزدوج الجديلة من السهل والممكن بصفة عامة، وخاصة في الحيوانات تظهر ردود رني النظامية قوية. ويمكن إدخال الرنا المزدوج الجديلة بواسطة حقن مكروي 1،5، والتغذية / ابتلاع 17،18، تمرغ، 19،20 وفيروس / بوساطة البكتيريا تسليم 21،22. سادسا، خلافا لبعض الجينات أساليب الاستهداف / والتحرير، وليس هناك حاجة للكشف عن الكائنات الحية التي تحمل طفرة أو لتنفيذ الصلبان الوراثية لتوليد الزيجوت المتماثلة الألائل عند استخدام رني. ولذلك، بالمقارنة مع العديد من التقنيات الأخرى لدراسة وظيفة الجين، رني هو سريعة وغير مكلفة، ويمكن تطبيقها للشاشات واسعة النطاق 23-25.

الأداة المساعدة واسعة من رني توفر الوسائل اللازمة لتنفيذ الدراسات الفنية في مجموعة واسعة من الكائنات الحية، وتوسيع نطاق الأنواع المتاحة للدراسة beyonد نظم نموذج التقليدية التي وضعت أدوات الوراثية. على سبيل المثال، هناك حاجة لدراسات استخدام أنظمة غير النموذجية لإعطاء نظرة ثاقبة لتطور الجينات وشبكات الجينات من خلال مقارنة وظائف orthologs من الأنواع التي تمثل انماط التنمية المختلفة أو اظهار معالم شكلية متميزة 26-29. وهذه الأنواع من الدراسات توفير فهم أفضل للتنوع البيولوجي، مع آثار لبحث كلا التطبيقية والأساسية.

كونها أكبر مجموعة الحيوانات على كوكب الأرض، وتوفر الحشرات فرصة عظيمة لاستكشاف آليات التنوع الكامن. بالإضافة إلى ذلك، الحشرات عموما صغيرة، لها دورة حياة قصيرة، وخصوبة عالية، وسهلة الخلفي في المختبر. في العقدين الماضيين، تم تطبيقه بنجاح رني في الحشرات التي تغطي أوامر، بما في ذلك ذوات الجناحين (الذباب الحقيقي) 5، وقشريات الجناح (الفراشات والعث) 30، مغمدات (الخنافس) 16،31، غشائية الأجنحة (sawfالأكاذيب والدبابير والنمل والنحل) 32، نصفيات الجناح (البق الحقيقي)، Isoptera (النمل الأبيض) 34، Blattodea (الصراصير) 35، مستقيمات الأجنحة (الصراصير والجنادب والجراد، وkatydids) 36 و Phthiraptera (القمل) 37. وقد وفرت التطبيق الناجح لرني البيانات الوظيفية للدراسات الزخرفة في مرحلة التطور الجنيني المبكر (الأمامي الخلفي محور 32، الظهري البطني محور 28، وتجزئة 26،38)، تحديد الجنس 39،40، كيتين / بشرة الحيوي 41، إكديسون إشارات 42، السلوك الاجتماعي 43، وأكثر من ذلك. طرق رني تطويرها لأنواع الحشرات المختلفة قد تكون ذات فائدة إضافية في أنها من المحتمل أن تكون مفيدة لمكافحة الآفات (إعادة النظر في 44-46). آثار رني سيكون الجينات المحددة، فضلا عن الأنواع الخاصة، طالما يتم اختيار المناطق غير المحفوظة للاستهداف. لأنواع الحشرات النافعة مثل النحل ودودة القز، واستهداف الجينات الحيوية للبقاءالفيروسات أو الطفيليات للسيطرة على العدوى قد توفر استراتيجية جديدة لحماية هذه الأنواع 47،48.

Dermestes المبقعة (د المبقعة)، والاسم الشائع اخفاء خنفساء، وتوزع في جميع أنحاء العالم باستثناء القارة القطبية الجنوبية. كما حشرة كاملة الانسلاخ، وتشمل دورة حياة د. المبقعة الجنينية، اليرقات، العذراء، ومراحل الكبار (الشكل 1). لأنها تتغذى على اللحم، ويستخدم د. المبقعة في المتاحف لأصبح هيكل الحيوانات النافقة، ويمكن أن علماء الحشرات في الطب الشرعي استخدامها لتقدير وقت الوفاة 49،50. د. المبقعة يتغذى على المنتجات الحيوانية بما في ذلك الجثث واللحوم المجففة، والجبن، والشرانق / شرانق من الحشرات الأخرى، وبالتالي يسبب ضررا للأسر، المواد الغذائية المخزنة، والحرير، والجبن، وصناعات اللحوم 51،52. يمكن تطبيق رني في هذا خنفساء توفير وسيلة فعالة وصديقة للبيئة لتقليل أثرها الاقتصادي. وقد استخدمت لدينا مختبر د. المبقعة باعتباره م جديدمركز Odel الحشرات لدراسة تجزئة 53. بالإضافة إلى كونها قابلة للتربية مختبر، D. المبقعة هو من مصلحة للبحوث الأساسية كما هو مطور المتوسطة الجرثومية، مما يجعل من الأنواع المفيدة لدراسة الانتقال بين القصير والتنمية الجرثومية منذ فترة طويلة.

شكل 1
الشكل 1: دورة الحياة من د. المبقعة. الصور دال المبقعة في مراحل الحياة المختلفة، كما هو محدد. دورة الحياة من البيض إلى الكبار يأخذ ثلاثة أسابيع عند 30 درجة مئوية لكن أطول في درجات حرارة منخفضة. (A، F) الأجنة وضعت حديثا هي بيضاء للضوء الأصفر والبيضاوي، وحوالي 1.5 ملم في الطول. التخلق يأخذ ~ 55 ساعة على 30 درجة مئوية. (B، C و G) يرقات ديك المشارب اللون الغامق ومغطاة setae. اليرقات تذهب من خلال عدة أطوار اعتمادا على البيئة وطولها يمكن أن تمتد إلى أكثر من 1 سم. (D، H) (E، I) بعد فترة وجيزة من eclosion، يظهر تصبغ الظلام على الجسم خنفساء الكبار. يمكن للبالغين ترقى إلى عدة أشهر، واحدة من الإناث يمكن أن تضع مئات من الأجنة خلال حياتها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في وقت سابق، وأظهرت لنا أن رني فعالة فى اسقاط وظيفة الجين في D. المبقعة 53. هنا يتم تقاسم خبرتنا تربية المستعمرات D. المبقعة في المختبر جنبا إلى جنب مع بروتوكولات خطوة بخطوة لكلا الجنينية أبوي ورني انشاء والحقن، والرعاية بعد الحقن، وتحليل المظهري. ضربة قاضية وتحليل أساليب الجينات بوساطة الرنا المزدوج الجديلة قدم هنا لا توفر فقط معلومات مفصلة عن معالجة المسائل في D. المبقعة، ولكن أيضا لها أهمية المحتملة FOص تطبيق رني في غير النموذجية خنفساء / أنواع الحشرات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تربية دال المبقعة

ملاحظة: تم تشكيل لمستعمرة تربية D. المبقعة حتى في المختبر المؤلفين باستخدام البالغين واليرقات شراؤها تجاريا. تم التحقق من هوية الأنواع باستخدام الحمض النووي المتوازية 53.

  1. لإعداد قفص جديد في المختبر، وانتشار طبقة رقيقة من نجارة الخشب في قفص الحشرات متوسطة الحجم (30.5 × 19 س 20.3 سم 3). وضع ~ 10 × 6 × 3 سم 3 قطعة من الستايروفوم في قفص للسماح اخفاء اليرقات لالتشرنق. إضافة 20-50 الخنافس (سواء البالغين أو في وقت متأخر يرقات العمر). والخنافس تخفي في نجارة الخشب.
  2. إضافة القط الغذاء الرطب في طبق بيتري أو قارب وزنها. تغطية القفص بقطعة قماش شبكة ووضع القفص في حاضنة.
  3. للحفاظ على مستعمرة التكاثر في المختبر، وضبط درجة الحرارة بين 25 و 30 درجة مئوية. د. المبقعة تنمو بشكل أسرع عند ارتفاع درجات الحرارة، ولكن هذا يشجع أيضا على نمو الفطريات والعث. للحفاظ على شفاءمستعمرة خاصتك، واستخدام 25 - 28 درجة مئوية لمدة الصيانة الأسهم العادية و 30 درجة مئوية للتوسع السريع في مستعمرة. دورة الحياة تستغرق ما يقرب من ثلاثة أسابيع إلى أربعة أشهر اعتمادا على العوامل البيئية 50 (الشكل 2).

الشكل 2
الشكل 2: د. المبقعة مختبر مستعمرة. وأظهرت صورة نموذجية D. المبقعة الحشرات القفص. وتنتشر نجارة الخشب للسماح للالخنافس تخفي. وأضاف القط الغذاء في طبق بيتري صغير أو وزنها القارب. يتم وضع الستايروفوم في قفص كملاذ آمن لليرقات العمر النهائية لتخدر تصبح خادرة. القفص المبين هنا هو 30.5 × 19 س 20.3 سم 3 و يضم بضع مئات من يرقات، عذارى، والكبار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. مرجةلقد البيض في القفص حتى تنضج. لتوسيع مستعمرة، وإنشاء أقفاص جديدة مع البيض (التي تم جمعها كما هو موضح في القسم 2)، اليرقات، أو البالغين، على النحو الوارد أعلاه. د. المبقعة وضع البيض في جميع أنحاء القفص، وخاصة بالقرب من مصدر الغذاء.
  2. استبدال القط الغذاء الرطب مرتين في الأسبوع.
    ملاحظة: نظرا لرائحة كريهة من القط الغذاء الرطب، تم اختبار المصادر الغذائية البديلة أيضا (انظر مناقشة).

مجموعة 2. الأجنة

  1. لإعداد مجموعة، فصل لا يقل عن 50 من الذكور و 50 من الإناث من المستعمرة. الشباب هم أفضل. مكان البالغين في قفص صغير الحجم (17.8 X 10.2 X 12.7 سم 3) من دون نجارة الخشب. إضافة القط الغذاء في قارب وزنها.
  2. قبل البدء في جمع، والتحقق من قفص بعناية لأي الأجنة الحالية وإزالتها. وضع كرة من القطن تمتد الى داخل القفص، وترك القفص في 30 درجة مئوية الحاضنة. بعد نافذة الوقت المناسب، فإن الكرة القطن ستكون جاهزة لجمع الأجنة.
  3. طيةقطعة من الورق المقوى الأسود (حجم A4) في نصف لخلق تجعد، ثم تتكشف.
  4. إزالة الكرة القطن تمتد من القفص. إزالة البالغين من القطن الكرة ووضعها مرة أخرى في قفص.
  5. بينما معسر الكرة القطن امتدت بلطف شديد، تمزيقها ببطء إلى خيوط القطن رقيقة للسماح للبيض تسقط على ورقة سوداء.
    ملاحظة: الأجنة د المبقعة هشة والصعب أن نرى في القطن. ويمكن سحقها بسهولة إذا يمسك الكرة القطن بقوة أيضا.

3. إعداد الرنا المزدوج الجديلة

  1. إعداد قالب الحمض النووي للالرنا المزدوج الجديلة التجميعي
    1. تشغيل 4-6 50 ميكرولتر تفاعلات PCR باستخدام بادئات التي تحتوي على تسلسل T7 المروج في كل 5 'ينتهي لتضخيم الحمض النووي القالب وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. تنقية المنتج PCR باستخدام PCR عدة تنقية التجارية، في أعقاب تعليمات الشركة الصانعة. التركيز النهائي المثالي من قالب الحمض النووي هو ≥100 نانوغرام / ميكرولتر.
  2. إعداد العازلة حقن
    1. إعداد 100 مل من العازلة حقن (0.1 ملي ناه 2 ص 4 و 5 ملي بوكل). ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع 5 M هيدروكسيد الصوديوم.
    2. مخزن aliquots في -20 درجة مئوية.
  3. الرنا المزدوج الجديلة التجميعي
    1. إعداد رد فعل في 0.2 مل أنبوب PCR على الجليد وإجراء النسخ في المختبر رد فعل مع البلمرة T7، بعد تعليمات الشركة الصانعة، وذلك باستخدام ~ 500 قالب نانوغرام في رد الفعل.
    2. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
    3. هضم قالب الحمض النووي مع الدناز، بعد تعليمات الشركة الصانعة.
    4. تسخين أنبوب إلى 94 درجة مئوية، وعقد في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
    5. ليصلب الرنا المزدوج الجديلة، تبرد ببطء الأنبوب بنسبة 1 ° C / دقيقة حتى تصل إلى 45 درجة مئوية بعد 1 ساعة.
      ملاحظة: الخطوات 3.3.2 خلال 3.3.5 لا يمكن أن يؤديها في thermocycler.
    6. إلى إيثانول راسب من الرنا المزدوج الجديلة، إضافة 280 ميكرولترمن ريبونوكلياز المياه مجانا إلى 20 ميكرولتر من رد فعل على التكيف مع الحجم النهائي من 300 ميكرولتر. إضافة 30 ميكرولتر من 3 M NaOAc (درجة الحموضة 5.2) و 650 ميكرولتر من الايثانول. وضع أنبوب في الثلاجة -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    7. بعد الطرد المركزي في 15682 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وغسل بيليه الرنا المزدوج الجديلة مع 70٪ من الإيثانول. بيليه الجافة وتذوب في 20 ميكرولتر العازلة الحقن.
    8. قياس تركيز الرنا المزدوج الجديلة باستخدام مقياس الطيف الضوئي في A 260. التركيز المثالي هو 3-5 ميكروغرام / ميكرولتر. تحقق من جودة عن طريق تشغيل 5 ميكرولتر من 1:25 التخفيف من الرنا المزدوج الجديلة على هلام الاغاروز 1٪ عند 90 V لمدة 30 دقيقة. وهناك فرقة واحدة من الحجم المتوقع أن تكون مرئية بسهولة.
    9. تخزين الرنا المزدوج الجديلة في -20 درجة مئوية أو أكثر برودة.
      ملاحظة: للحصول على كل رني التجربة ضربة قاضية، وتشمل السيطرة الرنا المزدوج الجديلة، والتي لن يكون من المتوقع أن تؤثر على عملية التي تجري دراستها. GFP الرنا المزدوج الجديلة هو سيطرة ممتازة بالنسبة لمعظم التجارب. تحضير وحقن الرنا المزدوج الجديلة السيطرة جنبا إلى جنب مع experimental الرنا المزدوج الجديلة.

4. جمعية Microinjector وMicromanipulator

ملاحظة: انظر الشكل 3.

  1. ربط النيتروجين أو غيرها من امدادات الهواء لمدخلات الضغط صك مضخة تعمل بالهواء المضغوط. إذا مضخة هوائية ليست متاحة، والضغط باستخدام حقنة 50 مل متصلا أنابيب على ما يرام.
  2. توصيل التبديل القدم إلى الموصل بعد المضخة للسيطرة على تدفق ضغط الإخراج.
  3. إرفاق حامل الزجاج الشعرية إلى ميناء ضغط إخراج مضخة مع أنبوب.
  4. تحديد صاحب الشعرية على micromanipulator بالقرب المجهر تشريح.

5. الجنينية رني

ويبين الشكل 4 مخطط دال المبقعة الجنينية رني: ملاحظة.

  1. إعداد eRNAi
    1. إعداد الجنين جمع طبق بتري غطاء (مم 90). ضع قطعة من ورق الترشيح سوداء لجعلى داخل الغطاء. وضع شريحة المجهر القياسية على ورقة سوداء.
    2. تمييع الرنا المزدوج الجديلة إلى التركيز المناسب مع العازلة الحقن. استخدام 2-3 ميكروغرام / ميكرولتر للتجارب الأولية. احرص دائما على الرنا المزدوج الجديلة على الجليد قبل الحقن.
    3. إضافة تلوين الطعام في 1:40 التخفيف إلى الرنا المزدوج الجديلة وماصة بلطف عدة مرات ليمزج جيدا.
  2. جمع الأجنة لحقن
    ملاحظة: عند درجة حرارة 25 درجة مئوية، ونوى في الأجنة 6-8 ساعة بعد وضع البيض (AEL) تهاجر نحو البويضة هامش 53. تم تأسيس الأريمة الخلوية داخل 8-10 ساعة AEL 53. لضمان استخدام الأجنة قبل مرحلة الأريمة الخلوية للحقن، 0 - ينصح الأجنة AEL 3 ساعات للاستخدام 53. جمع الأجنة، وإعداد، وحقن عادة ما تستغرق أقل من 2 ساعة إذا كان الزجاج الشعيرات الدموية في حالة جيدة. ولذلك، فإن العملية برمتها يمكن أن تكتمل في غضون 5 ساعة AEL.
    1. جمع الأجنة كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.5.
    2. الاستفادة من الورق المقوى الأسود لنقل الأجنة في جمع طبق بتري غطاء.
    3. عصا الشريط على الوجهين على طول حافة الشريحة.
    4. باستخدام فرشاة الطلاء، ومواءمة الأجنة على الشريط عمودي على حافة الشريحة مع الأمامي أو الخلفي نهاية في الحافة. لاحظ أن نهايات الأمامي والخلفي من الأجنة المبكرة ليست مميزة بسهولة، وبالتالي على سيتم حقن نصف متوسط ​​في نهاية الخلفي الذي يعتبر مثاليا.
  3. تحميل الرنا المزدوج الجديلة في شعري زجاج
    1. تناول 2-4 ميكرولتر من الرنا المزدوج الجديلة إلى 20 ميكرولتر microloader ماصة.
    2. إدراج غيض إلى الزجاج الشعرية سحبت قبل (المشار إليها باسم إبرة) وبلطف ماصة الحل الرنا المزدوج الجديلة في شعري. تعد الإبر من الشعيرات الدموية الزجاج التجارية باستخدام مجتذب micropipette. ويرد مثال على إبرة سحب مثالية في الشكل (5). قد يحتاج طول وتفتق من الإبر أن يكون الأمثل بالعربيةتجارب الحقن ثالثا.
    3. إصلاح الزجاج الشعرية في حامل الزجاج الشعرية.
    4. تجميع صاحب الشعرية في micromanipulator.
  4. حقن الرنا المزدوج الجديلة في الأجنة
    1. نقل بعناية الشريحة مع الأجنة على خشبة المسرح المجهر تشريح.
    2. نقل الشريحة لجلب جنين واحد إلى مركز المجهر الميدانية والتركيز.
    3. ضع غيض من شعري مع micromanipulator حين النظر في المجهر تشريح. جلب رأس مقربة من نهاية الجنين الأول في الصف.
    4. التبديل على النيتروجين أو غيرها من امدادات الهواء.
    5. تعيين الملف اللولبي مفتاح دخل محدد للفراغ.
    6. ضبط منظم ضغط الإخراج ل10-15 رطل. ضبط الضغط اعتمادا على الجهاز.
    7. فتح الشعرية إذا لزم الأمر. مرة واحدة غيض مفتوح، فإن الحل الرنا المزدوج الجديلة الملونة تملأ طرف.
    8. نقل معلومات سرية الشعرية إلى الأمام إلى ثقب هmbryo. إذا كان الإعداد الضغط المثالي، سوف تتدفق أي سائل الجنينية في شعري.
    9. خطوة على التبديل القدم لإخراج حل الرنا المزدوج الجديلة في الجنين حتى يتم إخراج كمية مناسبة من الحل. ويبين الشكل 5 أمثلة من التشكل الجنين بعد أن تم حقنها بكميات مناسبة وغير مناسبة للحل.
    10. حافظ على طرف الشعرية داخل الجنين ل~ 2 ثانية، ثم إزالته.
    11. نقل الشعرية إلى الجنين القادم، وكرر الخطوات من 5.4.8 - 5.4.10 حتى يتم حقن جميع الأجنة. تغيير الزجاج الشعرية إذا كان يحصل انسداد أو فواصل.
  5. الانتعاش بعد الحقن والحضانة
    1. بعد الحقن، ضع الشريحة في طبق بيتري.
    2. إضافة كرة من القطن مبللة على طبق بيتري. لا تدع الكرة القطن تلمس الشريحة.
    3. تغطية طبق بتري وألفه مع ختم الفيلم. تسمية الطبق مع اسم الرنا المزدوج الجديلة، والتركيز، التاريخ، الوقت، وعدد من حقنالأجنة.
    4. وضع طبق بيتري في 30 درجة مئوية الحاضنة حتى يفقس الأجنة.

6. رني الوالدين

  1. عزل شرانق لpRNAi
    1. جمع الشرانق من المستعمرة.
    2. نوع من الذكور والإناث العذارى تحت المجهر (انظر الشكل 6). الاحتفاظ بها في اثنين من أطباق بتري منفصلة في 30 درجة مئوية حاضنة لضمان عدم التزاوج يحدث قبل الحقن.
    3. تحقق كل يوم للبالغين eclosed. التشرنق عادة ما يستغرق 5-7 أيام عند 30 درجة مئوية.
    4. نقل eclosed الذكور والإناث (انظر الشكل 6) لاثنين من أطباق بتري منفصلة وإطعامهم القط الغذاء كل يوم حتى تكون جاهزة للحقن.
    5. انتقل إلى حقن مرة واحدة هناك ما يكفي من الإناث والذكور في العمر المناسب. الإناث 4-8 أيام بعد eclosion هي الأفضل. للاطلاع على تحليل نموذجي، 8 - تستخدم 12 من الإناث. هناك حاجة لعدد متساو من الذكور للتزاوج 54.
    حقن الرنا المزدوج الجديلة إلى أنثى البطن
    1. إعداد الرنا المزدوج الجديلة على الجليد (5.1.2 و 5.1.3).
    2. نعلق إبرة 32 عيار إلى حقنة 10 ميكرولتر.
    3. تخدير الإناث على CO 2 المرحلة.
    4. تحميل حل الرنا المزدوج الجديلة في حقنة من دون تناول أي هواء.
    5. عقد الجانب البطني الإناث مع يد واحدة وعقد حقنة مع الآخر.
    6. اختراق بلطف segmacoria (غشاء) بين sternites 2 و 3 مع رأس الإبرة. ويبين الشكل 7 الأنثى أثناء الحقن. إذا لم إبرة تخترق الأنسجة بسهولة، زاوية الإبرة إلى أعلى ببطء واضغط لأسفل. إدراج حوالي 2 ملم من الإبرة في الجسم.
    7. تحقق حجم حقنة في حين دفع ببطء الغطاس، عن طريق الحقن ~ 2 ميكرولتر لكل أنثى.
    8. بعد حقن، عقد الإبرة لا يزال لا يقل عن 5 ثانية قبل إزالته من بطن الأنثى.
    9. نقل الإناث لحقن طبق بتري (90 مم) وتغذية مع القط الغذاء.
    10. تسمية طبق بيتري مع اسم الرنا المزدوج الجديلة، كمية حقن، وتاريخ، وعدد من الإناث.
  2. الانتعاش بعد الحقن والتزاوج
    1. احتضان طبق بيتري في 30 درجة مئوية الحاضنة.
    2. بعد 24 ساعة، نقل حقن الإناث إلى قفص صغير.
    3. إضافة إلى القفص على عدد متساو من الشباب الذكور uninjected، وتسمية القفص.
    4. إضافة قارب وزنها مع طعام القطط في قفص.
    5. ترك القفص في 30 درجة مئوية حاضنة للسماح التزاوج. بعد 24 ساعة، يجب أن الإناث تبدأ في وضع البيض والأجنة يمكن جمعها يوميا أو على فترات زمنية المطلوبة.

7. تحليل المظهري بعد رني

ملاحظة: عند 30 درجة مئوية، فإنه يأخذ ~ 55 ساعة لفقس البيض 50.

  1. تحليل الجدوى eRNAi
    1. حساب معدل فقس بمقارنة عدد من اليرقات إلى إجمالي نوmber من الأجنة المحقونة. ومن المؤكد أن تشمل حقن سيطرة سلبية لأنه الأجنة قد تتضرر أو قتل من قبل إجراء الحقن. وتختلف معدلات فتحة نموذجية من 30٪ - 60٪. حذار من اليرقات أكل البيض لم يفقس.
  2. تحليل الجدوى pRNAi
    ملاحظة: إذا كان يتأثر بقاء الإناث بواسطة الجينات المستهدفة من قبل رني، الإناث حقنوا الرنا المزدوج الجديلة معين ولكن ستبدأ لا سيطرة سلبية الرنا المزدوج الجديلة للموت. إذا يتأثر إنتاج البيض أو وضع البيض، والأنثى يحمل عقم جزئي أو كامل. يسجل البقاء على قيد الحياة للإناث مقارنة مع الضوابط السلبية أو مقارنة إجمالي عدد البيض الذي تضعه الإناث التجريبية والضابطة (7.2.3).
    1. إعداد جمع الأجنة بعد خطوة 2.2.
    2. بعد 24 ساعة، وجمع الأجنة بعد خطوات 2،4-2،5.
    3. عد عدد من الأجنة.
    4. نقل الأجنة إلى 90 مم طبق بيتري. تسمية طبق بيتري مع الجينات المستهدفة، تاريخ جمع، وعدد من الأجنة. احتضان الأجنة في 30 درجة مئوية الحاضنة حتى يفقس. منذ تغذية اليرقات على أجنة لم يفقس، والتحقق من طبق بيتري في كثير من الأحيان ومنفصلة تحاك اليرقات من أجنة لم يفقس باستخدام ملقط (انظر مناقشة).
    5. حساب عدد الأجنة التي تحاك وحساب معدل فقس.
  3. دراسة عيوب البشرة في تحاك يرقات
    1. جمع اليرقات في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    2. في غطاء الدخان، إضافة 1 مل من التثبيت الحل.
    3. ترك الأنبوب microcentrifuge في 4 درجات مئوية على الأقل بين عشية وضحاها للسماح للحل تخترق أنسجة اليرقات.
    4. تصور، وإزالة الكثير من تثبيتي من أنبوب ممكن.
    5. اليرقات شطف لا يقل عن ثلاث مرات مع PBST.
    6. قطع نقل اليرقات إلى لوحة زجاج متعددة بشكل جيد مع PBST باستخدام ماصة-P 1000 مع نهاية قبالة لتوسيعها.
    7. تحت المجهر تشريح، وتمتد اليرقات باستخدام ملقط لفحص العيوب. أنار أمر بالغ الأهمية لتمتد خارج اليرقات لفحص العيوب كما عقد جثثهم في تثبيتي.
  4. دراسة عيوب البشرة في لم يفقس يرقات
    ملاحظة: هذا الإجراء مفيد لدراسة الظواهر الجنينية المبكرة، وخاصة بالنسبة للأجنة التي لا البقاء على قيد الحياة لالفقس.
    1. لpRNAi، إضافة PBST في طبق بيتري (7.2.4) ونقل الأجنة لم يفقس لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل باستخدام ماصة-P 1000 مع خفض نهاية المباراة. لeRNAi، إضافة PBST في طبق بيتري (5.5.4)، فرشاة أجنة لم يفقس قبالة شريحة المجهر ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge.
    2. إصلاح الأجنة مع التثبيت الحل وشطف لهم مع PBST لرؤية الخطوات التالية 7.3.2 - 7.3.6.
    3. باستخدام ملقط، تشريح الأجنة من قشر البيض تحت المجهر تشريح في PBST.
    4. نقل الأجنة إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge (~ 200 ميكرولتر من الأجنة في كل أنبوب).
    5. إزالة سول قدرution ممكن.
    6. إضافة 1 مل من 90٪ حامض اللاكتيك / 10٪ ETOH. ترك أنبوب الطرد المركزي في 60 درجة مئوية الحاضنة على الأقل بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: الأجنة يمكن أن تترك في 60 درجة مئوية لعدة أيام.
    7. لتحميل الأجنة، ماصة لهم على شريحة المجهر باستخدام P-1000 ماصة مع قطع نهاية المباراة.
    8. وضع يدويا الأجنة مع ملقط لهذا التوجه المثالي.
    9. تغطية الأجنة مع غطاء الانزلاق وتصور تحت المجهر باستخدام مدينة دبي للإنترنت.
  5. دراسة العيوب الخلوية والجزيئية
    ملاحظة: هذا الإجراء مفيدا للتحقيق في الأسباب الكامنة وراء الظواهر بشرة أو الفتك الذي لا يرافقه عيوب بشرة.
    1. لpRNAi والأجنة منفصلة عن كرات من القطن في مرحلة التطوير المناسبة ونقلها إلى سلة الجنين جمع. سلة جمع يمكن أن تكون هي نفسها أو مشابهة لتلك المستخدمة في مجموعات الجنين ذبابة الفاكهة.
      1. صنعسلة البيض من 25 مل من البلاستيك التلألؤ قارورة مع الجزء السفلي من القارورة إزالتها، وقطع دائرة من غطاء (حوالي 1 سم القطر). ضع دائرة السوبر غرامة شبكة حوالي 2.5 سم وقطرها داخل الغطاء، وبعد ذلك المسمار القارورة التلألؤ واستخدامها رأسا على عقب.
      2. وبما أن شبكة يمكن إزالتها بسهولة بمجرد غسلها الأجنة، تزج شبكة في أنبوب microcentrifuge مع الماء لاسترداد أي أجنة التمسك شبكة.
    2. لeRNAi، في مرحلة مناسبة، إضافة إلى PBST طبق بيتري. فرشاة الأجنة خارج الشريحة المجهر ونقلها إلى سلة الجنين جمع.
      ملاحظة: التثبيت في الموقع التهجين، تلوين الأجسام المضادة، والبروتوكولات تلطيخ النووية يمكن العثور عليها في شيانغ وآخرون. 2015 53.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد استخدم مختبر المؤلفين تكنولوجيا رني لدراسة تطور وظيفي من الجينات التي تنظم تجزئة في الحشرات 53،55. في حين تتم تجزئة كل الحشرات، ويبدو أن الجينات التي تنظم هذه العملية قد اختلفت خلال الإشعاعات الحشرات 26،38،56-63. حددت شاشات الوراثية في ذبابة الفاكهة مجموعة من تسعة جينات تجزئة الزوج القاعدة التي هي المسؤولة عن تشجيع تشكيل قطاعات الهيئة 64-70. هنا، ortholog من واحد من هذه الجينات، وإرفاقها (دبا)، ويستخدم لتوثيق فائدة رني لدراسة وظيفة الجين في D. المبقعة.

كانت eRNAi وpRNAi كل فعالة في إثبات أدوار DMAC - حزب الثورة الديموقراطية في تشكيل جزء في هذا النوع. 2-3 ميكروغرام / ميكرولتر من الرنا المزدوج الجديلة مصممة لاستهداف DMAC - حزب الثورة الديموقراطية (أرقام 8B، 8D و8F GFP الرنا المزدوج الجديلة، حقن كما سيطرة سلبية (أرقام 8A، 8C و8E).

السيطرة ذرية تحاك مع شريط المصطبغة واحد لكل قطعة. تم فصل المشارب المصطبغة المجاورة التي فجوة غير المصطبغة (الشكل 8A). بعد دلتا نهر اللؤلؤ pRNAi، ذرية المتضررين تحاك مع المشارب المصطبغة المجاورة تنصهر، كانت تشير إلى حدود قطعي المعيبة (الشكل 8B). اعتمادا على شدة المظهرية، واحد أو اندماج عدة تم الكشف في اليرقات المصابة. ومع ذلك، يبدو اندماج باستمرار في المناطق الحدودية بين T2 / T3، A1 / A2، A3 / A4، A5 / A6، A7 / A8، مشيرا إلى عيوب مثل الزوج القاعدة. وأظهرت الظواهر بشرة بعد ضربة قاضية دبا فقدان شرائح البطن وكذلك تقصير طول الجسم (الشكل 8D). تم تنفيذ Engrailed (أون) تلوين الأجسام المضادة لفحص العيوب الجزيئية في وقت مبكرالأجنة بعد ضربة قاضية دلتا نهر اللؤلؤ. في حين أظهرت الأجنة تحكم مخطط أون التعبير مع كثافة متساوية في كل شريحة (الشكل 8E)، تم الكشف عن انخفاض التعبير أون في خطوط بديلة في الذرية من DMAC دلتا نهر اللؤلؤ الرنا المزدوج الجديلة حقن الإناث (النجمة في الشكل 8F). نمط انخفاض التعبير أون يتسق مع نمط بشرة معيب لوحظ في اليرقات المصابة. للحصول على نتائج أكثر تفصيلا من الظواهر بعد ضربة قاضية حزب الثورة الديموقراطية في D. المبقعة، انظر شيانغ وآخرون. 2015 53.

الشكل (3)
الشكل (3): حقن جهاز. وأظهرت صورة للمجهر التشريح وmicromanipulator تستخدم لحقن الأجنة د المبقعة. يتم توصيل إمدادات النيتروجين إلى ميناء الضغط مدخلات مضخة تعمل بالهواء المضغوط. يتم توصيل الزجاج حامل الشعرية إلى ejecر ميناء ضغط المضخة. يتم توصيل التبديل القدم إلى المضخة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: مخطط انسيابي لD. المبقعة الجنينية رني. (م) جمع الأجنة للحقن. تضع الإناث الأجنة (البرتقالي) في كرات القطن (الدائرة الرمادية). الأجنة منفصلة عن كرات من القطن والسماح لهم تسقط على قطعة من الورق المقوى الأسود. وتشير أشرطة بيضاء الدموع في كرة من القطن. نقل الأجنة إلى جمع طبق بتري غطاء، واصطف مع ورقة سوداء. (E، F) عن طريق الحقن الرنا المزدوج الجديلة في أجنة. محاذاة الأجنة على الشرائح على شريط عصا مزدوجة وحقن منهم على حدة تحت المجهر تشريح. ويرد إبرة مع صبغة الطعام الخضراء. (GJ) بعد حقن الانتعاش وincubأوجه. وضع كرة من القطن مبللة في طبق بيتري لتوفير الرطوبة. تغطية طبق بتري وألفه مع ختم فيلم (الضوء الأزرق). وضع طبق بتري في حاضنة وإزالة اليرقات لتحليل المظهري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: جيد مقابل باد الجنينية أمثلة حقن. (A) Uninjected الجنين. (ب) الأجنة حقن مع القليل جدا من الرنا المزدوج الجديلة. (C) الأجنة حقن مع كمية مناسبة من الرنا المزدوج الجديلة. (D) المكسور الجنين مع فيضان الرنا المزدوج الجديلة الناجمة عن الإفراط في الحقن. تمت إضافة تلوين الطعام إلى الرنا المزدوج الجديلة التصور. (E) أمثلة من الأنابيب الشعرية سحبت استخدام الإبر لحقن. لاحظ تفتق وطول الحافة وأو مثالين من الإبر وظيفية. أشرطة النطاق لميلادي تمثل 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: ذكر وأنثى الكبار والشرانق. (أ) عرض بطني من خادرة الذكور. (A ') التكبير من الخلفية جزء من ألف (A ") توضيح من الذكور الأعضاء التناسلية خادرة. (ب) عرض بطني من خادرة الإناث. (B') التكبير من الخلفية جزء من B. أنثى الشرانق واثنين من الحليمات التناسلية (أبيض السهام). (ب ") توضيح من الأعضاء التناسلية للإناث خادرة. (C) عرض بطني من الذكور البالغين. (C ') عرض تضخيم الخلفي جزء من جيم لاحظ أن الذكور البالغين والأعضاء التناسلية ومثل ترايدنت هيكل دائري يشبه الفص على 4 تشرين sternite (السهام البيضاء والسوداء، على التوالي). (D) عرض بطني من الإناث البالغات. (D ') عرض تضخيم الخلفي جزء دال للجميع لوحات والحانات على نطاق وتشير 1 مم. لمزيد من التفاصيل، انظر شيانغ وآخرون. 2015 53. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
شكل 7: أنثى خلال حقن. يتم تخدير الإناث وضعت بطني حتى الجانب. ويرد إبرة اختراق segmacoria بين 2 و sternites 3RD لحقن الرنا المزدوج الجديلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

EP-together.within الصفحات = "1"> شكل 8
الرقم 8: الظواهر التمثيلية بعد pRNAi DMAC دلتا نهر اللؤلؤ. حقن (A) التحكم. عرض الوحشي من النوع البري مثل GFP pRNAi ذرية تحاك مع ثلاث شرائح الصدري وعشرة قطاعات في البطن. كل جزء له setae والمشارب المصطبغة. (ب) عرض جانبي لفقست ذرية pRNAi دلتا نهر اللؤلؤ. وضاقت الفجوة بين المشارب المصطبغة المجاورة المسمى أو مفقود تماما. (ج) البشرة النمط الظاهري من عنصر تحكم لم يفقس من النوع البري يشبه الجنين. (د) البشرة النمط الظاهري من ذرية pRNAi حزب الثورة الديموقراطية لم يفقس مع شرائح البطن أقل. (E، F) تشريح germband من: (E) التحكم GFP pRNAi وقد أعربت بالتساوي أون في كل شريحة، يتم تقليل (F) دلتا نهر اللؤلؤ التعبير pRNAi، جناح في قطاعات بديلة (النجمة). لكل جزءليرة سورية، على نطاق والحانات وتشير 500 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في حين تم وضع عدد قليل من النظم نموذج متطورة (الفئران والذباب والديدان) خلال القرن ال 20، وشهد القرن الحادي و21 موجة من أنظمة الحيوانات الجديدة التي يجري تطويرها في المختبرات في جميع أنحاء العالم. هذه النظم الجديدة تسمح للعلماء لمعالجة المقارنة، أسئلة التطورية التي لا يمكن بحثها فقط باستخدام نظم نموذج "القياسية". هذا نشر نماذج جديدة يتطلب التطور السريع للطرق لزراعة المختبر، وتحديد الجينات، والنهج الوظيفية في الأنواع الجديدة. هنا، قدمت إجراءات لتربية D. المبقعة في المختبر والبروتوكولات خطوة بخطوة لالجنينية رني، رني الوالدين، وتحليل المظهري في هذا خنفساء. والهدف من ذلك هو أن هذه الأوصاف تشجع الآخرين على استخدام D. المبقعة في تجاربهم الخاصة والاستفادة من الأساليب المقدمة هنا لتطوير أنواع نموذج إضافية جديدة.

في حين D. المبقعة لالمستعمرات أساسها هي لا يصدق سهلة للحفاظ على، واحد الحد من تربية هذه الأنواع هو رائحة كريهة من القط الغذاء الرطب نظرا لالخنافس كمصدر للغذاء. لتجنب هذا، الأغذية البديلة مثل مسحوق مصل اللبن / بروتين الصويا، جبنة، الكلب الغذاء الأرض، والحليب المجفف واختبار، مع أو بدون القطن مبللة لتغيير الرطوبة. كان الكلب الأرض الغذاء البديل الأكثر فعالية، ويمكن استخدامها لتغذية مستعمرة العادية. البقاء على قيد الحياة كان ممتازا (> 90٪) من البيض إلى الكبار في أقفاص تربى على الكلب الغذاء فقط جافة في الرطوبة النسبية 80٪، مع أو بدون وأضاف القطن مبللة. ومع ذلك، قد يكون المكمل هذا النظام الغذائي مع القط الغذاء الرطب عند جمع البيض لزيادة الخصوبة الضروري عند جمع أعداد كبيرة من البيض. إذا تم استخدام الكلب الغذاء، وينبغي إزالة الطعام القديم بانتظام، كما تم العثور مكيفة الكلب الغذاء لمنع وضع البيض 54. ويمكن أيضا أن الكلب الغذاء يطحن (KR، النتائج الأولية)، الفلين والخشب والورق، وغيرها من المواد أن تستخدم كملاذ 71.ومن المثير للاهتمام، تم الإبلاغ عن تحلل من الستايروفوم باستخدام ميلوورم يرقات الخنفساء 72. لذلك، هذا تم اختباره لD. المبقعة اليرقات. نجا الشباب د. المبقعة اليرقات حتى مرحلة البلوغ مع الستايروفوم الوحيد أو المواد التي تحتوي على الأسبستوس والقطن الرطب (لا تظهر البيانات)، ولكن ما إذا كان أكل وهضم تلك المواد لا يزال يتعين تحديدها.

هذا التقرير هو بروتوكول مفصلة الأول لتنفيذ الدراسات الجينية وظيفية في D. المبقعة. استخدام رني هنا يمثل توسيع هذه التقنية لنظام نموذجي جديد. عدة ملاحظات محددة جديرة بالملاحظة فيما يتعلق التجارب ضربة قاضية رني في D. المبقعة وغيرها من الأنواع غير النموذجية. أولا، لضمان أن رني سيكون فعالا في D. المبقعة، نفس السلالة من د. المبقعة المستخدمة هنا يجب أن تستخدم. وهناك أدلة من الترايبوليوم كاستانيم أن سلالات مختلفة تظهر التباين في رني عhenotypes 24،73، والظواهر متحولة غالبا ما تظهر الاعتماد على خلفية وراثية في الأنواع نموذج 74-76. أيضا، هناك أدلة غير مؤكدة عن سلالة الاعتماد في البروتوكولات الأخرى، بما في ذلك في الموقع التهجين. ثانيا، التوقيت المناسب للحقن هو أمر حاسم لرني الناجحة في D. المبقعة. إلى حد ما counterintuitively، واخترقت segmacoria أكثر سهولة بعد أن sclerotized بشرة تماما، بعد يومين على الاقل eclosion. لذلك، الإناث البكر 4 - بعد 8 أيام eclosion ينبغي أن تستخدم. المسنات اللاتي يعانين من خصوبة أقل من الإناث eclosed حديثا، وبالتالي ليست مناسبة للحقن. ثالثا، حقن الرنا المزدوج الجديلة قد تحصل على دفع بها الضغط الداخلي للبطن الأنثى. للحد من احتمال فقدان كمية كبيرة من الرنا المزدوج الجديلة بعد الحقن، وعقد إبرة في البطن لل~ 5 ثانية بعد الحقن ومن ثم إزالته ببطء (6.2.8). وفي الوقت نفسه، تجنب الضغط بطن الأنثى أثناء أو قريبابعد الحقن. للالتفاف على نتائج متحيزة الناجمة عن هذه المسألة، وضخ لا يقل عن 8 من الإناث لكل الرنا المزدوج الجديلة للحصول على ما يكفي من ذرية (~ 200 الأجنة يوميا) للتحليل المظهري. الرابع، وارتفاع العائد البيض مهم لتوفير بيانات مشاركات لتحليل المظهري بعد الحقن. في المتوسط، كل D. المبقعة أنثى تنتج ما يقرب من 35-55 الأجنة يوميا. يعتمد العائد البيض على حجم السكان، وعمر الإناث، والرطوبة، وتوافر الغذاء، ودرجة الحرارة (لا تظهر البيانات)، والعوامل البيئية الأخرى 54. عادة، الإناث تكمن أكثر في 30 درجة مئوية من 25 درجة مئوية. خامسا، أجنة لم يفقس يمكن نهبها من قبل اليرقات. كما اليرقات عادة ما تكون من النوع البري تشبه أو تتضرر إلا بشكل طفيف، في حين أجنة لم يفقس وعادة ما تكون أكثر المتضررين بشدة، هذه العادة دال المبقعة اليرقات يمكن أن يؤدي إلى نتائج متحيزة في تحليل المظهري الكمي. لذلك، من المستحسن إزالة اليرقات في أقرب وقت ممكن.

وقد ركز مختبرنا على د. المبقعة تجزئة، وعلى الرغم من أن العديد من جوانب هذا علم وظائف الأعضاء، علم البيئة، ومكافحة الآفات، بما في ذلك الأنواع ضبط وذات أهمية كبيرة. لدراسة التطور الجنيني وتجزئة، سلسلة من خطوط مصطبغة بحزن على الجانب الظهري من د. المبقعة اليرقات يمكن أن تكون بمثابة علامة طبيعية لنمو غير طبيعي. أيضا، setae مميزة الجذور على خطوط مصطبغة اليرقات يمكن أن تستخدم كمؤشر من القطاعات. هذه الميزات المورفولوجية، جنبا إلى جنب مع اكتشاف أن الأجنة تتأثر بشكل معتدل أو معتدل يمكن البقاء على قيد الحياة لالفقس، ومزايا من طراز د. المبقعة لدراسة الآليات التي تشارك في الزخرفة الخطة الجسم الأساسية.

وأخيرا، على أهمية إجراء التجارب، بما في ذلك رقابة شديدة لمراقبة سلبية مثل الرنا المزدوج الجديلة GFP واختبار اثنين من المناطق المستهدفة غير متداخلة لكل الجينات أمر بالغ الأهمية لتجنب سوء الفهم بسبب يالحظنهاية الخبر الحقن في حد ذاتها والآثار بعيدا عن الهدف. لD. المبقعة، 4-6 ميكروغرام تم حقن (2 ميكرولتر من 2 أو 3 ميكروغرام / ميكرولتر) الرنا المزدوج الجديلة في كل أنثى، وكان الرنا المزدوج الجديلة 200-250 نقطة أساس منذ فترة طويلة. قد تحتاج إلى أن يكون الأمثل إذا استهداف الجينات تعمل في وقت لاحق في التنمية أو في مختلف العمليات الفسيولوجية / التمثيل الغذائي كميات وغيرها من تفاصيل البروتوكول. وأظهرت الاكتشافات السابقة أن آثار رني يمكن أن تنتقل إلى الأجيال اللاحقة وراء جيل F1 في C. ايليجانس 15. وهناك أقلية من فقس اليرقات D. المبقعة مع العيوب تجزئة بسبب رني يمكن البقاء على قيد الحياة حتى سن البلوغ، ويمكن أن تتكاثر. فشلت التجارب الأولية للكشف عن عيوب واضحة في الجيل F2. الدراسات المستقبلية قد تكشف عن الآثار عبر الأجيال رني في هذا النوع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dermestes maculatus live beetles Our lab or Carolina Biological Supply #144168 Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out
Wet cat food Fancy Feast Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores
Dry dog food Purina Puppy Chow Can buy at most pet food and grocery stores
Insect cage (size medium, 30.5 x 19 x 20.3 cm) Exo Terra PT2260 For colony maintenance. Can use larger cage if needed
Insect cage (size mini, 17.8 x 10.2 x 12.7 cm) Exo Terra PT2250 For embryo collection
Petri dish VWR 89038-968
Cotton ball Fisher 22-456-883
Megascript T7 transcription kit Fisher AM1334 For 40 reactions
Pneumatic pump WPI PV830
Capillary holder WPI
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
Black filter paper (90 mm) VWR 28342-010
Food coloring (green) McCormick
Borosilicate glass capillary Hilgenberg 1406119
Needle puller (micropipette puller) Sutter Instrument Co. P-97
Microscope glass slide WorldWide Life Sciences Division 41351157
Sealing film (Parafilm M) Fisher 13-374-12
Model 801 Syringe (10 µl) Hamilton 7642-01
Needle (32-gauge)  Hamilton 7762-05
Fixation Solution (Pampel's) BioQuip Products, Inc. 1184C Toxic, needs to be handled in fume hood
Forcep (DUMONT #5) Fine Science Tools 11252-30
Cover slip (24 x 50 mm, No. 1.5) Globe Scientific 1415-15
Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip Fisher E5242956003
Dissecting microscopy for embryo injection Leica M420
Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization Zeiss SteREO Discover. V12
DIC microscopy Zeiss AXIO Imager. M1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Wianny, F., Zernicka-Goetz, M. Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development. Nat Cell Biol. 2, 70-75 (2000).
  3. Svoboda, P., Stein, P., Hayashi, H., Schultz, R. M. Selective reduction of dormant maternal mRNAs in mouse oocytes by RNA interference. Development. 127, 4147-4156 (2000).
  4. Zimmermann, T. S., et al. RNAi-mediated gene silencing in non-human primates. Nature. 441, 111-114 (2006).
  5. Kennerdell, J. R., Carthew, R. W. Use of dsRNA-mediated genetic interference to demonstrate that frizzled and frizzled 2 act in the wingless pathway. Cell. 95, 1017-1026 (1998).
  6. Cogoni, C., et al. Transgene silencing of the al-1 gene in vegetative cells of Neurospora is mediated by a cytoplasmic effector and does not depend on DNA-DNA interactions or DNA methylation. EMBO J. 15, 3153-3163 (1996).
  7. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2, 279-289 (1990).
  8. van Roessel, P., Brand, A. H. Spreading silence with Sid. Genome Biol. 5, 208 (2004).
  9. Grishok, A. RNAi mechanisms in Caenorhabditis elegans. FEBS Lett. 579, 5932-5939 (2005).
  10. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annu Rev Genet. 41, 305-330 (2007).
  11. Hannon, G. J. RNA interference. Nature. 418, 244-251 (2002).
  12. Hammond, S. M., Caudy, A. A., Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nat Rev Genet. 2, 110-119 (2001).
  13. Dorsett, Y., Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 3, 318-329 (2004).
  14. Agrawal, N., et al. RNA interference: biology, mechanism, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 67, 657-685 (2003).
  15. Grishok, A., Tabara, H., Mello, C. C. Genetic requirements for inheritance of RNAi in C. elegans. Science. 287, 2494-2497 (2000).
  16. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr Biol. 12, 85-86 (2002).
  17. Timmons, L., Fire, A. Specific interference by ingested dsRNA. Nature. 395, 854 (1998).
  18. Turner, C. T., et al. RNA interference in the light brown apple moth, Epiphyas postvittana (Walker) induced by double-stranded RNA feeding. Insect Mol Biol. 15, 383-391 (2006).
  19. Tabara, H., Grishok, A., Mello, C. C. RNAi in C. elegans: soaking in the genome sequence. Science. 282, 430-431 (1998).
  20. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34, 729-741 (2002).
  21. Travanty, E. A., et al. Using RNA interference to develop dengue virus resistance in genetically modified Aedes aegypti. Insect Biochem Mol Biol. 34, 607-613 (2004).
  22. Whitten, M. M., et al. Symbiont-mediated RNA interference in insects. Proc Biol Sci. 283, (2016).
  23. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat Commun. 6, 7822 (2015).
  24. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  25. Ulrich, J., et al. Large scale RNAi screen in Tribolium reveals novel target genes for pest control and the proteasome as prime target. BMC Genomics. 16, 674 (2015).
  26. Choe, C. P., Miller, S. C., Brown, S. J. A pair-rule gene circuit defines segments sequentially in the short-germ insect Tribolium castaneum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 6560-6564 (2006).
  27. Angelini, D. R., Kaufman, T. C. Functional analyses in the hemipteran Oncopeltus fasciatus reveal conserved and derived aspects of appendage patterning in insects. Dev Biol. 271, 306-321 (2004).
  28. Lynch, J. A., Peel, A. D., Drechsler, A., Averof, M., Roth, S. EGF signaling and the origin of axial polarity among the insects. Curr Biol. 20, 1042-1047 (2010).
  29. Tenlen, J. R., McCaskill, S., Goldstein, B. RNA interference can be used to disrupt gene function in tardigrades. Dev Genes Evol. 223, 171-181 (2013).
  30. Quan, G. X., Kanda, T., Tamura, T. Induction of the white egg 3 mutant phenotype by injection of the double-stranded RNA of the silkworm white gene. Insect Mol Biol. 11, 217-222 (2002).
  31. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol Dev. 1, 11-15 (1999).
  32. Lynch, J. A., Brent, A. E., Leaf, D. S., Pultz, M. A., Desplan, C. Localized maternal orthodenticle patterns anterior and posterior in the long germ wasp Nasonia. Nature. 439, 728-732 (2006).
  33. Liu, P. Z., Kaufman, T. C. hunchback is required for suppression of abdominal identity, and for proper germband growth and segmentation in the intermediate germband insect Oncopeltus fasciatus. Development. 131, 1515-1527 (2004).
  34. Zhou, X., Wheeler, M. M., Oi, F. M., Scharf, M. E. RNA interference in the termite Reticulitermes flavipes through ingestion of double-stranded RNA. Insect Biochem Mol Biol. 38, 805-815 (2008).
  35. Ciudad, L., Piulachs, M. D., Bellés, X. Systemic RNAi of the cockroach vitellogenin receptor results in a phenotype similar to that of the Drosophila yolkless mutant. FEBS J. 273, 325-335 (2006).
  36. Mito, T., et al. Non-canonical functions of hunchback in segment patterning of the intermediate germ cricket Gryllus bimaculatus. Development. 132, 2069-2079 (2005).
  37. Yoon, K. S., et al. Brief exposures of human body lice to sublethal amounts of ivermectin over-transcribes detoxification genes involved in tolerance. Insect Mol Biol. 20, 687-699 (2011).
  38. Rosenberg, M. I., Brent, A. E., Payre, F., Desplan, C. Dual mode of embryonic development is highlighted by expression and function of Nasonia pair-rule genes. Elife. 3, 01440 (2014).
  39. Hasselmann, M., et al. Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees. Nature. 454, 519-522 (2008).
  40. Shukla, J. N., Palli, S. R. Sex determination in beetles: production of all male progeny by parental RNAi knockdown of transformer. Sci Rep. 2, 602 (2012).
  41. Arakane, Y., et al. The Tribolium chitin synthase genes TcCHS1 and TcCHS2 are specialized for synthesis of epidermal cuticle and midgut peritrophic matrix. Insect Mol Biol. 14, 453-463 (2005).
  42. Cruz, J., Mané-Padròs, D., Bellés, X., Martìn, D. Functions of the ecdysone receptor isoform-A in the hemimetabolous insect Blattella germanica revealed by systemic RNAi in vivo. Dev Biol. 297, 158-171 (2006).
  43. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Lett. 579, 4961-4965 (2005).
  44. Zhang, H., Li, H. C., Miao, X. X. Feasibility, limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect Sci. 20, 15-30 (2013).
  45. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  46. Price, D. R., Gatehouse, J. A. RNAi-mediated crop protection against insects. Trends Biotechnol. 26, 393-400 (2008).
  47. Paldi, N., et al. Effective gene silencing in a microsporidian parasite associated with honeybee (Apis mellifera) colony declines. Appl Environ Microbiol. 76, 5960-5964 (2010).
  48. Kanginakudru, S., et al. Targeting ie-1 gene by RNAi induces baculoviral resistance in lepidopteran cell lines and in transgenic silkworms. Insect Mol Biol. 16, 635-644 (2007).
  49. Magni, P. A., Voss, S. C., Testi, R., Borrini, M., Dadour, I. R. A Biological and Procedural Review of Forensically Significant Dermestes Species (Coleoptera: Dermestidae). J Med Entomol. 52, 755-769 (2015).
  50. Zanetti, N. I., Visciarelli, E. C., Centeno, N. D. The Effect of Temperature and Laboratory Rearing Conditions on the Development of Dermestes maculatus (Coleoptera: Dermestidae). J Forensic Sci. , (2015).
  51. Shaver, B., Kaufman, P. E. Common name: hide beetle. , Available from: http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/beetles/hide_beetle.htm (2009).
  52. Veer, V., Negi, B. K., Rao, K. M. Dermestid beetles and some other insect pests associated with stored silkworm cocoons in India, including a world list of dermestid species found attacking this commodity. Journal of Stored Products Research. 32, 69-89 (1996).
  53. Xiang, J., Forrest, I. S., Pick, L. Dermestes maculatus: an intermediate-germ beetle model system for evo-devo. Evodevo. 6, 32 (2015).
  54. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Oviposition of Dermestes maculatus DeGeer, the hide beetle, as affected by biological and environmental conditions. Journal of Stored Products Research. 64, 154-159 (2015).
  55. Heffer, A., Grubbs, N., Mahaffey, J., Pick, L. The evolving role of the orphan nuclear receptor ftz-f1, a pair-rule segmentation gene. Evol Dev. 15, 406-417 (2013).
  56. Heffer, A., Shultz, J. W., Pick, L. Surprising flexibility in a conserved Hox transcription factor over 550 million years of evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18040-18045 (2010).
  57. Wilson, M. J., Dearden, P. K. Pair-rule gene orthologues have unexpected maternal roles in the honeybee (Apis mellifera). PLoS One. 7, 46490 (2012).
  58. Dawes, R., Dawson, I., Falciani, F., Tear, G., Akam, M. Dax, a locust Hox gene related to fushi-tarazu but showing no pair-rule expression. Development. 120, 1561-1572 (1994).
  59. Erezyilmaz, D. F., Kelstrup, H. C., Riddiford, L. M. The nuclear receptor E75A has a novel pair-rule-like function in patterning the milkweed bug, Oncopeltus fasciatus. Dev Biol. 334, 300-310 (2009).
  60. Stuart, J. J., Brown, S. J., Beeman, R. W., Denell, R. E. A deficiency of the homeotic complex of the beetle Tribolium. Nature. 350, 72-74 (1991).
  61. Aranda, M., Marques-Souza, H., Bayer, T., Tautz, D. The role of the segmentation gene hairy in Tribolium. Dev Genes Evol. 218, 465-477 (2008).
  62. Mito, T., et al. even-skipped has gap-like, pair-rule-like, and segmental functions in the cricket Gryllus bimaculatus, a basal, intermediate germ insect (Orthoptera). Dev Biol. 303, 202-213 (2007).
  63. Patel, N. H., Ball, E. E., Goodman, C. S. Changing role of even-skipped during the evolution of insect pattern formation. Nature. 357, 339-342 (1992).
  64. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E. Mutations affecting segment number and polarity in Drosophila. Nature. 287, 795-801 (1980).
  65. Jürgens, G., Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. II. Zygotic loci on the third chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 283-295 (1984).
  66. Wakimoto, B. T., Kaufman, T. C. Analysis of larval segmentation in lethal genotypes associated with the Aantennapedia gene complex in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 81, 51-64 (1981).
  67. Yu, Y., et al. The nuclear hormone receptor Ftz-F1 is a cofactor for the Drosophila homeodomain protein Ftz. Nature. 385, 552-555 (1997).
  68. Nüsslein-Volhard, C., Wieschaus, E., Kluding, H. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. I.Zygotic loci on the second chromosome. Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 267-282 (1984).
  69. Wieschaus, E., Nüsslein-Volhard, C., Jürgens, G. Mutations affecting the pattern of the larval cuticle in Drosophila melanogaster. III.Zygotic loci on the X-chromosome and fourth chromosome. 'Wilhelm Roux's archives of developmental biology. 193, 296-307 (1984).
  70. Guichet, A., et al. The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors. Nature. 385, 548-552 (1997).
  71. Fontenot, E. A., Arthur, F. H., Hartzer, K. L. Effect of diet and refugia on development of Dermestes maculatus DeGeer reared in a laboratory. J Pest Sci. 88, 113-119 (2014).
  72. Yang, Y., et al. Biodegradation and Mineralization of Polystyrene by Plastic-Eating Mealworms: Part 1. Chemical and Physical Characterization and Isotopic Tests. Environ Sci Technol. 49, 12080-12086 (2015).
  73. Kitzmann, P., Schwirz, J., Schmitt-Engel, C., Bucher, G. RNAi phenotypes are influenced by the genetic background of the injected strain. BMC Genomics. 14, 5 (2013).
  74. Chandler, C. H., Chari, S., Tack, D., Dworkin, I. Causes and consequences of genetic background effects illuminated by integrative genomic analysis. Genetics. 196, 1321-1336 (2014).
  75. Montagutelli, X. Effect of the genetic background on the phenotype of mouse mutations. J Am Soc Nephrol. 11, Suppl 16 101-105 (2000).
  76. Doetschman, T. Influence of genetic background on genetically engineered mouse phenotypes. Methods Mol Biol. 530, 423-433 (2009).

Tags

علم الوراثة، العدد 118، رني، ضربة قاضية الجينات، الحشرة، الخنفساء،
تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل،<em&gt; Dermestes المبقعة</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiang, J., Reding, K., Pick, L.… More

Xiang, J., Reding, K., Pick, L. Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus. J. Vis. Exp. (118), e54976, doi:10.3791/54976 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter